Quantificando parâmetros espáteris de exocitose celular em células micropatteradas

Resumo

A imagem viva da excitose lisosômica em células micropatteradas permite uma quantificação espacial desse processo. A normalização da morfologia usando micropatterns é uma excelente ferramenta para descobrir regras gerais sobre a distribuição espacial dos processos celulares.

Resumo

Imagem ao vivo da pHluorin marcada como fator solúvel N-ethylmaleimida-fator anexo Proteína de apego REceptor (v-SNARE) Proteína de membrana associada à vesícula 7 (VAMP7) por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) é uma maneira simples de explorar a secreção do compartimento lysosomal. Aproveitando a cultura celular em superfícies micropatteradas para normalizar a forma celular, uma variedade de ferramentas estatísticas foram empregadas para realizar uma análise espacial de padrões secretos. Usando a função K de Ripley e um teste estatístico baseado na distância do vizinho mais próximo (NND), confirmamos que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório, mas mostra agrupamento significativo. Note-se que nossa análise revelou que os eventos de exocitose também estão agrupados em áreas de não adesão, indicando que as moléculas de adesão não são as únicas estruturas que podem induzir pontos quentes secretos na membrana plasmática. Ainda assim, descobrimos que a adesão celular aumenta o agrupamento. Além das áreas adesivas e não adesivas precisamente definidas, a geometria circular desses micropatterns permite o uso de coordenadas polares, simplificando as análises. Utilizamos a Estimativa de Densidade do Kernel (KDE) e a função de distribuição cumulativa em coordenadas polares de eventos de exocitose para identificar áreas enriquecidas de exocitose. Em células de micropattern em forma de anel, o agrupamento ocorreu na borda entre as áreas adesivas e não adesivas. Nossa análise ilustra como ferramentas estatísticas podem ser empregadas para investigar distribuições espaciais de diversos processos biológicos.

Introdução

Exocitose é um processo celular universal no qual uma vesícula se funde com a membrana plasmática e libera seu conteúdo. A vesícula pode se fundir totalmente com a membrana plasmática (fusão total) ou criar um poro de fusão que permanece aberto durante um tempo limitado (beijo-e-corrida)¹. Por exemplo, proteínas recém-sintetizadas são liberadas no meio extracelular a partir de vesículas provenientes do complexo golgi. Este caminho biossintético, anterograde é primordial, especialmente em organismos multicelulares, para segregar peptídeos de sinalização (por exemplo, hormônios, neurotransmissores) e componentes de matriz extracelular (por exemplo, colágeno), bem como para traficar proteínas transmembranas para a membrana plasmática. Além disso, secreções podem ocorrer a partir de diferentes endossóis: 1) reciclagem de endósmosos a fim de reutilizar proteínas transmembranas; 2) corpos multivesiculares (MVBs) para liberação de exosóis; e 3) lysososomes para a liberação de enzimas proteolíticas. A secreção endossomal tem se mostrado importante para o crescimento de neurite, formação de pseudopodia, reparação da membrana plasmática e sinalização dependente de ATP².

Para estudar a exocitese no nível de célula única, várias técnicas foram empregadas. Patch-clamp permite a detecção de eventos de exocitose única com uma alta resolução temporal em uma grande variedade de células vivas³. No entanto, este método não fornece informações sobre a localização de eventos de exocistose, nem de qual compartimento ocorre. A microscopia eletrônica permite a visualização direta de eventos exocióticos com alta resolução espacial, e em combinação com o imunolabeling fornece informações sobre a especificidade dos compartimentos e moléculas envolvidas. Uma desvantagem dessa abordagem é a falta de informação sobre a dinâmica do processo, bem como sua incapacidade de realizar estudos de alto rendimento. A microscopia leve, como a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM), que explora o campo evanescente para iluminar fluoroforos nas proximidades do deslizamento de cobertura (100 nm), proporciona boa resolução temporal e espacial para estudar eventos de exocistose. No entanto, este método só é compatível com células aderentes e só pode ser aplicado na parte ventral/inferior das células.

Note-se que a membrana plasmática revela heterogeneidade significativa baseada em complexos adesivos que estão presentes apenas em áreas restritas. Essa heterogeneidade restringe, por exemplo, a absorção de diferentes ligantes⁴. Da mesma forma, foi recentemente relatado que a secreção do complexo golgi está concentrada em "pontos quentes" na membrana plasmática⁵. Além disso, sabe-se que certas cargas são secretadas através da exocistose focal associada à adesão⁶. Assim, deve-se prestar atenção especial à questão de saber se os eventos de exocitose são distribuídos aleatoriamente no espaço, ou se estão concentrados em áreas específicas da membrana plasmática. Várias ferramentas estatísticas baseadas na função K de Ripley foram propostas para explorar essas questões^7,,8,,9. Nossa abordagem combina essas ferramentas com micropatterning para controlar a forma celular e heterogeneidade da membrana plasmática. Além de fornecer um meio de distinguir entre áreas adesivas e não adesivas, essa técnica também permite a comparação entre diferentes células e condições e aumenta o poder das análises estatísticas.

Aqui utilizamos uma variedade de ferramentas estatísticas para estudar a distribuição espacial de eventos de excitose a partir do compartimento lisosômico monitorado por imagens de células vivas TIRFM de VAMP7-pHLuorin em células hTert-RPE1 em forma de anel. Foi confirmado que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório^8,,9 e que eventos de exocitose exibem agrupamento. Note-se que os eventos de exocitose também estão agrupados em áreas não adesivas, indicando que as moléculas de adesão não são as únicas estruturas que podem induzir pontos quentes secretos na membrana plasmática. No entanto, a adesão celular melhorou o agrupamento. Consistentemente, nossa análise identificou áreas enriquecidas de exocitose que estavam localizadas na fronteira entre as áreas adesivas e não adesivas.

Protocolo

1. Preparação de células micropatteradas

1. Transfecção de células
   1. Um dia antes da transfecção, as células semente 2,5 x 10⁶ hTERT-RPE1 em um poço de uma placa de 12 poços (2 x 2 cm) em 1 mL de média.
   2. No dia da transfecção, prepare a mistura de transfecção com plasmídeo vamp7-pHluorin (100 μL de tampão, 0,8 μg de DNA, 3 μL de mistura de transfecção). Incubar por 10 minutos.
      NOTA: VAMP7 é um v-SNARE lysosômico, fundido com uma tag pHluorin luminal. A sonda pHluorin é saciada por pH baixo, mas durante os prótons de exocitose são liberados e pHluorin começa a emitir um sinal^10,11.
   3. Adicione a mistura de transfecção às células em seu meio.
   4. Mude o meio 4h depois de adicionar a mistura de transfecção nas células.
   5. Use as células para experimentos durante as próximas 24-48 h.
2. Preparação de micropatteria (método de fotolitografia)
   1. Lave as tampas (25 mm de diâmetro) no etanol e deixe-as secas por 5 minutos.
   2. Ative as tampas por iluminação sob UV profundo por 5 minutos.
   3. Crie uma câmara úmida umidificando completamente uma toalha de papel na qual um filme de parafina é colocado. Adicione gotas (30 μL para cobertura de 22 mm) da solução Poly-L-Lysine-graft-Polyethylene Glycol (PLL-g-PEG) (0,1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH = 7,4) e coloque tampas com a superfície ativada sobre eles. Feche a câmara úmida com uma tampa superior e incubar tampas por 1h.
   4. Lavar tampas 2x em PBS e 1x em água destilada e deixá-los secar.
   5. Lave a máscara de quartzo com água destilada e depois com etanol ou propanol. Seque a máscara com fluxo de ar filtrado.
      NOTA: O fotomasmak de quartzo é revestido de um lado com cromo antirreflexo que contém furos na forma de micropatterns. Uma máscara fotográfica contendo micropatters em forma de anel de 37 μm é usada neste protocolo. Quando o UV profundo é iluminado na máscara fotográfica, a luz só pode passar por esses buracos¹².
   6. Exponha a máscara (lado revestido de cromado) a UV profundo por 5 minutos para limpar a superfície.
   7. Adicione pequenas gotas de água (10 μL para um deslizamento de cobertura de 20 mm) no lado cromado da máscara fotográfica. Coloque o deslizamento de cobertura com seu lado tratado de PLL-g-PEG na queda e seque a água extra. Certifique-se de que não se formem bolhas de ar entre a máscara e as tampas.
      NOTA: A força capilar da água imobilizará as tampas.
   8. Exponha a máscara fotográfica a UV profundo por 5 minutos com o lado não cromado para cima (as tampas são anexadas na superfície inferior).
      NOTA: A luz só pode passar pelos orifícios e modificar a superfície tratada com PLL-g-PEG de manchas abaixo da máscara fotográfica.
   9. Remova as tampas da máscara fotográfica adicionando água em excesso.
      NOTA: As manchas devem flutuar rapidamente.
   10. Incubar as tampas em uma solução de proteínas de matriz extracelular (50 μg/mL de fibronectina, 5 μg/mL de fibrinog fluorescente diluído em água) em filme de parafina em uma câmara úmida (como na etapa 1.2.3) por 1 h sob um capô de fluxo laminar para evitar contaminação.
       NOTA: O experimento pode ser pausado neste momento armazenando as tampas em PBS a 4 °C.
3. Semeadura celular em superfícies micropatteradas
   1. Use um suporte de deslizamento magnético que se encaixe no tamanho das tampas micropatteradas para montar as tampas. No dia da aquisição, aqueça o suporte de deslizamento de tampas a 37 °C para evitar choque térmico para as células durante as etapas subsequentes.
   2. Prepare o meio padrão suplementando o meio DMEM/F12 com HEPES de 20 mM e 2% de penicilina/estreptomicina.
   3. Coloque as tampas no suporte com o lado micropatterado para cima e adicione o meio de padrão assim que a mancha estiver na base do suporte. Adicione o selo e imobilize com o dispositivo magnético. Encha o suporte do deslizamento com o meio de padrão e feche-o com a tampa de vidro.
      NOTA: Seja rápido, para não permitir que a tampa seque. Não lave o suporte de tampa com etanol entre os experimentos, pois o selo pode reter um pouco de etanol, que pode reagir com PLL-g-PEG e resultar em estresse celular. Lave o suporte do deslizamento apenas com água com sabão. Além disso, a articulação pode ser incubada no meio padrão a 37 °C por 1 h para diluir o produto residual.
   4. Colete células hTERT-RPE1 transfectadas por trippsinização (0,5 mL para uma placa de 12 poços) e adicione 1 mL de 10% de meio FBS DMEM/F12.
   5. Adicione 0,5 x 10⁶ células hTERT-RPE1 transfecidas ao suporte do deslizamento de tampas e o recue. Incubar por 10 minutos na incubadora.
   6. Lave o suporte de tampa 5x com meio padrão para remover células não-naturais e FBS residuais adicionando o meio padrão com uma pipeta e aspirando o meio com outra pipeta para criar um fluxo de lavagem. Mantenha sempre um pequeno volume de padrão médio no suporte de deslizamento de tampa para evitar a secagem das células na tampa micropatterada, o que levará à morte celular.
   7. Incubar na incubadora por 3h para permitir a propagação completa das células.

2. Aquisição de dados de exocitose

1. Imagens de eventos de exocitose
   1. Coloque o suporte de deslizamento de tampas sob um TIRM. O sinal deve ser detectado por uma câmera sensível configurada com o melhor formato de imagem disponível.
      NOTA: Neste experimento, um objetivo de lente de 100x e uma câmera EMCCD com região de detecção de 512 x 512 pixels foi usado dando origem a um tamanho de pixel de 160 nm.
   2. Procure por uma célula expressando VAMP7-pHluorin que está totalmente espalhada(Figura 1A).
      NOTA: As células que expressam VAMP7 são claramente identificáveis, porque exibem um sinal verde.
   3. Altere o ângulo do laser até que um ângulo TIRF que permita a visualização dos eventos de exocitose VAMP7-pHluorin seja alcançado. Realize uma aquisição de 5 min em uma frequência compatível com a taxa de exocitose e escala de tempo (tipicamente 3 Hz, Figura 1D) usando o software de microscópio.
      NOTA: as células hTERT-RPE1 têm uma taxa de sigilo lysomal de cerca de 0,3 Hz em micropatterns. Exoctose lysosômica tem uma duração típica de 1 s. Caracteriza-se por uma intensidade máxima seguida de uma decadência exponencial. A difusão da sonda deve ser evidente neste momento(Figura 1B, C).
   4. Para cada célula, também realize uma aquisição do micropattern utilizando o software de microscópio (Figura 1A).
2. Aquisição de coordenadas de exócitose
   1. Abra o filme adquirido com ImageJ/FIJI. Usar arquivo | Importação | Sequência de imagem. Encontre eventos de exocistose de olho. Um evento de exocistose é caracterizado pelo aparecimento de um sinal brilhante que se espalha para fora(Figura 1).
   2. Use a ferramenta de ponto para marcar o centro do evento exociótico. Use Analyze | Medida para medir as coordenadas X e Y, bem como a coordenada temporal (número de fatia). Realize estas medidas para todos os eventos de exocistose do filme.
   3. Salvar os resultados (Resultados | Arquivo | Salve Como). Prepare um arquivo de texto para cada célula analisada chamada "Resultados(cell_name).txt" que contém a fatia, coordenadas X e coordenadas Y para todos os eventos de exocistose nessa ordem.
      
      O arquivo de texto deve ser assim:
      Raio de diâmetro de ID X Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      NOTA: Tenha cuidado para substituir todas as círgulas por pontos.
   4. Meça o centro e o diâmetro de cada célula usando a "Ferramenta Oval". Encaixe um círculo perfeito (não use um oval) e use "Medida" para obter as coordenadas X e Y e o diâmetro de Feret. Salve a identidade de cada célula (ID), as coordenadas X e Y, o diâmetro de Feret e o raio (diâmetro/2) em um arquivo de texto chamado "Parâmetro Esférico.txt".
      
      O arquivo de texto deve ser assim:
      Raio de diâmetro de ID X Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      NOTA: Tenha cuidado para substituir todas as círgulas por pontos.
   5. Meça a espessura do anel de micropattern (comprimento de adesão) com a ferramenta reta e salve o ID celular, o raio celular (do arquivo: "Parâmetro esférico.txt") e o comprimento de adesão em um arquivo de texto chamado "Padrão parâmetro.txt". Calcule o comprimento de adesão normalizado dividindo o comprimento de adesão por raio celular.
      NOTA: Tenha cuidado para substituir todas as comísas por pontos.
      
      O arquivo deve ficar assim:
      Comprimento de adesão do raio de célula iD Comprimento de adesão normalizado Comprimento de adesão
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826

3. Análise espacial unicelular

1. Pacote e instalação de R
   NOTA: O pacote R para esta análise aproveita o pacote Spatstat¹³ para calcular a densidade bidimensional (2D) e a função K de Ripley. O código é de código aberto e usa arquivos de texto que foram descritos anteriormente.
   1. Baixar e instalar R a partir de https://www.r-project.org/ (versão 3.5.2 foi utilizado nesta análise).
   2. Baixe o pacote (e o conjunto de dados de demonstração) de: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
   3. Instale o pacote no R Studio usando "Ferramentas" usando "Pacotes de instalação". Selecione "Arquivo de arquivo de pacote (.zip; .tar.gz)" para a categoria " Instalarde:" e escolha o arquivo do pacote. Pressione "Instalar".
   4. Carregue o pacote com a função "biblioteca ("ExocytosisSpatialAnalysis")" escrevendo este comando em estúdio R e pressionando "Enter".
   5. Execute o pacote com a função "ESA()" escrevendo este comando no estúdio R e pressionando "Enter".
      NOTA: Uma interface de usuário será aberta.
   6. Selecione o diretório para o conjunto de dados (arquivos.txt) e um diretório para plots de saída.
      NOTA: Os parâmetros da análise (ver texto abaixo) podem ser alterados através de uma interface de usuário.
   7. Este script iniciará e executará automaticamente a análise. Ele fornece arquivos .pdf de parcelas correspondentes e arquivos .txt contendo resultados numéricos.

Resultados

As características esposteis dos eventos de exocitose foram analisadas a partir de lysososomes visualizados por VAMP7-pHluorin^10,11 em células hTert-RPE1. as células hTert-RPE1 são células não transformadas que adotam bem a micropatterning e têm sido amplamente utilizadas em estudos anteriores baseados em micropattern^4,14. VAMP7 é um v-SNARE¹⁵ lisosômico que foi marcado co...

Discussão

Monitoramos eventos de exocitose do compartimento lisosômico por tirfm imagem celular viva de VAMP7-pHluorin em células normalizadas em forma de anel e realizamos uma análise estatística rigorosa dos parâmetros espaciais dos eventos de excitose. Empregando a função K da Ripley transformada e um teste estatístico baseado na distância mais próxima do vizinho, confirmamos que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório^8,,9. Ambas as análise...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetic Chamber	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen	Molecular Probes, Invitrogen	F35200
Fibronectin bovine plasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 cell line	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG solution	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV ozone oven	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid	n/a	n/a	Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.