마이크로 패턴 세포에서 세포 외세포증의 주당 측량 파라미터를 정량화

요약

미세 패턴 세포에 리소소피 외세포증의 라이브 이미징이 이 과정의 공간 적정화를 허용한다. 마이크로 패턴을 이용한 형태 학 정상화는 세포 프로세스의 공간 분포에 대한 일반적인 규칙을 발견하는 뛰어난 도구입니다.

초록

pHluorin 태그 용불성 N-ethylmalimide-민감한 인자 부착 단백질 REceptor (v-SNARE) 총 내부 반사 형광 현미경 검사법 (TIRFM)에 의해 소포 관련 멤브레인 단백질 7 (VAMP7)의 라이브 이미징은 리소말 구획에서 분비를 탐구하는 간단한 방법입니다. 마이크로패턴 표면에서 세포 배양을 활용하여 세포 형상을 정상화하기 위해 다양한 통계 도구를 사용하여 분비 패턴의 공간 분석을 수행했습니다. 리플리의 K 기능과 가장 가까운 이웃 거리(NND)를 기반으로 한 통계 테스트를 사용하여 리소좀의 분비가 무작위 과정이 아니라 상당한 클러스터링을 나타낸다는 것을 확인했습니다. 참고로, 우리의 분석은 외세포증 사건이 또한 미적혈 부위에 클러스터된다는 것을 밝혔습니다, 접착 분자가 플라즈마 막에 분비 핫스팟을 유도할 수 있는 유일한 구조물이 아니라는 것을 표시하. 그럼에도 불구하고 세포 접착력이 클러스터링을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 정확하게 정의된 접착제 및 미적 영역 외에도 이러한 미세 패턴의 원형 형상을 사용하면 극좌표를 사용하여 해석을 단순화할 수 있습니다. 엑소세포증 의 극성 좌표에 커널 밀도 추정(KDE)과 누적 분포 기능을 사용하여 외세포증의 농축 영역을 식별했습니다. 링 모양의 마이크로패턴 세포에서 접착제와 무나정 영역 사이의 경계에서 클러스터링이 발생했습니다. 우리의 분석은 다양한 생물학적 과정의 공간 분포를 조사하기 위해 통계 도구를 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

서문

외세포증은 소포가 플라즈마 멤브레인과 융합되어 그 함량을 방출하는 보편적 인 세포 과정입니다. 소포는 플라즈마 멤브레인 (전체 융합)과 완전히 융합하거나 제한된 시간 동안 열려있는 융합 모공을 만들 수 있습니다 (키스 앤 런)^1. 예를 들면, 새로 합성된 단백질은 골지 복합체에서 온 소포에서 세포외 배지로 풀어 놓입니다. 이 생합성, 전방 급료 경로는 원시, 특히 다세포 유기체에서 신호 펩티드 (예를 들어, 호르몬, 신경 전달 물질) 및 세포 외 매트릭스 구성 요소 (예를 들어, 콜라겐)를 분비뿐만 아니라 플라즈마 막에 대막 단백질을 트래픽. 추가적으로, 분비물은 다른 내분모에서 생길 수 있습니다: 1) 막 단백질을 재사용하기 위하여 내모를 재활용; 2) 다중 혈관 몸 (MVBs) 엑소좀을 방출; 및 3) 프로테오리틱 효소의 방출을 위한 리소좀. 내뇌 분비는 중성염 아웃성장, 의사포디아 형성, 혈장 막 수리 및 ATP 의존신호^2에중요한 것으로 나타났다.

단일 세포 수준에서 외세포증을 연구하기 위해 여러 가지 기술이 사용되었습니다. 패치 클램프는 다양한 살아있는 세포^3에서높은 시간적 해상도로 단일 외세포증 이벤트를 검출할 수 있게 한다. 그러나 이 방법은 외세포증 이벤트의 국소화에 대한 정보도, 어떤 구획이 발생하는지에 대한 정보를 제공하지 않는다. 전자 현미경 검사는 높은 공간 해상도를 가진 외세포 사건의 직접 시각화를 허용하고, 면역 라벨링과 함께 관련된 구획 및 분자의 특이성에 대한 정보를 제공합니다. 이 방법의 단점은 프로세스의 역학에 대한 정보의 부족뿐만 아니라 높은 처리량 연구를 수행 할 수 없다는 것입니다. 커버슬립(100nm) 부근에서 형광을 비추기 위해 에반에센드 필드를 이도하는 총 내부 반사 형광 현미경 검사법(TIRFM)과 같은 경현미경접근법은 외세포증 사건을 연구하기 위한 좋은 시간적 및 공간 적 해상도를 제공한다. 그러나 이 방법은 부착 된 세포와만 호환되며 세포의 복부 / 열등한 부분에만 적용 할 수 있습니다.

참고로, 플라즈마 멤브레인은 제한된 영역에만 존재하는 접착제 복합체를 기반으로 상당한 이질성을 드러냅니다. 이 이질성은 예를 들어, 다른 리간드^4의섭취를 제한합니다. 유사하게, 최근에는 골기 복합체로부터의 분비가 혈장 막^5의"핫스팟"에 집중되어 있는 것으로 보고되고 있다. 더욱이, 특정 화물은 초점 접착 관련 엑소시토시스^6을통해 분비되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 외세포증 이벤트가 공간에 무작위로 분포되는지, 아니면 혈장 막의 특정 부위에 집중되는지 여부에 대한 질문에 특별한 주의를 기울여야 한다. Ripley의 K 함수를 기반으로 한 여러 통계 도구는 이러한 질문을 탐구하기 위해 제안되었습니다^7,,8,,9. 우리의 접근은 세포 모양 및 플라즈마 막 이질성을 통제하기 위하여 마이크로패터닝과 이 공구를 결합합니다. 접착제와 미적 영역을 구별하는 수단을 제공하는 것 외에도 이 기술은 다른 세포및 조건에 걸쳐 비교할 수 있으며 통계 분석의 힘을 증가시킵니다.

여기서는 TIRFM 라이브 셀 이미징이 모니터링하는 리소냐구획으로부터의 외세포증 이벤트의 공간 분포를 링 모양의 마이크로패턴-정규화 hTert-RPE1 세포에서 연구하기 위해 다양한 통계 도구를 사용합니다. 리소좀으로부터의 분비액은 무작위 과정이^아님을확인하였고,^{,외세포증} 이벤트는 클러스터링을 나타낸다. 참고로, 우리는 외세포증 사건이 또한 미각 부위에 클러스터되어 있다는 것을 것을을 발견했습니다, 접착 분자가 플라즈마 막에 분비 핫스팟을 유도할 수 있는 유일한 구조물이 아니라는 것을 표시하. 그럼에도 불구하고 세포 접착력은 클러스터링을 향상시켰습니다. 일관되게, 우리의 분석은 접착제와 nonadhesive 지역 사이 국경에 있는 외세포증의 풍부한 지역을 확인했습니다.

프로토콜

1. 마이크로 패턴 세포의 준비

1. 세포의 전환
   1. 1일 전, 종자 2.5 x 10⁶ hTERT-RPE1 세포를 12웰 플레이트(2 x 2cm)의 1mL배지로 1개의 우물로 넣습니다.
   2. 경질 당일, VAMP7-pHluorin 플라스미드(완충제 100μL, DNA 0.8 μg, 3 μL 의 트랜스페션 혼합물)로 트랜스페션 혼합물을 준비한다. 10 분 동안 인큐베이션하십시오.
      참고: VAMP7은 리소좀 v-SNARE로, 발광 플루오린 태그와 융합되어 있습니다. pHluorin 프로브는 낮은 pH에 의해 담금질되지만, 엑소시토시스 양성자가 방출되고 pHluorin신호^10,,11을방출하기 시작한다.
   3. 배지의 세포에 회입 믹스를 추가합니다.
   4. 세포에 형질 전환 믹스를 추가한 후 중간 체질의 4h를 변경합니다.
   5. 다음 24-48 시간 동안 실험을 위해 세포를 사용합니다.
2. 마이크로 패턴 제제(포토리소그래피 방법)
   1. 에탄올로 커버립립(직경 25mm)을 씻고 5분 동안 건조시키세요.
   2. 딥 UV 에서 5 분 동안 조명으로 커버립을 활성화합니다.
   3. 파라핀 필름이 배치되는 종이 타월을 철저히 가습하여 습한 챔버를 만듭니다. 폴리 L-리신-이식편-폴리에틸렌 글리콜(PLL-g-PEG) 용액(0.1 mg/mL, 10mMM HEPES, pH = 7.4)의 방울(22mm 커버슬립용 30μL)을 추가하고, 그 위에 활성화된 표면이 있는 커버립을 배치한다. 위쪽으로 습한 챔버를 닫고 커버립을 1시간 동안 배양합니다.
   4. 세척은 PBS에서 2배, 증류수1배는 건조하게 합니다.
   5. 석영 포토마스크를 증류수로 씻은 다음 에탄올 또는 프로파놀로 씻으시다. 여과된 공기 흐름으로 포토마스크를 말리십시오.
      참고 : 석영 포토 마스크는 마이크로 패턴의 형태로 구멍을 포함하는 반사 방지 크롬과 함께 한쪽에 코팅됩니다. 이 프로토콜에는 37 μm의 고리 모양의 미세 패턴을 포함하는 포토마스크가 사용됩니다. 포토마스크에 딥 UV가 비추면 빛은^12번홀을 통과할 수 있습니다.
   6. 포토마스크(크롬 코팅 면)를 딥 UV에 5분 간 노출하여 표면을 청소합니다.
   7. 포토마스크의 크롬 코팅 측에 작은 물 방울(20mm 커버슬립용 10μL)을 추가합니다. 커버슬립을 PLL-g-PEG 처리 측으로 드롭에 놓고 여분의 물을 건조시다. 마스크와 커버립 사이에 기포가 형성되지 않았는지 확인합니다.
      참고: 물의 모세관 힘이 커버립을 고정합니다.
   8. 크롬 코팅이 아닌 면을 최대 5분 동안 딥 UV에 포토마스크를 노출합니다(커버립은 아래표면에 부착됨).
      참고: 빛은 구멍을 통과하고 포토마스크 아래에 있는 커버립의 PLL-g-PEG 처리 표면을 수정할 수 있습니다.
   9. 여분의 물을 추가하여 포토마스크에서 커버립을 제거합니다.
      참고: 커버립은 빠르게 떠서야 합니다.
   10. 오염을 피하기 위해 하습 챔버 (1.2.3 단계에서와 같이) 습한 챔버 (1.2.3 단계에서와 같이) 파라핀 필름에 세포 외 매트릭스 단백질 (섬유 네틴의 50 μg /mL, 물에 희석 형광 피브리노겐의 5 μg /mL)의 용액에서 커버립을 배양한다.
       참고: 실험은 4°C에서 PBS에 커버립을 저장하여 이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다.
3. 마이크로패턴 표면의 세포 시드
   1. 마이크로패턴 커버립의 크기에 맞는 마그네틱 커버슬립 홀더를 사용하여 커버립을 장착합니다. 획득 당일, 후속 단계 동안 셀에 대한 열 충격을 피하기 위해 커버슬립 홀더를 37°C로 가열합니다.
   2. 20mM HEPES와 페니실린/연쇄 절제술의 2%로 DMEM/F12 배지를 보충하여 패턴 매체를 준비합니다.
   3. 커버슬립이 홀더 베이스에 있는 즉시 마이크로패턴 면을 홀더에 놓고 패턴 매체를 추가합니다. 씰을 추가하고 자기 장치로 고정합니다. 커버슬립 홀더를 패턴 매체로 채우고 유리 뚜껑으로 닫습니다.
      참고: 빨리, 커버 슬립건조를 허용하지 않도록. 씰이 PLL-g-PEG와 반응하여 세포 스트레스를 초래할 수 있는 에탄올을 유지할 수 있기 때문에 실험 사이에 에탄올로 커버슬립 홀더를 세척하지 마십시오. 커버슬립 홀더를 비눗물로만 씻으시면 됩니다. 더욱이, 조인트는 잔류 제품을 희석하기 위해 1h에 대해 37°C의 패턴 배지에서 배양될 수 있다.
   4. 트립시화(12웰 플레이트의 경우 0.5mL)에 의해 감염된 hTERT-RPE1 세포를 수집하고 10% FBS DMEM/F12 배지의 1mL을 추가합니다.
   5. 커버슬립 홀더에 0.5 x 10⁶ 의 전염성 hTERT-RPE1 셀을 추가하고 다시 닫습니다. 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다.
   6. 커버슬립 홀더5x를 패턴 매체로 세척하여 부착되지 않은 세포와 잔류 FBS를 제거하여 패턴 매체를 하나의 파이펫으로 추가하고 다른 파이펫으로 매체를 흡입하여 세척 흐름을 만듭니다. 항상 커버슬립 홀더에 소량의 패턴 매체를 보관하여 세포 사멸로 이어질 미세 패턴 커버슬립에 있는 세포의 건조를 피하십시오.
   7. 전체 세포 확산을 허용하기 위해 3 시간 동안 인큐베이터에서 인큐베이터에 인큐베이션하십시오.

2. 외세포증 데이터 수집

1. 외세포증 사건의 이미징
   1. TIRM 아래에 커버슬립 홀더를 놓습니다. 최고의 이미징 형식으로 설정된 민감한 카메라로 신호를 감지해야 합니다.
      참고: 이 실험에서는 100x 렌즈 목표와 512 x 512 픽셀 감지 영역이 있는 EMCCD 카메라가 사용되어 픽셀 크기가 160nm에 상승했습니다.
   2. 완전히 퍼지는 VAMP7-pHluorin을 발현하는 셀을 검색합니다(그림1A).
      참고: VAMP7을 발현하는 세포는 녹색 신호를 나타내기 때문에 명확하게 식별할 수 있습니다.
   3. VAMP7-pHluorin 외세포증 이벤트의 시각화가 가능할 때까지 레이저의 각도를 변경합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 외세포 속도 및 시간 척도(일반적으로 3Hz, 도 1D)와호환되는 주파수에서 5분 획득을 수행합니다.
      참고: hTERT-RPE1 세포는 마이크로패턴에 약 0.3Hz의 리소피 분비율을 갖는다. 리소말 외세포증은 1s의 전형적인 지속 기간을 가지는. 그것은 기하급수적 인 부패 뒤에 피크 강도가 특징입니다. 프로브의 확산은 이 때 명백해야한다(도 1B, C).
   4. 각 세포에 대해, 또한 현미경소프트웨어(도 1A)를사용하여 마이크로패턴의 취득을 수행한다.
2. 외세포좌 의 취득
   1. ImageJ/FIJI로 획득한 영화를 엽니다. 파일 사용 | 가져오기 | 이미지 시퀀스. 눈으로 외세포증 이벤트를 찾을 수 있습니다. 외세포증 이벤트는 바깥쪽으로 퍼지는 밝은 신호의 출현을 특징으로한다(도 1).
   2. 포인트 도구를 사용하여 외식 이벤트의 중심을 표시합니다. 분석 사용 | X 및 Y 좌표와 측두구 좌표(슬라이스 번호)를 측정합니다. 영화의 모든 외세포증 이벤트에 대해 이러한 측정을 수행합니다.
   3. 결과 저장(결과 | 파일 | Save As저장합니다.). 모든 외세포 이벤트에 대해 슬라이스, X 좌표 및 Y 좌표를 포함하는 "결과(cell_name).txt"라는 각 분석된 셀에 대해 텍스트 파일을 준비합니다.
      
      텍스트 파일은 다음과 같이 표시됩니다.
      ID X Y 페렛의 직경 반경
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      참고: 모든 쉼표를 포인트로 교체하십시오.
   4. "타원형 도구"를 사용하여 각 셀의 중심과 직경을측정합니다. 완벽한 원을 맞고 (타원형을 사용하지 않음) X 및 Y 좌표와 Feret의 직경을 얻기 위해"측정"을사용합니다. 각 셀의 ID(ID), X 및 Y 좌표, Feret의 지름 및 반지름(직경/2)을 "구형 매개 변수.txt"라는 텍스트 파일에 저장합니다.
      
      텍스트 파일은 다음과 같이 표시됩니다.
      ID X Y 페렛의 직경 반경
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      참고: 모든 쉼표를 포인트로 교체하십시오.
   5. 직선 공구로 마이크로패턴 링(접착 길이)의 두께를 측정하고 셀 ID, 셀 반경(파일에서 "구형 매개 변수.txt") 및 "패턴 매개 변수.txt"라는 텍스트 파일의 접착 길이를 저장합니다. 접착 길이를 셀 반경으로 나누어 정규화된 접착 길이를 계산합니다.
      참고: 모든 쉼표를 포인트별로 교체하십시오.
      
      파일은 다음과 같아야 합니다.
      ID 셀 반지름 접착 길이 정규화 접착 길이
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826

3. 단일 셀 공간 분석

1. R 패키지 및 설치
   참고: 이 분석을 위한 R 패키지는 Spatstat^{패키지(13)를} 활용하여 2차원(2D) 밀도및 리플리의 K 기능을 계산합니다. 코드는 오픈 소스이며 이전에 설명한 텍스트 파일을 사용합니다.
   1. https://www.r-project.org/ 다운로드 및 설치 R (버전 3.5.2이 분석에 사용되었습니다).
   2. 패키지(및 데모 데이터 집합)를 다운로드 https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper합니다.
   3. "패키지설치"를 사용하여 R 스튜디오에패키지를 설치합니다. "패키지아카이브 파일(.zip; .tar.gz)" 카테고리"설치:"를 선택하고 패키지 파일을 선택합니다. "설치"를누릅니다.
   4. ""엑소시토시스공간분석")"R 스튜디오에서 이 명령을 작성하고 "Enter"를 눌러 패키지를로드합니다.
   5. 함수"ESA()"R 스튜디오에서 이 명령을 작성하고 "Enter"를 눌러 패키지를실행합니다.
      참고: 사용자 인터페이스가 열립니다.
   6. 데이터 집합(.txt 파일)의 디렉터리와 출력 플롯의 디렉토리를 선택합니다.
      참고: 분석의 매개 변수(아래 텍스트 참조)는 사용자 인터페이스를 통해 변경할 수 있습니다.
   7. 이 스크립트는 자동으로 시작되어 분석을 수행합니다. 그것은 숫자 결과를 포함하는 해당 플롯 및 .txt 파일의 .pdf 파일을 제공합니다.

결과

외세포증 이벤트의 현면 특성은 hTert-RPE1 세포에서 VAMP7-pHluorin^10,,11에 의해 시각화된 리소좀으로부터 분석되었다. hTert-RPE1 세포는 마이크로패터닝에 잘 채택되고 이전 마이크로패턴 기반 연구에서 광범위하게 사용된 비변형^{세포4,,14이다.} VAMP7은 리소솜 v-SNARE^15로, N-terminus에서 슈퍼 이클립틱 p...

토론

우리는 반지 모양의 마이크로패턴 정규화 된 세포에서 VAMP7-pHluorin의 TIRFM 라이브 셀 이미징에 의해 리소소말 구획에서 외세포증 이벤트를 모니터링하고 외세포증 이벤트의 공간 매개 변수에 대한 엄격한 통계 분석을 수행했습니다. 변형된 리플리의 K 기능과 가장 가까운 이웃 거리에 따른 통계 시험을 통해 리소좀으로부터의 분비가 무작위 공정^8,,9가아...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetic Chamber	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen	Molecular Probes, Invitrogen	F35200
Fibronectin bovine plasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 cell line	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG solution	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV ozone oven	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid	n/a	n/a	Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.