定量微模式细胞细胞外细胞异细胞的时态参数

摘要

在微模型细胞上对细胞外细胞的活成像允许这个过程的空间定量。使用微模式进行形态学规范化是揭示细胞过程空间分布的一般规则的杰出工具。

摘要

通过总内部反射荧光显微镜（TIRFM）对pHluorin标记可溶性N-乙酰胺-敏感因子附件蛋白REceptor（V-SNARE）囊量相关膜蛋白7（VAMP7）进行实时成像，这是从溶酶体分泌物的一种简单方法。利用微模型表面的细胞培养来使细胞形状正常化，利用各种统计工具对分泌模式进行空间分析。使用 Ripley 的 K 函数和基于最近邻域距离 （NND） 的统计测试，我们确认来自裂酶体分泌不是随机过程，而是显示显著的聚类。值得注意的是，我们的分析显示，外细胞增多事件也聚集在非粘附区，表明粘附分子并不是能诱发血浆膜分泌热点的唯一结构。尽管如此，我们发现细胞粘附能增强聚类。除了精确定义的粘合剂和非粘性区域外，这些微模型的圆形几何形状允许使用极坐标，从而简化分析。我们使用内核密度估计（KDE）和外细胞病事件极坐标的累积分布函数来识别外细胞病的富集区。在环形微模式细胞中，聚类发生在粘合剂和非粘膜区域之间的边界。我们的分析说明了如何使用统计工具来调查不同生物过程的空间分布。

引言

外细胞增多是一种普遍的细胞过程，囊泡与血浆膜融合并释放其含量。囊泡可以完全与等离子膜（完全融合）融合，或创建一个融合孔，在有限的时间内保持开放（亲吻和运行^）1。例如，新合成的蛋白质从来自高尔吉复合物的囊泡释放到细胞外介质中。这种生物合成，反极通路是原始的，特别是在多细胞生物体，分泌信号肽（如激素，神经递质）和细胞外基质成分（如胶原蛋白），以及交通跨膜蛋白到血浆膜。此外，分泌物可能来自不同的内膜:1） 回收内膜，以重复使用跨膜蛋白;2） 多体体（MMB）释放外体;3） 用于释放蛋白糖解酶的糖体。内染色体分泌已被证明对神经土菌生长、伪波迪亚形成、血浆膜修复和ATP依赖信号²非常重要。

为了研究单细胞水平的外细胞病，已经采用了几种技术。贴片夹允许在各种活细胞3中检测具有高时分辨率的单一外细胞^病事件。但是，此方法不提供有关外细胞增多事件的定位信息，也不提供它发生的隔间的信息。电子显微镜允许以高空间分辨率直接可视化外细胞事件，并结合免疫标签提供有关所涉及的隔间和分子特异性的信息。这种方法的一个缺点是缺乏关于过程动态的信息，以及它无法进行高通量研究。光显微镜方法，如总内部反射荧光显微镜（TIRFM），利用消逝场照亮光泳在覆盖唇（100纳米）附近，为研究外细胞增多事件提供了良好的时间和空间分辨率。然而，这种方法只与粘附细胞兼容，只能应用于细胞的腹体/下同部分。

值得注意的是，等离子膜揭示了基于仅在限制区域存在的粘合复合物的显著异质性。这种异质性限制，例如，不同配体4的^吸收。同样，最近有报道说，从高尔吉综合体分泌物集中在等离子膜5的"热点^"。此外，众所周知，某些货物是通过焦粘附相关的外细胞增多6分^泌的。因此，应特别注意外细胞增多事件是否随机分布在空间中，或者是否集中在血浆膜的特定区域。根据里普利的K函数，提出了几个统计工具来探讨这些问题^{7，8，9。,97,}我们的方法将这些工具与微模式相结合，以控制细胞形状和等离子膜异质性。除了提供区分粘合剂和非粘性区域的方法外，该技术还允许对不同的细胞和条件进行比较，并增加统计分析的能力。

在这里，我们使用各种统计工具来研究由 TIRFM 活细胞成像 VAMP7-pHluorin 在环状微模式规范化 hTert-RPE1 细胞中监测的异细胞细胞学事件的空间分布。经证实，来自利索索姆的分泌物不是随机过程^8,8，9，外细胞增多事件表现出聚类。值得注意的是，我们发现外细胞增多事件也聚集在非粘附区域，表明粘附分子并不是能诱发血浆膜分泌热点的唯一结构。然而，细胞粘附确实增强了聚类。一致地，我们的分析确定了位于粘合剂和非粘剂区域之间的边界的外细胞增多区域。

研究方案

1. 微模式细胞的制备

1. 细胞的转染
   1. 转染前一天，种子2.5 x 10⁶ hTERT-RPE1细胞进入12井板（2 x 2厘米）的一个井在1 mL的介质。
   2. 在转染当天，用VAMP7-pHluorin质粒（100μL缓冲液，0.8μgDNA，3μL转染混合物）制备转染混合物。孵育10分钟。
      注: VAMP7 是一个 lysosomal v -SNARE， 与发光的 pHluorin 标签融合。pHluorin探针被低pH淬火，但在外细胞形成质子释放和pHluorin开始发出信号^{10，11。10,}
   3. 将转染混合物添加到其介质中的细胞中。
   4. 在细胞上添加转染混合物后，更改介质 4 小时。
   5. 在未来24~48小时内使用细胞进行实验。
2. 微模式制备（光刻法）
   1. 用乙醇清洗盖玻片（直径25毫米），让它们干燥5分钟。
   2. 在深紫外线下通过照明激活盖玻片 5 分钟。
   3. 通过彻底加湿放置石蜡薄膜的纸巾，创建一个潮湿的室。加入聚-L-莱辛-嫁接-聚乙烯乙二醇（PLL-g-PEG）溶液（0.1毫克/mL，10 mM HEPES，pH = 7.4）的滴（30 μL），并放置带激活表面的盖玻片。用顶部和孵化盖玻片关闭湿润室 1 小时。
   4. 在 PBS 中清洗盖玻片 2 倍，在蒸馏水中清洗 1 倍，让盖玻片干燥。
   5. 用蒸馏水清洗石英光掩，然后用乙醇或丙醇清洗。用过滤的气流擦干光面罩。
      注:石英光掩膜的一侧涂有反光镀铬，包含微表板形式的孔。该协议使用包含 37 μm 的环形形状微模式的光掩膜。当深紫外线照射在光掩贴上时，光线只能通过这些孔^12。
   6. 将光贴膜（镀铬侧）暴露在深紫外线下 5 分钟以清洁表面。
   7. 在光贴膜的镀铬侧添加小水滴（10 μL，用于 20 mm 盖玻片）。将盖玻片及其 PLL-g-PEG 处理的一侧放在水滴上，然后干燥多余的水。确保蒙版和盖玻片之间没有形成气泡。
      注:水的毛细管力将固定盖玻片。
   8. 将光罩暴露在深紫外线下 5 分钟，将非镀铬涂层的侧面向上照射（盖玻片附着在下表面）。
      注:光线只能通过孔，并修改光掩贴下方的盖玻片的 PLL-g-PEG 处理表面。
   9. 通过添加多余的水，从光贴上取下盖玻片。
      注:盖玻片应快速浮动。
   10. 在湿润室（如步骤1.2.3）的石蜡膜上孵育细胞外基质蛋白溶液中的盖玻片（纤维素50微克/mL，水中稀释的荧光纤维蛋白原5微克/mL），在层压流罩下孵育1小时，以避免污染。
       注:此时，通过将盖玻片存储在 PBS 中，实验可以暂停至 4 °C。
3. 微模式表面上的细胞播种
   1. 使用符合微板盖玻片尺寸的磁性盖玻片支架安装盖玻片。在采集当天，将盖玻片支架加热至37°C，以避免在后续步骤中对电池进行热冲击。
   2. 通过补充DMEM/F12介质与20 mM HEPES和2%的青霉素/链霉素来准备型基。
   3. 将盖玻片与微型图案的侧向上放置到支架中，并在盖玻片放在支架底座上时添加图案介质。添加密封件，用磁性装置固定。用图案介质填充盖玻片支架，然后用玻璃盖合上。
      注:快速，不要让盖玻片干燥。在实验之间不要用乙醇清洗盖玻片，因为密封可能会保留一些乙醇，这些乙醇会与PLL-g-PEG发生反应，并产生细胞应力。仅用肥皂水清洗盖玻片架。此外，该接头可以在37°C的型板介质中孵育1小时，以稀释残留产品。
   4. 通过三试（一个12井板0.5 mL）收集转染的hTERT-RPE1细胞，并加入1 mL的10%FBS DMEM/F12介质。
   5. 将 0.5 x 10⁶ 转染 hTERT-RPE1 细胞添加到盖玻片支架中，然后重新合合。在孵化器中孵育10分钟。
   6. 使用图案介质清洗盖玻片支架 5 倍，通过添加带一个移液器的图案介质和吸气介质以创建洗涤流，去除非连接细胞和残留 FBS。始终在盖玻片支架中保留少量图案介质，以避免微图案盖玻片上的细胞干燥，这将导致细胞死亡。
   7. 在培养箱中孵育3小时，允许全细胞扩散。

2. 获取外细胞增多数据

1. 外细胞增多症事件的成像
   1. 将盖玻片支架放在 TIRM 下。信号必须由设置最佳成像格式的敏感摄像机检测。
      注:在此实验中，使用了 100 倍镜头目标以及具有 512 x 512 像素检测区域的 EMCCD 摄像机，从而产生 160 nm 的像素大小。
   2. 搜索表示 VAMP7-pHluorin 完全传播的单元格（图1A）。
      注:表示VAMP7的细胞清晰可辨，因为它们表现出绿色信号。
   3. 改变激光的角度，直到达到允许VAMP7-pHluorin外细胞病事件可视化的TIRF角度。使用显微镜软件，以与外细胞形成率和时间刻度兼容的频率（通常为 3 Hz，图 1D）进行5 分钟的采集。
      注:hTERT-RPE1细胞在微模式上具有约0.3 Hz的卵素分泌率。Lysosomal外细胞症的典型持续时间为1 s。它的特点是峰值强度，然后是指数衰减。此时，探头的扩散应该很明显（图1B，C）。 C
   4. 对于每个细胞，还使用显微镜软件进行显微模式的采集（图1A）。
2. 获得外细胞增多坐标
   1. 使用 ImageJ/FIJI 打开获得的影片。使用文件|导入|图像序列。通过眼睛查找外细胞增多事件。外细胞增多事件的特点是出现向外传播的明亮信号（图1）。
   2. 使用点工具标记外细胞事件的中心。使用 分析 | 测量 X 和 Y 坐标以及时态坐标（切片编号）的度量。对影片的所有外细胞增多事件执行这些测量。
   3. 保存结果（结果 | 文件 | 另存为。为名为"结果（cell_name.txt"的每个分析单元格准备一个文本文件，其中包含按该顺序排列的所有外细胞病事件的切片、X 坐标和 Y 坐标。
      
      文本文件应看起来像:
      ID X Y 费雷特的直径半径
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      注:小心用点替换所有逗号。
   4. 使用"椭圆形工具"测量每个细胞的中心和直径。适合一个完美的圆（不要使用椭圆形），并使用"测量"获得X和Y坐标和Feret的直径。将每个单元格的标识 （ID）、X 和 Y 坐标、Feret 的直径和半径（直径/2）保存在名为"球形参数.txt"的文本文件中。
      
      文本文件应看起来像:
      ID X Y 费雷特的直径半径
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      注:小心用点替换所有逗号。
   5. 使用直工具测量微模式环的厚度（粘附长度），并在名为"Pattern 参数.txt"的文本文件中保存单元格 ID、单元格半径（来自文件:"球形参数.txt"）和粘附长度。通过将粘附长度除以细胞半径来计算归一化附着力长度。
      注:注意用点替换所有逗号。
      
      该文件应看起来像:
      ID 细胞半径附着力长度 归一化附着力长度
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826

3. 单细胞空间分析

1. R 包和安装
   注:此分析的 R 包利用 Spatstat 封装¹³ 计算二维 （2D） 密度和 Ripley 的 K 函数。该代码是开源的，并使用前面描述的文本文件。
   1. 从应用程序下载并https://www.r-project.org/ R（本分析使用了 3.5.2 版）。
   2. 下载包（和演示数据集）自: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
   3. 使用 [工具] 使用 [安装包] 在 RStudio 上安装包。选择"包存档文件 （.zip;..tar.gz）"为类别"安装从:"，并选择包文件。按 "安装"。
   4. 通过在R工作室中编写此命令并按"输入"，加载具有"库"功能（"异细胞性空间分析"）的包。
   5. 通过在 R 工作室中编写此命令并按"输入"，运行具有函数 "ESA（）"的包。
      注:用户界面将打开。
   6. 选择数据集目录（.txt 文件）和输出绘图目录。
      注:分析的参数（参见下面的文本）可以通过用户界面更改。
   7. 此脚本将自动启动和执行分析。它提供相应绘图的 .pdf 文件和包含数值结果的 .txt 文件。

结果

从VAMP7-pHluorin10、11hTert-RPE1细胞中可视化的异细胞病事件的时^10,11空特征分析。hTert-RPE1细胞是非转化细胞，很好地采用微模式，在以往的基于微模式的研究^{4，14中被广泛使用}。VAMP7 是一个 lysosomal v-SNARE^15，在其 N 术语处被标记与超级黄道法林， 位于利索索姆的流明中。在细胞内，pHluorin探针被...

讨论

通过TIRFM活细胞成像VAMP7-pHluorin在环状微模式规范化细胞中监测出状细胞的外细胞细胞发生事件，对外细胞细胞事件的空间参数进行了严格的统计分析。使用转换的Ripley的K函数和基于最近邻域距离的统计测试，我们确认从裂酶体分泌不是一个^{随机过程,8，9。}两项统计分析都令人信服地表明，外细胞增多事件表现出聚类（图2D和2G）。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetic Chamber	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen	Molecular Probes, Invitrogen	F35200
Fibronectin bovine plasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 cell line	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG solution	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV ozone oven	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid	n/a	n/a	Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.