Quantification des paramètres spatiotemporal de l’exocytose cellulaire dans les cellules micropatternées

Résumé

L’imagerie en direct de l’exocytose lysosomale sur les cellules micropatternées permet une quantification spatiale de ce processus. La normalisation de la morphologie à l’aide de micropatterns est un outil exceptionnel pour découvrir des règles générales sur la distribution spatiale des processus cellulaires.

Résumé

L’imagerie en direct de la protéine 7 (VAMP7) associée à la pHluorine soluble soluble N-éthylmaleimide-sensible-facteur pièce jointe protéine de fixation REceptor (v-SNARE) protéine membranaire associée aux vésicules (VAMP7) par microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRFM) est un moyen simple d’explorer la sécrétion du compartiment lysosomal. Profitant de la culture cellulaire sur les surfaces micropatternées pour normaliser la forme cellulaire, une variété d’outils statistiques ont été utilisés pour effectuer une analyse spatiale des modèles sécrétoires. En utilisant la fonction K de Ripley et un test statistique basé sur la distance de voisinage la plus proche (NND), nous avons confirmé que la sécrétion de lysosomes n’est pas un processus aléatoire, mais montre un regroupement significatif. Il convient de noter que notre analyse a révélé que les événements d’exocytose sont également regroupés dans les zones de nonadhésion, ce qui indique que les molécules d’adhérence ne sont pas les seules structures qui peuvent induire des points chauds sécréteurs à la membrane plasmatique. Pourtant, nous avons constaté que l’adhérence cellulaire améliore le clustering. En plus des zones adhésives et nonadhésives précisément définies, la géométrie circulaire de ces micropatterns permet l’utilisation de coordonnées polaires, simplifiant les analyses. Nous avons utilisé l’estimation de la densité du noyau (KDE) et la fonction de distribution cumulative sur les coordonnées polaires des événements d’exocytose pour identifier les zones enrichies d’exocytose. Dans les cellules micropatternes en forme d’anneau, le regroupement s’est produit à la frontière entre les zones adhésives et nonadhésives. Notre analyse illustre comment des outils statistiques peuvent être utilisés pour étudier les distributions spatiales de divers processus biologiques.

Introduction

L’exocytose est un processus cellulaire universel dans lequel une vésicule fusionne avec la membrane plasmatique et libère son contenu. La vésicule peut soit fusionner totalement avec la membrane plasmatique (fusion complète) ou créer un pore de fusion qui reste ouvert pendant un temps limité (kiss-and-run)¹. Par exemple, les protéines nouvellement synthétisées sont libérées dans le milieu extracellulaire à partir de vésicules provenant du complexe golgi. Cette voie biosynthétique et antérograde est primordiale, en particulier dans les organismes multicellulaires, pour sécréter des peptides de signalisation (p. ex., hormones, neurotransmetteurs) et des composants de matrice extracellulaire (p. ex., collagène), ainsi que pour le trafic des protéines transmembrane vers la membrane plasmatique. En outre, les sécrétions peuvent provenir de différents endosomes: 1) le recyclage des endosomes afin de réutiliser les protéines transmembrane; 2) corps multivesiculaires (MVBs) pour libérer les exosomes; et 3) lysosomes pour la libération d’enzymes protéolytiques. La sécrétion endosomale s’est avérée importante pour l’excroissance de neurite, la formation de pseudopodia, la réparation de membrane de plasma, et la signalisation ATP-dépendante².

Pour étudier l’exocytose au niveau des cellules uniques, plusieurs techniques ont été employées. Patch-clamp permet la détection d’événements d’exocytose unique avec une haute résolution temporelle dans une grande variété de cellules vivantes³. Toutefois, cette méthode ne fournit pas d’information sur la localisation des événements d’exocytose, ni sur le compartiment à partir duquel elle se produit. La microscopie électronique permet une visualisation directe d’événements exocytiques à haute résolution spatiale, et en combinaison avec l’immunolabeling fournit des informations sur la spécificité des compartiments et des molécules impliquées. Un inconvénient de cette approche est le manque d’information sur la dynamique du processus, ainsi que son incapacité à effectuer des études à haut débit. Les approches de microscopie légère telles que la microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRFM), qui exploite le champ évanescent pour éclairer les fluorophores à proximité du couvercle (100 nm), fournit une bonne résolution temporelle et spatiale pour étudier les événements d’exocytose. Toutefois, cette méthode n’est compatible qu’avec les cellules adhérentes et ne peut être appliquée qu’à la partie ventrale/inférieure des cellules.

Il est à noter que la membrane plasmatique révèle une hétérogénéité significative à base de complexes adhésifs qui ne sont présents que dans les zones réglementées. Cette hétérogénéité limite, par exemple, l’absorption de différents ligands⁴. De même, il a récemment été signalé que la sécrétion du complexe de Golgi est concentrée à des « oints chaud » dans la membrane plasmatique⁵. En outre, on sait que certaines cargaisons sont sécrétées par l’exocytose⁶associée à l’adhérence focale. Il convient donc d’accorder une attention particulière à la question de savoir si les événements d’exocytose sont distribués au hasard dans l’espace, ou s’ils sont concentrés à des zones spécifiques de la membrane plasmatique. Plusieurs outils statistiques basés sur la fonction K de Ripley ont été proposés pour explorer ces questions^7,8,9. Notre approche combine ces outils avec le micropatternage pour contrôler la forme cellulaire et l’hétérogénéité des membranes plasmatiques. En plus de fournir un moyen de distinguer entre les zones adhésives et nonadhésives, cette technique permet également de comparer entre différentes cellules et conditions et augmente la puissance des analyses statistiques.

Ici, nous utilisons une variété d’outils statistiques pour étudier la distribution spatiale des événements d’exocytose à partir du compartiment lysosomal surveillé par tirfm imagerie cellulaire vivante de VAMP7-pHluorin dans des cellules hTert-RPE1 en forme de micropatternisé. Il a été confirmé que la sécrétion des lysosomes n’est pas un processus aléatoire^8,9 et que les événements d’exocytose présentent le regroupement. Il convient de noter que les événements d’exocytose sont également regroupés dans les zones nonadhésives, ce qui indique que les molécules d’adhérence ne sont pas les seules structures qui peuvent induire des points chauds sécrétoires à la membrane plasmatique. Néanmoins, l’adhérence cellulaire a amélioré le clustering. Notre analyse a permis d’identifier des zones enrichies d’exocytose situées à la frontière entre les zones adhésives et nonadhésives.

Protocole

1. Préparation de cellules micropatternées

1. Transfection des cellules
   1. Un jour avant la transfection, semer 2,5 x 10^{cellules 6} hTERT-RPE1 en un puits d’une plaque de puits de 12 (2 x 2 cm) dans 1 mL de milieu.
   2. Le jour de la transfection, préparer le mélange de transfection avec le plasmide VAMP7-pHluorine (100 μL de tampon, 0,8 μg d’ADN, 3 μL de mélange de transfection). Incuber pendant 10 min.
      NOTE: VAMP7 est un lysosomal v-SNARE, fusionné avec une étiquette pHluorin luminal. La sonde pHluorin est éteinte par un faible pH, mais pendant l’exocytose protons sont libérés et pHluorin commence à émettre un signal^10,11.
   3. Ajouter le mélange de transfection aux cellules de leur milieu.
   4. Modifier le milieu 4 h après l’ajout du mélange de transfection sur les cellules.
   5. Utilisez les cellules pour des expériences au cours des 24 à 48 prochaines heures.
2. Préparation des micropatterns (méthode de photolithographie)
   1. Laver les couvercles (25 mm de diamètre) dans l’éthanol et les laisser sécher pendant 5 min.
   2. Activer les couvercles par l’éclairage sous les UV profonds pendant 5 min.
   3. Créez une chambre humide en humidifiant soigneusement une serviette en papier sur laquelle un film de paraffine est placé. Ajouter les gouttes (30 μL pour 22 mm coverslip) de la solution Poly-L-Lysine-greffe-Polyéthylène Glycol (PLL-g-PEG) (0,1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH = 7,4) et placer des couvercles avec la surface activée sur eux. Fermer la chambre humide avec un dessus et incuber les couvercles pendant 1 h.
   4. Laver les couvercles 2x en PBS et 1x dans de l’eau distillée et les laisser sécher.
   5. Laver le photomask de quartz avec de l’eau distillée, puis avec de l’éthanol ou du propanol. Sécher le photomask avec le flux d’air filtré.
      REMARQUE : Le photomask à quartz est recouvert d’un côté de chrome antirefléctif qui contient des trous sous forme de micropatternes. Un photomask contenant des micropatternes en forme d’anneau de 37 μm est utilisé dans ce protocole. Lorsque les UV profonds sont brillants sur le photomask, la lumière ne peut passer à travers ces trous¹².
   6. Exposer le photomask (côté chromé) aux UV profonds pendant 5 min pour nettoyer la surface.
   7. Ajouter de petites gouttes d’eau (10 μL pour une couverture de 20 mm) sur le côté chromé du masque photomasque. Placez le couvercle avec leur côté PLL-g-PEG-traité sur la goutte et sécher l’eau supplémentaire. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne se forme entre le masque et les couvercles.
      REMARQUE : La force capillaire de l’eau immobilisera les couvercles.
   8. Exposez le photomask à l’UV profond pendant 5 min avec le côté non chromé vers le haut (les couvercles sont fixés sur la surface inférieure).
      REMARQUE : La lumière ne peut passer à travers les trous et modifier la surface traitée par PLL-g-PEG des couvercles sous le masque photomas.
   9. Retirez les couvercles du masque photomas en ajoutant l’excès d’eau.
      REMARQUE : Les couvercles doivent rapidement flotter.
   10. Incuber les couvercles dans une solution de protéines matricielles extracellulaires (50 μg/mL de fibronectine, 5 μg/mL de fibrinogène fluorescent dilué dans l’eau) sur un film de paraffine dans une chambre humide (comme à l’étape 1.2.3) pendant 1 h sous un capot d’écoulement laminaire pour éviter la contamination.
       REMARQUE : L’expérience peut être interrompue à ce stade en stockant les couvercles dans PBS à 4 °C.
3. Ensemencement cellulaire sur les surfaces micropatternées
   1. Utilisez un support de couvercle magnétique qui correspond à la taille des couvercles micropatternés pour monter les couvercles. Le jour de l’acquisition, chauffer le support de couvercle à 37 °C pour éviter le choc thermique pour les cellules lors des étapes suivantes.
   2. Préparer le milieu de modèle en complétant le milieu DMEM/F12 avec 20 mM HEPES et 2% de pénicilline/streptomycine.
   3. Placez les couvercles dans le support avec le côté micropatterned vers le haut et ajoutez le milieu de modèle dès que le couvercle est sur la base de support. Ajouter le joint et immobiliser avec le dispositif magnétique. Remplissez le support de couvercle avec le support de modèle et fermez-le avec le couvercle en verre.
      REMARQUE : Soyez rapide, pour ne pas laisser sécher le couvercle. Ne lavez pas le support de couvercle avec de l’éthanol entre les expériences, parce que le joint pourrait conserver un peu d’éthanol, qui peut réagir avec PLL-g-PEG et entraîner un stress cellulaire. Laver le porte-couvercles seulement avec de l’eau savonneuse. En outre, l’articulation peut être incubée dans le milieu de modèle à 37 °C pendant 1 h pour diluer le produit résiduel.
   4. Recueillir les cellules transfectées hTERT-RPE1 par trypsinisation (0,5 mL pour une plaque de puits de 12) et ajouter 1 mL de 10% FBS DMEM/F12 moyen.
   5. Ajoutez 0,5 x 10⁶ cellules hTERT-RPE1 transfectées au support de couvercle et reclusez-le. Incuber pendant 10 min dans l’incubateur.
   6. Laver le support de couvercle 5x avec un milieu de modèle pour enlever les cellules non attachées et les FBS résiduels en ajoutant le milieu de modèle avec une pipette et en aspirant le milieu avec une autre pipette pour créer un flux de lavage. Gardez toujours un petit volume de milieu de modèle dans le support de couvercle pour éviter le séchage des cellules sur le couvercle micropatterné, qui mènera à la mort cellulaire.
   7. Incuber dans l’incubateur pendant 3 h pour permettre la propagation complète des cellules.

2. Acquisition de données sur l’exocytose

1. Imagerie des événements d’exocytose
   1. Placer le porte-couvercle sous un TIRM. Le signal doit être détecté par une caméra sensible mise en place avec le meilleur format d’imagerie disponible.
      REMARQUE : Dans cette expérience, un objectif 100x et une caméra EMCCD avec une région de détection de 512 x 512 pixels ont été utilisés donnant lieu à une taille de pixel de 160 nm.
   2. Recherche d’une cellule exprimant VAMP7-pHluorin qui est entièrement répandue (Figure 1A).
      REMARQUE : Les cellules exprimant VAMP7 sont clairement identifiables, car elles présentent un signal vert.
   3. Modifiez l’angle du laser jusqu’à ce qu’un angle TIRF qui permette la visualisation des événements d’exocytose VAMP7-pHluorin soit atteint. Effectuer une acquisition de 5 minutes à une fréquence compatible avec le taux d’exocytose et l’échelle de temps (généralement 3 Hz, figure 1D)à l’aide du logiciel microscope.
      REMARQUE : les cellules hTERT-RPE1 ont un taux sécrétoire lysosomal d’environ 0,3 Hz sur les micropatternes. L’exocytose lysosomale a une durée typique de 1 s. Il est caractérisé par une intensité de pointe suivie d’une décomposition exponentielle. La diffusion de la sonde doit être évidente à ce moment (Figure 1B, C).
   4. Pour chaque cellule, effectuer également une acquisition du micropattern à l’aide du logiciel microscope (Figure 1A).
2. Acquisition de coordonnées d’exocytose
   1. Ouvrez le film acquis avec ImageJ/FIJI. Utiliser le fichier | Importation | Séquence d’image. Trouvez des événements d’exocytose par oeil. Un événement d’exocytose se caractérise par l’apparition d’un signal lumineux qui se propage vers l’extérieur (figure 1).
   2. Utilisez l’outil de point pour marquer le centre de l’événement exocytique. Utiliser Analyser | Mesurez les coordonnées X et Y, ainsi que la coordonnée temporelle (numéro de tranche). Effectuez ces mesures pour tous les événements d’exocytose du film.
   3. Enregistrer les résultats (Résultats | Fichier | Enregistrer sous . Préparez un fichier texte pour chaque cellule analysée nommée « Résultats(cell_name).txt » qui contient la tranche, les coordonnées X et les coordonnées Y pour tous les événements d’exocytose dans cet ordre.
      
      Le fichier texte est censé ressembler à ceci :
      Rayon de diamètre d’ID X Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      REMARQUE : Veillez à remplacer toutes les virgules par des points.
   4. Mesurez le centre et le diamètre de chaque cellule à l’aide del'« outil ovale». S’adapter à un cercle parfait (ne pas utiliser un ovale) et utiliser "Mesure" pour obtenir les coordonnées X et Y et le diamètre de Feret. Enregistrez l’identité (ID), les coordonnées X et Y de chaque cellule, le diamètre et le rayon de Feret (diamètre/2) dans un fichier texte nommé « paramètre sphérique.txt ».
      
      Le fichier texte est censé ressembler à ceci :
      Rayon de diamètre d’ID X Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      REMARQUE : Veillez à remplacer toutes les virgules par des points.
   5. Mesurez l’épaisseur de l’anneau micropattern (longueur d’adhérence) avec l’outil droit et enregistrez l’ID de cellule, le rayon de cellule (à partir du fichier : « Spherique paramerat.txt »), et la longueur d’adhérence dans un fichier texte nommé « Pattern parameter.txt ». Calculez la longueur normalisée de l’adhérence en divisant la longueur de l’adhérence par rayon de cellule.
      REMARQUE : Veillez à remplacer toutes les virgules par points.
      
      Le fichier doit ressembler à ceci :
      Longueur d’adhérence du rayon de cellule ID Longueur d’adhérence normalisée
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0,295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826

3. Analyse spatiale à cellule unique

1. R paquet et installation
   REMARQUE : Le package R pour cette analyse tire parti du paquet Spatstat¹³ pour calculer la densité bidimensionnelle (2D) et la fonction K de Ripley. Le code est open-source et utilise des fichiers texte qui ont été précédemment décrits.
   1. Télécharger et installer R à partir de https://www.r-project.org/ (la version 3.5.2 a été utilisée dans cette analyse).
   2. Téléchargez le package (et le jeu de données de démonstration) à partir de : https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
   3. Installez le package sur R Studio à l’aide de «Tools» à l’aide de «Install Packages». Sélectionnez "Package Archive File (.zip; .tar.gz)" pour la catégorie "Installer à partir de:" et choisissez le fichier de package. Appuyez sur "Installer« .
   4. Chargez le package avec la fonction "bibliothèque (« ExocytosisSpatialAnalysis »)" en écrivant cette commande en studio R et en appuyant sur "Entrez« .
   5. Exécutez le package avec la fonction "ESA()" en écrivant cette commande en studio R et en appuyant sur "Enter« .
      REMARQUE : Une interface utilisateur s’ouvre.
   6. Sélectionnez le répertoire du jeu de données (fichiers .txt) et un répertoire pour les parcelles de sortie.
      REMARQUE : Les paramètres de l’analyse (voir texte ci-dessous) peuvent être modifiés via une interface utilisateur.
   7. Ce script démarre et exécute automatiquement l’analyse. Il fournit des fichiers .pdf de graphiques correspondants et des fichiers .txt contenant des résultats numériques.

Résultats

Les caractéristiques spatiotemporal des événements d’exocytose ont été analysées à partir de lysosomes visualisés par VAMP7-pHluorin^10,11 dans les cellules hTert-RPE1. les cellules hTert-RPE1 sont des cellules non transformées qui adoptent bien au micropatternage et ont été largement utilisées dans des études antérieures basées sur des micropatternes^4,14. VAMP7 est un lysosomal v-SNARE

Discussion

Nous avons surveillé les événements d’exocytose du compartiment lysosomal par l’imagerie cellulaire vivante de TIRFM de VAMP7-pHluorin dans les cellules micropatternes-normalisées en forme d’anneau et avons exécuté une analyse statistique rigoureuse des paramètres spatiaux des événements d’exocytose. En utilisant la fonction K de Ripley transformée et un test statistique basé sur la distance de voisinage la plus proche, nous avons confirmé que la sécrétion de lysosomes n’est pas un processus aléa...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetic Chamber	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen	Molecular Probes, Invitrogen	F35200
Fibronectin bovine plasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 cell line	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG solution	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV ozone oven	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid	n/a	n/a	Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.