A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يقدم هذا البروتوكول جهازا ينتج PRP لتعزيز التوسع في المختبر للخلايا في نظام زراعة الخلايا الليفية الذاتية بنسبة 100٪.
يوجد حاليا اهتمام سريري كبير باستخدام الخلايا الليفية الذاتية لإصلاح الجلد. في معظم الحالات ، مطلوب زراعة خلايا الجلد في المختبر. ومع ذلك ، فإن زراعة الخلايا باستخدام وسائط الثقافة الزينوجينية أو الخيفية لها بعض العيوب (أي خطر انتقال العوامل المعدية أو بطء توسع الخلايا). هنا ، تم تطوير نظام زراعة ذاتي لتوسيع خلايا الخلايا الليفية للجلد البشري في المختبر باستخدام البلازما الغنية بالصفائح الدموية الخاصة بالمريض (PRP). يتم عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية عن المريض أثناء خضوعه لعملية شد البطن. تتم متابعة الثقافات لمدة تصل إلى 7 أيام باستخدام وسط مكمل إما بمصل بقري الجنين (FBS) أو PRP. يتم تقييم محتوى خلايا الدم في الاستعدادات PRP ، والانتشار ، وتمايز الخلايا الليفية. يصف هذا البروتوكول طريقة الحصول على إعداد موحد وغير نشط ل PRP باستخدام جهاز طبي مخصص. يتطلب التحضير فقط جهازا طبيا (CuteCell-PRP) وأجهزة طرد مركزي. هذا الجهاز مناسب في ظل ظروف الممارسة الطبية الكافية وهو نظام مغلق من خطوة واحدة وخالي من الحيوية ومعقم يتطلب طردا مركزيا واحدا ناعما يبلغ 1500 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، يتم فصل مكونات الدم ، ويتم جمع البلازما الغنية بالصفائح الدموية بسهولة. يسمح هذا الجهاز بإعداد سريع ومتسق وموحد ل PRP يمكن استخدامه كمكمل لزراعة الخلايا للتوسع في المختبر للخلايا البشرية. يحتوي PRP الذي تم الحصول عليه هنا على تركيز 1.5 ضعف الصفائح الدموية مقارنة بالدم الكامل معا ، مع إزالة تفضيلية لخلايا الدم الحمراء والبيضاء. تبين أن PRP يقدم تأثيرا معززا في تكاثر الخلايا مقارنة ب FBS (7.7x) وأن الخلايا الليفية يتم تنشيطها عند علاج PRP.
يهدف الطب التجديدي إلى شفاء أو استبدال الأنسجة والأعضاء التي تضررت بسبب العمر أو المرض أو الصدمة بالإضافة إلى تصحيح العيوب الخلقية. في العلاج الذاتي ، يتم سحب الخلايا أو الأنسجة من المريض ، أو توسيعها أو تعديلها ، ثم إعادة إدخالها إلى المتبرع. هذا النوع من العلاجات له إمكانات واسعة في مجال الأمراض الجلدية1. في علاج الخلايا الليفية الذاتية ، يتم زراعة الخلايا الليفية للمريض وإعادة حقنها لعلاج التجاعيد أو القوافي أو ندبات حب الشباب. نظرا لأن الخلايا الليفية هي الخلايا الوظيفية الرئيسية في الأدمة ، فقد يكون حقن الخلايا الليفية الذاتية أكثر فائدة من العلاجات الأخرى في تجديد شباب الوجه2.
في الجلد ، تكون الخلايا الليفية مسؤولة عن تخليق وإفراز البروتينات خارج الخلية (مثل الكولاجين والإيلاستين وحمض الهيالورونيك والجليكوزامينوجليكان). كما أنها تطلق عوامل النمو التي تنظم وظيفة الخلية ، والهجرة ، وتفاعلات مصفوفة الخلية / الخلية في توازن الجلد الطبيعي والتئام الجروح3. تم بالفعل إدخال الخلايا الليفية الجلدية كعلاج خلوي سريري محتمل لالتئام جروح الجلد4 ، أو تجديد الأنسجة5 ، أو الحشوات الجلدية في إجراءات الجراحة التجميليةوالتجميلية 6. حتى أن بعض الدراسات تشير إلى أنه في سياق الطب التجديدي ، قد تكون الخلايا الليفية علاجا خلويا أكثر عملية وفعالية من الخلايا الجذعية الوسيطة7.
للحصول على عدد كاف من الخلايا الليفية للتطبيقات السريرية ، عادة ما يكون توسيع الخلايا إلزاميا. تتطلب زراعة الخلايا خارج الجسم الحي / في المختبر وسطا قاعديا مكملا بعوامل النمو والبروتينات والإنزيمات لدعم التصاق الخلايا وتكاثرها. مصل الجنين البقري (FBS) هو مكمل شائع لوسائط زراعة الخلايا ، لأن دم الجنين 1) غني بعوامل النمو مقارنة بدم البالغين و 2) يقدم محتوى منخفض من الأجسام المضادة8. مع تقدم العلاج الخلوي، هناك مخاوف بشأن سلامة ظروف زراعة الخلايا الكلاسيكية التي يضاف فيها FBS إلى وسط الثقافة. وعلاوة على ذلك، هناك الآن ميل إلى الاستعاضة عن FBS بالبدائل9. أظهرت العديد من بدائل FBS نتائج واعدة10.
تم اختيار بديل البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) هنا ، وقمنا بتطوير جهاز طبي لإنتاج مستحضر موحد من PRP ، يسمى CuteCell-PRP. الاستخدام المقصود لهذا الجهاز هو إعداد PRP ذاتي المنشأ لاستخدامه كمكمل وسائط استزراع للتوسع في المختبر للخلايا الذاتية في ظل ظروف GMP.
يعرف PRP بأنه تعليق الصفائح الدموية المركز في البلازما. نظرا لوجود العديد من بروتوكولات التحضير ، والتي تختلف في 1) كمية الدم اللازمة ، 2) أنواع الأجهزة المستخدمة ، و 3) بروتوكول الطرد المركزي ، فإن تركيزات الصفائح الدموية الناتجة تختلف من أعلى قليلا إلى أكثر من 10 أضعاف قيمة خط الأساس للدم. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي مستحضرات PRP على مستويات متغيرة من تلوث خلايا الدم الحمراء والبيضاء. وهكذا يستخدم مصطلح "PRP" لوصف المنتجات التي تختلف اختلافا كبيرا في تكوينها البيولوجي وآثارها العلاجية المحتملة.
في معظم الدراسات ، يتم تحقيق استبدال FBS باستخدام تركيزات مختلفة من PRP التي يتم تنشيطها (بواسطة الثرومبين أو الكالسيوم). يثير هذا التنشيط الاصطناعي إطلاقا فوريا ومهما لعوامل نمو الصفائح الدموية من 15 دقيقة حتى 24 ساعة11. لذلك ، يعتقد أن تنشيط الصفائح الدموية غير مرغوب فيه للتطبيقات في مزارع الخلايا ، حيث يلزم الإطلاق البطيء لعوامل النمو من تحلل الصفائح الدموية التدريجي.
يتضمن علاج PRP تحضير الصفائح الدموية الذاتية في البلازما المركزة12. التركيز الأمثل للصفائح الدموية غير واضح ، وتتوفر مجموعة واسعة من الأجهزة التجارية لإعداد PRP13. ينتج هذا النقص في التوحيد القياسي عن عدم الاتساق بين الدراسات وأدى إلى صندوق أسود فيما يتعلق بجرعة الحقن وتوقيتها. يصف هذا البروتوكول إجراء للحصول على PRP ذاتي المنشأ باستخدام جهاز PRP المخصص هذا لتوسيع الخلايا الليفية الجلدية في نموذج ثقافة خارج الجسم الحي ذاتي المنشأ بنسبة 100٪.
امتثل بروتوكول الدراسة لإعلان هلسنكي ، وقدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة قبل المشاركة في الدراسة. يتم الحصول على عينات الجلد من النساء الأصحاء اللائي يخضعن لعملية شد البطن في قسم الجراحة التجميلية والترميمية والتجميلية في مستشفيات جامعة جنيف (جنيف ، سويسرا). يتوافق الإجراء مع مبادئ إعلان هلسنكي وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية المحلية (البروتوكول # 3126).
1. إعداد PRP
ملاحظة: تم تصميم أنابيب CuteCell-PRP (جدول المواد) للتحضير السريع ل PRP من حجم صغير من دم المريض في نظام دائرة مغلقة.
2. عزل الخلايا الليفية الذاتية والثقافة في الوسائط المكملة ل FBS أو PRP
هذه التقنية الحاصلة على براءة اختراع هي جهاز طبي بسيط وسريع وقابل للتكرار يستخدم لإنتاج مستحضرات PRP موحدة. إنه نظام مغلق بالكامل من خطوة واحدة يسمح بإعداد PRP من الدم الكامل الوريدي بعد 5 دقائق من الطرد المركزي عند 1500 × جم (بسبب تقنية الهلام المنفصل). يتم مسح PRP الذي تم الحصول عليه بعد الط?...
تشمل مزايا استخدام الخلايا الليفية الذاتية كبديل طبيعي مقارنة بمواد الحشو الأخرى في علاج خلايا الجرح التوافق الحيوي الجيد ، والحد الأدنى من الآثار الجانبية ، وسهولة الحصاد والاستخدام. ومع ذلك ، قبل استخدام هذه العلاجات في بيئة سريرية يومية ، من الضروري إجراء دراسات قبل سريرية مناسبة لتح?...
تم تمويل هذا المشروع من قبل Regen Lab SA. سارة بيرندت هي مديرة مشروع العلاج الخلوي في Regen Lab وتعمل في Regen Lab SA. أنطوان تورزي هو الرئيس التنفيذي لشركة RegenLab.
نشكر السيد غريغوري شنايتر على المساعدة التقنية في بيانات قياس التدفق الخلوي. البروفيسور موريل كوينديت (مختبر العقاقير ، كلية العلوم الصيدلانية ، وجامعة جنيف) للسماح باستخدام مقياس التدفق الخلوي Attune والمجهر عالي الإنتاجية Cytation 3 ؛ البروفيسورة بريجيت بيتيت للنصائح العلمية.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
96 well black clear flat bottom | BD Falcon | 353219 | 32/case |
Cell trace Violet Dye | Thermo Fischer Scientific | C34557 | 180 assays |
CuteCell PRP | Regen Lab SA | CC-PRP-3T | 3 tubes per package |
DAPI | Sigma | D9542 | 1 mg |
DMEM | Gibco | 52400-025 | 500 mL |
FBS | Gibco | 10270106 | 500 mL |
Glutamine 200 mM | Gibco | 25030024 | 100 mL |
Hematology Counter | Sysmex | KK-21N | |
Heparin 5000E Liquemine | Drossapharm AG | 0.5 mL | |
HEPES Buffer Solution 1M | Gibco | 15630-056 | 100 mL |
Liberase DH | Roche | 5401054001 | 2x 5 mg per package |
MEM NEAA 100x | Gibco | 11140-035 | 100 mL |
Na Pyruvate 1mg/mL | Gibco | 11360-039 | 100 mL |
Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 mL |
Phalloidin alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A12379 | 300 units |
RPMI | Gibco | 31966-021 | 500 mL |
Trypsin 1x 0.25% | Gibco | 25050-014 | 100 mL |
Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | 100 mL |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved