生产自体富血小板血浆以促进体外人成纤维细胞扩增

摘要

该协议提出了一种产生PRP以促进100%自体成纤维细胞培养系统中细胞体外扩增的装置。

摘要

目前，临床上对使用自体成纤维细胞进行皮肤修复有很大的兴趣。在大多数情况下，需要在体外培养皮肤细胞。然而，使用异种或同种异体培养基的细胞培养有一些缺点（即感染因子传播或细胞扩增缓慢的风险）。在这里，开发了一种自体培养系统，用于使用患者自身的富血小板血浆（PRP）在体外扩增人类皮肤成纤维细胞。在进行腹部成形术时，从患者身上分离出人真皮成纤维细胞。使用补充有胎牛血清 （FBS） 或 PRP 的培养基随访培养物长达 7 天。评估PRP制剂中的血细胞含量、增殖和成纤维细胞分化。该协议描述了使用专用医疗设备获得标准化，非活化PRP制剂的方法。该制剂只需要一个医疗设备（CuteCell-PRP）和离心机。该装置适用于足够的医疗实践条件，是一种一步法、无热原和无菌封闭系统，需要 1，500 x g 的单次软旋转离心 5 分钟。离心后，血液成分被分离，富血小板血浆很容易收集。该装置可实现快速、一致和标准化的PRP制备，可用作人体细胞体外扩增的细胞培养补充剂。这里获得的PRP含有1.5倍的血小板浓度，与全血相比，优先去除红细胞和白细胞。结果表明，与FBS（7.7x）相比，PRP在细胞增殖中表现出促进作用，并且在PRP处理后成纤维细胞被激活。

引言

再生医学旨在治愈或替换因年龄、疾病或创伤而受损的组织和器官，并纠正先天性缺陷。在自体治疗中，从患者身上取出细胞或组织，扩增或修饰，然后重新引入供体。这种形式的疗法在皮肤病学领域具有广泛的潜力¹。在自体成纤维细胞治疗中，对患者的成纤维细胞进行培养并重新注射以治疗皱纹、鼻痘或痤疮疤痕。由于成纤维细胞是真皮中的主要功能细胞，因此注射自体成纤维细胞可能比其他疗法更有益于面部年轻化²。

在皮肤中，成纤维细胞负责细胞外蛋白（即胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸和糖胺聚糖）的合成和分泌。它们还释放生长因子，调节正常皮肤稳态和^{伤口愈合中的}细胞功能、迁移和细胞-基质/细胞-细胞相互作用3。皮肤成纤维细胞已被引入为一种潜在的临床细胞疗法，用于皮肤伤口愈合⁴，组织再生⁵或美容和整形外科手术中的皮肤填充剂⁶。一些研究甚至表明，在再生医学的背景下，成纤维细胞可能比间充质干细胞更实用和有效的细胞疗法⁷。

为了获得足够数量的成纤维细胞用于临床应用，细胞扩增通常是强制性的。体外/体外细胞培养需要补充生长因子、蛋白质和酶的基础培养基来支持细胞粘附和增殖。胎牛血清（FBS）是细胞培养基的常用补充剂，因为胎儿血液1）与成人血液相比富含生长因子，2）^{抗体含量低}8。随着细胞治疗的进展，人们担心将FBS添加到培养基中的经典细胞培养条件的安全性。此外，现在有一种用替代品⁹取代FBS的趋势。几种FBS替代品已显示出有希望的结果¹⁰。

这里选择了富血小板血浆（PRP）替代品，我们开发了一种医疗设备来生产PRP的标准化制剂，名为CuteCell-PRP。该装置的预期用途是制备自体PRP，用作GMP条件下自体细胞体外扩增的培养基补充剂。

PRP被定义为血浆中的浓缩血小板悬浮液。由于有许多制备方案，它们在1）所需的血液量，2）使用的装置类型和3）离心方案方面有所不同，因此所得血小板浓度从略高于血液基线值的10倍到超过10倍不等。此外，PRP制剂含有不同水平的红细胞和白细胞污染。因此，术语"PRP"用于描述其生物成分和潜在治疗效果差异很大的产品。

在大多数研究中，FBS替代是使用不同浓度的PRP激活（通过凝血酶或钙）实现的。这种人工激活引起血小板生长因子从15分钟到24小时¹¹的立即和重要的释放。因此，据信血小板活化对于细胞培养中的应用是不希望的，其中需要从逐渐的血小板脱颗粒中缓慢释放生长因子。

PRP治疗涉及在浓缩血浆中制备自体血小板¹²。最佳血小板浓度尚不清楚，有多种商业设备可用于制备PRP¹³。这种缺乏标准化是由于研究之间的不一致造成的，并导致了关于注射剂量和时间的黑匣子。该协议描述了使用这种专用PRP装置获得自体PRP的程序，以在100%自体离体培养模型中扩增皮肤成纤维细胞。

研究方案

研究方案符合赫尔辛基宣言，所有患者在参与研究前都提供了书面知情同意书。皮肤样本来自在日内瓦大学医院（瑞士日内瓦）整形、重建和美容外科接受腹部整形术的健康女性。该程序符合《赫尔辛基宣言》的原则，并得到了当地机构伦理委员会的批准（协议#3126）。

1. 准备PRP

注意:CuteCell-PRP 管（材料表）设计用于在闭路系统中从少量患者血液中快速制备 PRP。

1. 采集全血
   注意:根据医疗机构的收集方案，使用直接连接到PRP管的蝶针从手臂的外周静脉收集自体血液。如果患者处于麻醉状态，则可以通过静脉插管直接抽血。
   1. 打开管泡罩包装。进行静脉穿刺并用全血填充所需数量的PRP管。管内的真空将能够自动收集所需体积的血液（~10 mL）。
   2. 小心地将试管倒置几次，将血液与抗凝剂混合。
   3. 在生物安全柜（2 类）内，使用 1 mL 注射器取出 100 μL 全血总量，以进行进一步的血细胞数计数。
2. 离心
   注意: 在启动离心机之前，请确保离心机已正确平衡。
   1. 一旦血液被收集到PRP管中，如有必要，准备一个平衡管（单独供应），其中的水与PRP管中的血液相同。将装满的试管彼此相对地放入离心机中，确保机器平衡。
   2. 将样品以1，500 x g 离心5分钟。
      注意:根据离心机制造商的说明设置相应的转速。离心后，血液将被分馏。红细胞和白细胞被困在凝胶下，血小板沉淀在凝胶表面（图1）。
3. 轻轻倒置PRP管20倍，将血小板沉积物重悬于血浆上清液中。
   注意:确保血小板与凝胶完全分离。等离子体应从透明变为浑浊。如果存在血小板聚集体，应将其与血浆一起收集。
4. 要收集PRP，请使用连接到10mL注射器的注射器转移装置从管中取出血浆溶液。
   注意:每个试管将获得约 5 mL 的 PRP。PRP溶液现在可以混合到最终培养基制备中。该溶液可以在室温（RT）下保存在安全柜下，直到将来的步骤涉及血液学分析仪和使用。
5. 在使用PRP之前，使用自动血液学分析仪确定血小板浓度，平均血小板体积以及红细胞和白细胞的数量（材料表）。为此，请小心地取出 100 μL 溶液并转移到 1.5 mL 管中。
   注意:PRP用作自体培养补充剂，浓度在5-20%v / v之间。需要为每个细胞系确定PRP的最佳浓度。为防止纤维蛋白凝块形成，最终培养基应补充 2 U/mL 肝素。

2. 在补充FBS或PRP的培养基中分离自体成纤维细胞和培养

1. 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中轻轻摇动，在 50 mL 聚丙烯管中洗涤皮肤样品。
2. 如果皮肤样本相对较大（>10 cm 2），则将样品放在 150 cm² 组织培养皿的盖子上（表皮面朝下）。用一把镊子和剪刀取出皮下脂肪组织。为防止纸巾变干，请每隔几分钟在PBS中冲洗一次纸巾。
   注意:对于较小的样品，请使用较小的组织培养皿。
3. 脂肪修剪完成后，使用无菌手术刀将组织切成约 0.5 厘米 x 1.5 厘米的条状。
4. 将 5 mL 胶原酶分散酶混合物（材料表;14 Wünsch 单位/mL）加入无菌 15 mL 管中。
5. 将切割的组织转移到试管中，确保组织碎片浸没在溶液中。盖紧管子。
6. 将试管置于37°C的培养箱中，轨道振荡150分钟。孵育后，将装有组织的管放入生物安全柜中。
7. 将无菌100毫米培养皿的盖子倒置在生物安全柜中。将消化的组织溶液转移到100mm培养皿的底部，不要飞溅。如果管中残留任何组织碎片，请使用无菌 1 mL 移液管或无菌镊子将组织碎片转移到 100 mm 培养皿的底部。
8. 表皮条朝上，使用两对镊子将完整的表皮片与真皮分开。用一对镊子握住组织条的真皮，用另一对镊子握住表皮的边缘。将真皮和表皮撕成两块，将分离的碎片放在同一个盖子上。尝试快速执行此步骤，并对每块组织重复操作。
9. 将真皮碎片转移到含有PBS的新100 mm培养皿中。
10. 使用实验室镊子，将真皮碎片放入含有 3 mL 0.3% 胰蛋白酶/PBS 的 15 mL 聚丙烯管中。在37°C水浴中孵育10-20分钟，每2-3分钟倒置试管数次。
11. 为了停止酶促反应，加入 3−5 mL 冰冷的完全生长培养基（Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 [DMEM] 或含有 10% FBS 的 RPMI）。用力涡旋管子几次。通过 85 μm 尼龙网（放置在 50 mL 管顶部）过滤成纤维细胞悬浮液以去除真皮碎片。
12. 在4°C下以150× g离心10分钟。 吸出上清液并将沉淀重悬于100−1，000μL完全生长培养基中。
13. 使用台盼蓝（稀释因子x2）与细胞悬液混合，通过填充血细胞计数器的腔室来计数总细胞数和活细胞数。
    注意:细胞活力取决于用于酶消化的条件。为了提高细胞回收率和细胞活力，可以将皮肤样品切成更小的碎片。
14. 在5mL的完整FBS生长培养基（DMEM，10%FBS在56°C下热灭活60分钟，1%1M HEPES缓冲溶液，1%100x非必需氨基酸混合物，1%100xL-谷氨酰胺，1%100x青霉素/链霉素，1%100x丙酮酸钠）中板3-10x 100x4细胞）在25cm²组织培养瓶中。在37°C孵育。
    注意:活的成纤维细胞将在24小时内附着在烧瓶上，并在2-3天内开始呈现纺锤形。
15. 在第2天，吸出含有非贴壁细胞的培养基并加入新鲜培养基。
    注意:由于培养基中的死细胞会影响活成纤维细胞的生长，因此必须从培养物中去除非贴壁的死细胞。
16. 每3-4天更换一次培养基，直到培养物达到70-80%汇合度。
17. 为了收获成纤维细胞，用PBS洗涤并在培养箱中与胰蛋白酶/ EDTA溶液在37°C孵育3分钟。
18. 要停止反应，加入 3−5 mL 温热的完全生长培养基（含有 10% FBS 的 DMEM 或 RPMI）。取等分试样的细胞悬液，用血细胞计数器计数细胞。以200× g 离心悬浮液5分钟，并通过抽吸除去培养基。
19. 在37°C的培养箱中培养PRP培养基（DMEM，20%PRP，1%1M HEPES缓冲溶液，1%100x非必需氨基酸混合物，1%100xL-谷氨酰胺，1%100x青霉素/链霉素，1%100x丙酮酸钠，2U / mL肝素）。
    注意:推荐的最小细胞密度为 4，000 个活细胞/cm²。
20. 为了评估PRP对成纤维细胞增殖的影响，在具有不同PRP浓度（1%，5%，10%，20%，30%，40%和50%）的PRP培养基中以每孔8 x 10^3个细胞 的密度在24孔板中接种种子成纤维细胞（传代2），并使用2 U / mL肝素或在经典培养基条件下（10%FBS）。培养7天后，向细胞中加入活染料（细胞增殖紫），并通过流式细胞术评估增殖。
21. 为了研究细胞骨架重排，在96孔黑色/透明平底板中以1 x 10⁵ 个细胞/ mL的浓度在完整的FBS生长DMEM（参见步骤2.14）中接种细胞，补充0.5%FBS24小时。用 10% FBS 或不同 PRP 浓度（1%、5%、10%、20%、30%、40% 和 50%）处理细胞 7 天。
    1. 用 4% 多聚甲醛固定成纤维细胞 10 分钟，并在室温下用 0.1% Triton X-100 透化 5 分钟。 用 50 mL 的 5 U/mL 鬼笔环肽染色成纤维细胞，用 PBS 洗涤 2 次，并用 50 mL 的 1 mg/mL 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 标记 5 分钟。Cytation 3 细胞成像多模式读数仪 （BioTek） 用于可视化鬼笔环肽染色。

结果

这项专利技术是一种简单、快速且可重复的医疗设备，用于生产标准化的 PRP 制剂。这是一个一步法，全封闭系统，允许在以1，500 x g 离心5分钟后从静脉全血制备PRP（由于分离凝胶技术）。离心后获得的PRP从位于凝胶下方的红细胞和白细胞中清除。经过几次试管倒置后，凝胶顶部的血小板重新悬浮在血浆中，PRP即可使用（图1）。

为了评估制剂中?...

讨论

与伤口细胞治疗中的其他填充材料相比，使用自体成纤维细胞作为天然替代品的优点包括良好的生物相容性、最小的副作用以及易于收获和使用。然而，在日常临床环境中使用这些疗法之前，有必要进行适当的临床前研究，以确定移植前后分离成纤维细胞的生长特征并评估其生物学功能和安全性。因此，在分离过程之后，必须快速进行细胞的体外扩增，以限制细胞分裂的次数。必须严格控制培养?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well black clear flat bottom	BD Falcon	353219	32/case
Cell trace Violet Dye	Thermo Fischer Scientific	C34557	180 assays
CuteCell PRP	Regen Lab SA	CC-PRP-3T	3 tubes per package
DAPI	Sigma	D9542	1 mg
DMEM	Gibco	52400-025	500 mL
FBS	Gibco	10270106	500 mL
Glutamine 200 mM	Gibco	25030024	100 mL
Hematology Counter	Sysmex	KK-21N
Heparin 5000E Liquemine	Drossapharm AG		0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M	Gibco	15630-056	100 mL
Liberase DH	Roche	5401054001	2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x	Gibco	11140-035	100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL	Gibco	11360-039	100 mL
Penicillin streptomycin	Gibco	15140122	100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488	Molecular Probes	A12379	300 units
RPMI	Gibco	31966-021	500 mL
Trypsin 1x 0.25%	Gibco	25050-014	100 mL
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200056	100 mL