Production de plasma autologue riche en plaquettes pour stimuler l’expansion in vitro des fibroblastes humains

Résumé

Ce protocole présente un dispositif qui produit du PRP pour stimuler l’expansion in vitro des cellules dans un système de culture de fibroblastes 100% autologue.

Résumé

Il existe actuellement un grand intérêt clinique pour l’utilisation de fibroblastes autologues pour la réparation de la peau. Dans la plupart des cas, une culture de cellules cutanées in vitro est nécessaire. Cependant, la culture cellulaire utilisant des milieux de culture xénogéniques ou allogéniques présente certains inconvénients (c.-à-d. risque de transmission d’agents infectieux ou de ralentissement de l’expansion cellulaire). Ici, un système de culture autologue est développé pour l’expansion des cellules fibroblastes de la peau humaine in vitro en utilisant le plasma riche en plaquettes (PRP) d’un patient. Les fibroblastes dermiques humains sont isolés du patient lors de l’abdominoplastie. Les cultures sont suivies jusqu’à 7 jours à l’aide d’un milieu supplémenté en sérum fœtal bovin (FBS) ou PRP. La teneur en cellules sanguines dans les préparations de PRP, la prolifération et la différenciation des fibroblastes sont évaluées. Ce protocole décrit la méthode permettant d’obtenir une préparation standardisée et non activée de PRP à l’aide d’un dispositif médical dédié. La préparation ne nécessite qu’un dispositif médical (CuteCell-PRP) et une centrifugeuse. Ce dispositif convient à des conditions de pratique médicales suffisantes et est un système fermé apyrogène et stérile en une étape qui nécessite une centrifugation à spin souple unique de 1 500 x g pendant 5 min. Après centrifugation, les composants sanguins sont séparés et le plasma riche en plaquettes est facilement collecté. Ce dispositif permet une préparation rapide, cohérente et standardisée de PRP qui peut être utilisé comme supplément de culture cellulaire pour l’expansion in vitro de cellules humaines. Le PRP obtenu ici contient une concentration plaquettaire de 1,5 fois supérieure à celle du sang total, avec une élimination préférentielle des globules rouges et blancs. Il est démontré que le PRP présente un effet stimulant sur la prolifération cellulaire par rapport au FBS (7,7x) et que les fibroblastes sont activés lors du traitement par PRP.

Introduction

La médecine régénérative vise à guérir ou à remplacer les tissus et les organes endommagés par l’âge, la maladie ou les traumatismes, ainsi qu’à corriger les malformations congénitales. Dans le traitement autologue, les cellules ou les tissus sont prélevés sur un patient, élargis ou modifiés, puis réintroduits chez le donneur. Cette forme de thérapeutique a un large potentiel dans le domaine de la dermatologie¹. Dans la thérapie autologue par fibroblastes, les fibroblastes d’un patient sont cultivés et réinjectés pour traiter les rides, les rides ou les cicatrices d’acné. Comme les fibroblastes sont les principales cellules fonctionnelles du derme, l’injection de fibroblastes autologues peut être plus bénéfique que d’autres thérapies dans le rajeunissement du visage².

Dans la peau, les fibroblastes sont responsables de la synthèse et de la sécrétion de protéines extracellulaires (collagène, élastine, acide hyaluronique et glycosaminoglycanes). Ils libèrent également des facteurs de croissance qui régulent la fonction cellulaire, la migration et les interactions cellule-matrice/cellule-cellule dans l’homéostasie cutanée normale et la cicatrisation des plaies³. Les fibroblastes dermiques ont déjà été introduits en tant que thérapie cellulaire clinique potentielle pour la cicatrisation des plaies cutanées⁴, la régénération tissulaire⁵ ou les produits de comblement dermique dans les procédures de chirurgie esthétique et plastique⁶. Certaines études suggèrent même que, dans le cadre de la médecine régénérative, les fibroblastes pourraient être une thérapie cellulaire plus pratique et efficace que les cellules souches mésenchymateuses⁷.

Pour obtenir un nombre suffisant de fibroblastes pour des applications cliniques, l’expansion cellulaire est généralement obligatoire. La culture cellulaire ex vivo/in vitro nécessite un milieu basal complété par des facteurs de croissance, des protéines et des enzymes pour soutenir l’adhésion cellulaire et la prolifération. Le sérum fœtal bovin (FBS) est un supplément courant pour les milieux de culture cellulaire, car le sang fœtal 1) est riche en facteurs de croissance par rapport au sang adulte et 2) présente une faible teneur en anticorps⁸. Au fur et à mesure que la thérapie cellulaire progresse, on s’inquiète de la sécurité des conditions de culture cellulaire classiques dans lesquelles le FBS est ajouté au milieu de culture. En outre, on a maintenant tendance à remplacer FBS par des alternatives⁹. Plusieurs substituts FBS ont montré des résultats prometteurs¹⁰.

L’alternative au plasma riche en plaquettes (PRP) a été sélectionnée ici, et nous avons développé un dispositif médical pour produire une préparation standardisée de PRP, appelée CuteCell-PRP. L’utilisation prévue de ce dispositif est la préparation de PRP autologue à utiliser comme complément de milieu de culture pour l’expansion in vitro de cellules autologues dans des conditions de BPF.

Le PRP est défini comme une suspension plaquettaire concentrée dans le plasma. Parce qu’il existe de nombreux protocoles de préparation, qui diffèrent par 1) la quantité de sang nécessaire, 2) les types de dispositifs utilisés et 3) le protocole de centrifugation, les concentrations plaquettaires résultantes varient d’un peu au-dessus à plus de 10 fois la valeur de base du sang. En outre, les préparations PRP contiennent des niveaux variables de contamination des globules rouges et blancs. La terminologie « PRP » est donc utilisée pour décrire des produits dont la composition biologique et les effets thérapeutiques potentiels varient considérablement.

Dans la plupart des études, la substitution FBS est obtenue en utilisant différentes concentrations de PRP qui est activé (par la thrombine ou le calcium). Cette activation artificielle provoque une libération immédiate et importante des facteurs de croissance plaquettaires de 15 min jusqu’à 24 h¹¹. Par conséquent, on pense que l’activation plaquettaire n’est pas souhaitable pour les applications dans les cultures cellulaires, dans lesquelles la libération lente des facteurs de croissance de la dégranulation plaquettaire progressive est nécessaire.

La thérapie PRP implique la préparation de plaquettes autologues dans le plasma concentré¹². La concentration plaquettaire optimale n’est pas claire et une large gamme de dispositifs commerciaux sont disponibles pour préparer le PRP¹³. Ce manque de normalisation résulte de l’incohérence entre les études et a conduit à une boîte noire concernant la posologie et le moment de l’injection. Ce protocole décrit une procédure pour obtenir du PRP autologue à l’aide de ce dispositif PRP dédié pour étendre les fibroblastes cutanés dans un modèle de culture ex vivo 100% autologue.

Protocole

Le protocole de l’étude était conforme à la Déclaration d’Helsinki et tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit avant de participer à l’étude. Les échantillons de peau sont prélevés sur des femmes en bonne santé subissant une abdominoplastie dans le service de chirurgie plastique, reconstructive et esthétique des Hôpitaux universitaires de Genève (Genève, Suisse). La procédure est conforme aux principes de la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par le comité d’éthique institutionnel local (protocole #3126).

1. Préparation du PRP

REMARQUE: Les tubes CuteCell-PRP (Table of Materials) sont conçus pour la préparation rapide de PRP à partir d’un petit volume de sang du patient dans un système en circuit fermé.

1. Prélèvement de sang total
   REMARQUE: Prélever du sang autologue dans une veine périphérique du bras à l’aide d’une aiguille papillon directement connectée au tube PRP, conformément au protocole de prélèvement de l’institut médical. Le sang peut être directement prélevé par la canule veineuse si le patient est sous anesthésie.
   1. Ouvrez la plaquette thermoformée du tube. Effectuez la ponction veineuse et remplissez le nombre souhaité de tubes PRP avec du sang total. Le vide à l’intérieur des tubes permettra la collecte automatique du volume de sang nécessaire (~10 mL).
   2. Retournez soigneusement les tubes plusieurs fois pour mélanger le sang avec un anticoagulant.
   3. À l’intérieur d’une enceinte de biosécurité (classe 2), prélever 100 μL de sang total à l’aide d’une seringue de 1 mL pour obtenir un nombre supplémentaire de cellules sanguines.
2. Centrifugation
   REMARQUE: Assurez-vous que la centrifugeuse est correctement équilibrée avant de la démarrer.
   1. Une fois le sang recueilli dans les tubes PRP, si nécessaire, préparez un tube à contrepoids (fourni séparément) avec de l’eau au même niveau que le sang dans le tube PRP. Placez les tubes remplis dans la centrifugeuse l’un en face de l’autre, en veillant à ce que la machine soit équilibrée.
   2. Centrifuger des échantillons à 1 500 x g pendant 5 min.
      REMARQUE: Réglez la vitesse de régime correspondante conformément aux instructions du fabricant de la centrifugeuse. Après centrifugation, le sang sera fractionné. Les globules rouges et blancs sont piégés sous le gel, et les plaquettes se déposent à la surface du gel (Figure 1).
3. Retourner doucement le tube PRP 20x pour remettre en suspension le dépôt plaquettaire dans le surnageant plasmatique.
   REMARQUE: Assurez-vous que les plaquettes sont complètement détachées du gel. Le plasma doit passer de clair et transparent à trouble. Si des agrégats plaquettaires sont présents, ils doivent être recueillis avec le plasma.
4. Pour recueillir le PRP, prélevez la solution plasmatique du tube à l’aide d’un dispositif de transfert de seringue connecté à une seringue de 10 mL.
   REMARQUE : Environ 5 mL de PRP seront obtenus de chaque tube. La solution PRP est maintenant prête à être mélangée dans la préparation finale du milieu. La solution peut être conservée à température ambiante (RT) sous l’armoire de sécurité jusqu’aux prochaines étapes impliquant l’analyseur hématologique et l’utilisation.
5. Avant d’utiliser le PRP, déterminez la concentration plaquettaire, le volume plaquettaire moyen et le nombre de globules rouges et blancs à l’aide d’un analyseur d’hématologie automatisé (tableau du matériel). Pour ce faire, prélever soigneusement 100 μL de la solution et transférer dans un tube de 1,5 mL.
   REMARQUE: PRP est utilisé comme supplément de culture autologue à une concentration comprise entre 5-20% v/v. La concentration optimale de PRP doit être déterminée pour chaque lignée cellulaire. Pour prévenir la formation de caillots de fibrine, le milieu de culture final doit être complété par 2 U/ml d’héparine.

2. Isolement des fibroblastes autologues et culture dans des milieux supplémentés en FBS ou PRP

1. Laver les échantillons de peau dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en agitant doucement dans un tube en polypropylène de 50 mL.
2. Si l’échantillon de peau est relativement grand (>10 cm 2), placer l’échantillon sur le couvercle d’une boîte de culture tissulaire^de 150 cm² (côté épidermique vers le bas). Retirez le tissu adipeux sous-cutané à l’aide d’une pince et de ciseaux. Pour éviter que le tissu ne se dessèche, rincez-le toutes les quelques minutes dans du PBS.
   REMARQUE : Utilisez une boîte de culture tissulaire plus petite pour les échantillons plus petits.
3. Lorsque la taille de la graisse est terminée, coupez le tissu en bandes d’environ 0,5 cm x 1,5 cm à l’aide d’un scalpel stérile.
4. Ajouter 5 mL de mélange collagénase-dispase (Table des matières; 14 unités Wünsch/mL) dans un tube stérile de 15 mL.
5. Transférez le tissu coupé dans le tube, en veillant à ce que les morceaux de tissu soient immergés dans la solution. Boucher solidement le tube.
6. Placer les tubes dans un incubateur à 37 °C en agitant orbitale pendant 150 min. Après l’incubation, placez le tube contenant le tissu dans l’enceinte de biosécurité.
7. Placez le couvercle d’une boîte de culture stérile de 100 mm à l’envers dans l’enceinte de biosécurité. Transférer la solution tissulaire digérée au fond de la capsule de culture de 100 mm, sans éclaboussures. S’il reste des morceaux de tissu dans le tube, utiliser une pipette stérile de 1 ml ou une pince stérile pour transférer les morceaux de tissu au fond de la boîte de culture de 100 mm.
8. Avec la bande d’épiderme tournée vers le haut, séparez la feuille d’épiderme intacte du derme à l’aide de deux paires de forceps. Tenez le derme de la bandelette tissulaire avec une paire de pinces et le bord de l’épiderme avec une autre paire de pinces. Épluchez le derme et l’épiderme en deux morceaux, en gardant les morceaux séparés sur le même couvercle. Essayez d’effectuer cette étape rapidement et répétez la manipulation pour chaque morceau de tissu.
9. Transférer les morceaux dermiques dans une nouvelle boîte de culture de 100 mm contenant du PBS.
10. À l’aide d’une pince de laboratoire, placer les morceaux dermiques dans un tube en polypropylène de 15 mL contenant 3 mL de trypsine/PBS à 0,3 %. Incuber pendant 10-20 min dans un bain-marie à 37 °C et retourner le tube plusieurs fois toutes les 2−3 min.
11. Pour arrêter la réaction enzymatique, ajoutez 3 à 5 mL de milieu de croissance complet glacé (milieu Eagle modifié de Dulbecco [DMEM] ou RPMI contenant 10 % de FBS). Vortex le tube vigoureusement plusieurs fois. Filtrer la suspension de fibroblastes à travers un filet de nylon de 85 μm (placé sur le dessus d’un tube de 50 mL) pour éliminer les débris dermiques.
12. Centrifuger pendant 10 min à 150 x g, à 4 °C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 100−1 000 μL de milieu de croissance complet.
13. À l’aide de bleu de trypan (facteur de dilution de x2) mélangé à la suspension cellulaire, compter le nombre de cellules totales et viables en remplissant la chambre de l’hémocytomètre.
    REMARQUE: La viabilité cellulaire dépend des conditions utilisées pour la digestion enzymatique. Pour augmenter la récupération cellulaire et la viabilité cellulaire, l’échantillon de peau peut être coupé en plus petits morceaux.
14. Plaquette 3−10 x 10⁴ cellules dans 5 mL de milieu de croissance complet du FBS (DMEM, 10 % FBS inactivé thermiquement pendant 60 min à 56 °C, solution tampon HEPES 1 % 1 M, 1 % 100x mélange d’acides aminés non essentiels, 1 % 100x L-glutamine, 1 % 100x pénicilline/streptomycine, 1 % 100x pyruvate de sodium) dans une fiole de culture tissulaire de 25 cm² . Incuber à 37 °C.
    REMARQUE : Les fibroblastes viables se fixent au ballon dans les 24 heures et commencent à présenter la forme d’un fuseau dans 2 à 3 jours.
15. Le jour 2, aspirer le milieu contenant des cellules non adhérentes et ajouter un milieu frais.
    REMARQUE: Comme les cellules mortes dans le milieu de culture affectent la croissance des fibroblastes viables, les cellules mortes non adhérentes doivent être retirées de la culture.
16. Changez le milieu tous les 3-4 jours jusqu’à ce que la culture atteigne 70-80% de confluence.
17. Pour récolter les fibroblastes, laver avec du PBS et incuber avec une solution de trypsine/EDTA pendant 3 min à 37 °C dans l’incubateur.
18. Pour arrêter la réaction, ajouter 3 à 5 mL de milieu de croissance complet chaud (DMEM ou RPMI contenant 10 % de FBS). Prendre une partie aliquote de la suspension cellulaire pour compter les cellules avec l’hémocytomètre. Centrifuger la suspension pendant 5 min à 200 x g et retirer le milieu par aspiration.
19. Culture du fibroblaste en milieu PRP (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M HEPES solution tampon, 1% 100x mélange d’acides aminés non essentiels, 1% 100x L-glutamine, 1% 100x pénicilline/streptomycine, 1% 100x pyruvate de sodium, 2 U/mL d’héparine) dans l’incubateur à 37 °C.
    REMARQUE: La densité cellulaire minimale recommandée est de 4 000 cellules viables / cm².
20. Pour évaluer les effets du PRP sur la prolifération des fibroblastes, grainer des fibroblastes (passage 2) dans 24 plaques de puits à une densité de 8 x 10³ cellules par puits dans un milieu PRP avec différentes concentrations de PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% et 50%) et avec 2 U/mL d’héparine ou dans des conditions de milieu de culture classique (10% FBS). Après 7 jours de culture, ajouter un colorant vital (violet de prolifération cellulaire) aux cellules et évaluer la prolifération par cytométrie en flux.
21. Pour étudier les réarrangements cytosquelettiques, les cellules de semence dans 96 plaques de fond plat noir/clair à une concentration de 1 x 10 5 cellules/ml dans le DMEM de croissance complète du FBS (voir étape 2.14) complété par^0,5 % de FBS pendant 24 h. Traiter les cellules avec 10% FBS ou différentes concentrations de PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% et 50%) pendant 7 jours.
    1. Fixer les fibroblastes avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 min et perméabiliser avec 0,1% Triton X-100 pendant 5 min à TA. Colorer les fibroblastes avec 50 mL de phalloïdine 5 U/mL, laver 2x avec PBS et marquer avec 50 mL de 1 mg/mL 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min. Le lecteur multimode d’imagerie cellulaire Cytation 3 (BioTek) a été utilisé pour visualiser la coloration à la phalloïdine.

Résultats

Cette technologie brevetée est un dispositif médical simple, rapide et reproductible utilisé pour produire des préparations PRP standardisées. Il s’agit d’un système entièrement fermé en une étape qui permet la préparation de PRP à partir de sang total veineux après 5 min de centrifugation à 1 500 x g (grâce à la technologie du gel de séparation). Le PRP obtenu après centrifugation est éliminé des globules rouges et blancs, qui se trouvent sous le gel. Après plusieurs inversions de tubes,...

Discussion

Les avantages de l’utilisation de fibroblastes autologues comme alternative naturelle par rapport à d’autres matériaux de remplissage dans la thérapie cellulaire des plaies comprennent une bonne biocompatibilité, des effets secondaires minimes et une facilité de récolte et d’utilisation. Cependant, avant d’utiliser ces traitements dans un cadre clinique quotidien, des études précliniques appropriées sont nécessaires pour identifier les caractéristiques de croissance et évaluer la fonction biologique e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well black clear flat bottom	BD Falcon	353219	32/case
Cell trace Violet Dye	Thermo Fischer Scientific	C34557	180 assays
CuteCell PRP	Regen Lab SA	CC-PRP-3T	3 tubes per package
DAPI	Sigma	D9542	1 mg
DMEM	Gibco	52400-025	500 mL
FBS	Gibco	10270106	500 mL
Glutamine 200 mM	Gibco	25030024	100 mL
Hematology Counter	Sysmex	KK-21N
Heparin 5000E Liquemine	Drossapharm AG		0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M	Gibco	15630-056	100 mL
Liberase DH	Roche	5401054001	2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x	Gibco	11140-035	100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL	Gibco	11360-039	100 mL
Penicillin streptomycin	Gibco	15140122	100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488	Molecular Probes	A12379	300 units
RPMI	Gibco	31966-021	500 mL
Trypsin 1x 0.25%	Gibco	25050-014	100 mL
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200056	100 mL