In Vitro 인간 섬유아세포 확장을 촉진하기 위한 자가 혈소판 풍부 혈장 생산

요약

이 프로토콜은 100% 자가 섬유아세포 배양 시스템에서 세포의 시험관 내 확장을 촉진하기 위해 PRP를 생성하는 장치를 제시합니다.

초록

현재 피부 복구를 위한 자가 섬유아세포의 사용에 대한 임상적 관심이 크다. 대부분의 경우 시험관 내에서 피부 세포의 배양이 필요합니다. 그러나, 이종 또는 동종 배양 배지를 사용하는 세포 배양은 몇 가지 단점(즉, 감염원 전파 또는 느린 세포 확장의 위험)을 갖는다. 여기서, 환자 자신의 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 이용하여 체외에서 인간 피부 섬유아세포의 확장을 위한 자가 배양 시스템을 개발한다. 인간 진피 섬유아세포는 복부 성형술을 받는 동안 환자로부터 분리됩니다. 배양은 소 태아 혈청(FBS) 또는 PRP가 보충된 배지를 사용하여 최대 7일 동안 추적됩니다. PRP 제제의 혈구 함량, 증식 및 섬유아세포 분화를 평가합니다. 이 프로토콜은 전용 의료 기기를 사용하여 PRP의 표준화된 비활성 제제를 얻는 방법을 설명합니다. 준비에는 의료 기기 (CuteCell-PRP)와 원심 분리기 만 있으면됩니다. 이 장치는 충분한 의료 행위 조건에서 적합하며 5분 동안 1,500 x g 의 단일 소프트 스핀 원심분리가 필요한 원스텝, 발열성 및 멸균 폐쇄 시스템입니다. 원심 분리 후 혈액 성분이 분리되고 혈소판이 풍부한 혈장이 쉽게 수집됩니다. 이 장치를 사용하면 인간 세포의 시험관 내 확장을 위한 세포 배양 보충제로 사용할 수 있는 PRP를 빠르고 일관되며 표준화된 제조가 가능합니다. 여기서 얻은 PRP는 전혈에 비해 혈소판 농도가 1.5 배 더 높으며 적혈구와 백혈구가 우선적으로 제거됩니다. PRP는 FBS(7.7배)에 비해 세포 증식 촉진 효과를 나타내며 PRP 치료 시 섬유아세포가 활성화되는 것으로 나타났습니다.

서문

재생 의학은 나이, 질병 또는 외상으로 손상된 조직과 기관을 치유하거나 대체하고 선천적 결함을 교정하는 것을 목표로 합니다. 자가 요법에서는 세포나 조직을 환자에게서 빼내어 확장하거나 변형한 다음 기증자에게 다시 도입합니다. 이러한 형태의 치료제는 피부과 분야에서 광범위한 잠재력을 가지고 있다¹. 자가 섬유아세포 치료에서는 환자의 섬유아세포를 배양하고 재주입하여 주름, 백합 또는 여드름 흉터를 치료합니다. 섬유아세포는 진피의 주요 기능세포이기 때문에 자가 섬유아세포 주사는 안면 회춘에 다른 치료법보다 더 유익할 수 있다².

피부에서 섬유아세포는 세포외 단백질(즉, 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산 및 글리코사미노글리칸)의 합성 및 분비를 담당합니다. 또한 정상적인 피부 항상성 및 상처 치유에서 세포 기능, 이동 및 세포-기질/세포-세포 상호작용을 조절하는 성장 인자를 방출합니다³. 피부 섬유아세포는 피부 상처 치유를 위한 잠재적인 임상 세포 치료제로 이미 소개되었다.4, 조직 재생⁵ 또는 심미와 성형 수술에서 피부 필러6^. 일부 연구에서는 재생 의학의 맥락에서 섬유아세포가 중간엽 줄기세포보다 더 실용적이고 효과적인 세포 치료제가 될 수 있다고 제안하기도^{한다 7}.

임상 적용을 위해 충분한 수의 섬유아세포를 얻으려면 일반적으로 세포 확장이 필수입니다. 생체 외/체외 세포 배양에는 세포 부착 및 증식을 지원하기 위해 성장 인자, 단백질 및 효소가 보충된 기본 배지가 필요합니다. 태아 소 혈청(FBS)은 태아 혈액이 1) 성인 혈액에 비해 성장 인자가 풍부하고 2)^{항체 함량이} 낮기 때문에 세포 배양 배지의 일반적인 보충제입니다8. 세포 치료가 진행됨에 따라 FBS가 배양 배지에 첨가되는 고전적인 세포 배양 조건의 안전성에 대한 우려가 있습니다. 더욱이 FBS를 대안으로 대체하는 경향이 있습니다⁹. 여러 FBS 대체품이 유망한 결과를 보여주었습니다¹⁰.

혈소판 풍부 혈장(PRP) 대체품이 여기에서 선택되었으며, 당사는 CuteCell-PRP라는 PRP의 표준화된 제제를 생산하기 위한 의료 기기를 개발했습니다. 이 장치의 의도된 용도는 GMP 조건에서 자가 세포의 시험관 내 확장을 위한 배양 배지 보충제로 사용할 자가 PRP의 준비입니다.

PRP는 혈장 내 농축 혈소판 현탁액으로 정의됩니다. 1) 필요한 혈액의 양, 2) 사용되는 장치 유형 및 3) 원심분리 프로토콜이 다른 수많은 준비 프로토콜이 있기 때문에 결과 혈소판 농도는 혈액 기준선 값보다 약간 높거나 10배 이상까지 다양합니다. 또한 PRP 제제에는 다양한 수준의 적혈구 및 백혈구 오염이 포함되어 있습니다. 따라서 "PRP"라는 용어는 생물학적 구성과 잠재적인 치료 효과가 크게 다른 제품을 설명하는 데 사용됩니다.

대부분의 연구에서 FBS 치환은 (트롬빈 또는 칼슘에 의해) 활성화되는 다양한 농도의 PRP를 사용하여 달성됩니다. 이 인공 활성화는 15 분에서 24 시간¹¹까지 혈소판 성장 인자의 즉각적이고 중요한 방출을 유발합니다. 따라서, 혈소판 활성화는 점진적인 혈소판 탈과립화로부터 성장 인자의 느린 방출이 요구되는 세포 배양에서의 적용에 바람직하지 않은 것으로 여겨진다.

PRP 요법은 농축 혈장에서 자가 혈소판을 준비하는 것을 포함한다¹². 최적의 혈소판 농도는 불분명하며 PRP¹³을 준비하기 위해 광범위한 상용 장치를 사용할 수 있습니다. 이러한 표준화의 부족은 연구 간의 불일치로 인해 발생하며 주사 용량 및 시기에 관한 블랙박스로 이어졌습니다. 이 프로토콜은 100% 자가 생체 외 배양 모델에서 피부 섬유아세포를 확장하기 위해 이 전용 PRP 장치를 사용하여 자가 PRP를 얻는 절차를 설명합니다.

프로토콜

연구 프로토콜은 헬싱키 선언을 준수했으며 모든 환자는 연구에 참여하기 전에 서면 동의서를 제공했습니다. 피부 샘플은 제네바 대학 병원 (스위스 제네바)의 성형, 재건 및 미용 외과에서 복부 성형술을받는 건강한 여성에게서 얻습니다. 이 절차는 헬싱키 선언의 원칙을 준수하며 지역 기관 윤리 위원회(프로토콜 #3126)의 승인을 받았습니다.

1. PRP의 제조

알림: CuteCell-PRP 튜브(재료 표)는 폐쇄 회로 시스템에서 소량의 환자 혈액에서 PRP를 신속하게 준비하도록 설계되었습니다.

1. 전혈 수집
   참고: 의료기관의 채취 프로토콜에 따라 PRP 튜브에 직접 연결된 나비 바늘을 사용하여 팔의 말초 정맥에서 자가 혈액을 채취합니다. 환자가 마취 상태인 경우 정맥 캐뉼라를 통해 혈액을 직접 빼낼 수 있습니다.
   1. 튜브 블리스터 팩을 엽니다. 정맥 천자를 수행하고 원하는 수의 PRP 튜브를 전혈로 채 웁니다. 튜브 내부의 진공을 통해 필요한 양의 혈액(~10mL)을 자동으로 수집할 수 있습니다.
   2. 조심스럽게 튜브를 거꾸로 여러 번 뒤집어 혈액과 항응고제를 섞습니다.
   3. 생물 안전 캐비닛(클래스 2) 내부에서 추가 혈구 수 계산을 위해 1mL 주사기를 사용하여 총 전혈 100μL를 제거합니다.
2. 원심 분리
   알림: 원심분리기를 시작하기 전에 원심분리기의 균형이 올바르게 맞는지 확인하십시오.
   1. PRP 튜브에 혈액을 채취한 후 필요에 따라 PRP 튜브의 혈액과 동일한 수준의 물이 담긴 평형 튜브(별도 공급)를 준비합니다. 채워진 튜브를 원심분리기에 서로 마주보고 놓고 기계의 균형을 맞춥니다.
   2. 1,500 x g 에서 5분 동안 원심분리기 시료
      알림: 원심분리기 제조업체의 지침에 따라 해당 rpm 속도를 설정하십시오. 원심 분리 후 혈액이 분획됩니다. 적혈구와 백혈구는 젤 아래에 갇히고 혈소판은 젤 표면에 침전됩니다(그림 1).
3. PRP 튜브를 20배 부드럽게 뒤집어 혈장 상층액에 혈소판 침착물을 재현탁시킵니다.
   알림: 혈소판이 젤에서 완전히 분리되었는지 확인하십시오. 플라즈마는 투명하고 투명한 것에서 탁한 것으로 변해야합니다. 혈소판 응집체가 존재하면 혈장과 함께 수집해야합니다.
4. PRP를 수집하려면 10mL 주사기에 연결된 주사기 이송 장치를 사용하여 튜브에서 플라즈마 용액을 채취합니다.
   참고: 각 튜브에서 약 5mL의 PRP를 얻을 수 있습니다. 이제 PRP 용액을 최종 배지 준비에서 혼합할 준비가 되었습니다. 이 용액은 혈액학 분석기 및 사용과 관련된 향후 단계까지 안전 캐비닛 아래 실온(RT)에서 보관할 수 있습니다.
5. PRP를 사용하기 전에 자동 혈액학 분석기(표 자료)를 사용하여 혈소판 농도, 평균 혈소판 부피, 적혈구 및 백혈구 수를 결정합니다. 이렇게 하려면 용액 100μL를 조심스럽게 빼내고 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   참고: PRP는 5–20% v/v 사이의 농도에서 자가 배양 보충제로 사용됩니다. PRP의 최적 농도는 각 세포주에 대해 결정되어야 합니다. 피브린 응고 형성을 방지하기 위해 최종 배양 배지에 2U/mL 헤파린을 보충해야 합니다.

2. FBS 또는 PRP 보충 배지에서 자가 섬유아세포 분리 및 배양

1. 50mL 폴리프로필렌 튜브에서 부드럽게 흔들어 인산염 완충 식염수(PBS)로 피부 샘플을 세척합니다.
2. 피부 샘플이 비교적 큰 경우(>10 cm2), 샘플을 150^cm2 조직 배양 접시(표피면이 아래로)의 뚜껑에 놓습니다. 집게와 가위를 사용하여 피하 지방 조직을 제거하십시오. 조직이 마르지 않도록 PBS에서 몇 분마다 조직을 헹굽니다.
   참고: 더 작은 샘플에는 더 작은 조직 배양 접시를 사용하십시오.
3. 지방 다듬기가 완료되면 멸균 메스를 사용하여 조직을 약 0.5cm x 1.5cm 스트립으로 자릅니다.
4. 멸균된 15mL 튜브에 5mL의 콜라게나제-디스파아제 혼합물(재료 표; 14 Wünsch units/mL)을 추가합니다.
5. 절단된 조직을 튜브로 옮겨 조직 조각이 용액에 잠기도록 합니다. 튜브를 단단히 닫으십시오.
6. 튜브를 37°C의 인큐베이터에 넣고 150분 동안 궤도 진탕합니다. 배양 후 조직이 들어 있는 튜브를 생물안전 캐비닛에 넣습니다.
7. 멸균된 100mm 배양 접시의 뚜껑을 생물 안전 캐비닛에 거꾸로 놓습니다. 소화된 조직 용액을 튀지 않고 100mm 배양 접시의 바닥으로 옮깁니다. 튜브에 조직 조각이 남아 있는 경우 멸균 1mL 피펫 또는 멸균 집게를 사용하여 조직 조각을 100mm 배양 접시의 바닥으로 옮깁니다.
8. 표피 스트립이 위를 향하게 한 상태에서 두 쌍의 집게를 사용하여 손상되지 않은 표피 시트를 진피에서 분리합니다. 한 쌍의 집게로 조직 스트립의 진피를 잡고 다른 한 쌍의 집게로 표피의 가장자리를 잡습니다. 진피와 표피를 두 조각으로 떼어 내고 분리 된 조각을 같은 뚜껑에 보관하십시오. 이 단계를 신속하게 수행하고 각 조직 조각에 대해 조작을 반복하십시오.
9. PBS가 들어 있는 새로운 100mm 배양 접시에 진피 조각을 옮깁니다.
10. 실험실 집게를 사용하여 3mL의 0.3% 트립신/PBS가 있는 15mL 폴리프로필렌 튜브에 진피 조각을 넣습니다. 37°C 수조에서 10-20분 동안 배양하고 2-3분마다 튜브를 여러 번 뒤집습니다.
11. 효소 반응을 중지하려면 3-5mL의 얼음처럼 차가운 완전 성장 배지(Dulbecco's modified Eagle 배지[DMEM] 또는 10% FBS를 함유한 RPMI)를 추가합니다. 튜브를 여러 번 격렬하게 소용돌이칩니다. 섬유아세포 현탁액을 85μm 나일론 메쉬(50mL 튜브 상단에 배치)를 통해 여과하여 진피 파편을 제거합니다.
12. 150 x g, 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 100-1,000 μL의 완전한 성장 배지에 펠릿을 재현탁합니다.
13. 세포 현탁액과 혼합된 트립판 블루(x2의 희석 인자)를 사용하여 혈구계의 챔버를 채워 총 및 생존 세포의 수를 계수합니다.
    참고: 세포 생존율은 효소 소화에 사용되는 조건에 따라 다릅니다. 세포 회수율 및 세포 생존율을 증가시키기 위해, 피부 샘플을 더 작은 조각들로 절단할 수 있다.
14. 플레이트 3-10 x 10⁴ 세포 5mL의 완전한 FBS 성장 배지(DMEM, 56°C에서 60분 동안 10% FBS 열 비활성화, 1% 1M HEPES 완충 용액, 1% 100x 비필수 아미노산 혼합물, 1% 100x L-글루타민, 1% 100x 페니실린/스트렙토마이신, 1% 100x 피루브산나트륨) 25cm² 조직 배양 플라스크에서. 37°C에서 배양한다.
    참고: 생존 가능한 섬유아세포는 24시간 이내에 플라스크에 부착되고 2-3일 안에 방추 모양을 나타내기 시작합니다.
15. 2일째에, 비부착성 세포를 함유하는 배지를 흡인하고 새로운 배지를 첨가한다.
    참고: 배양 배지의 죽은 세포는 생존 가능한 섬유아세포의 성장에 영향을 미치므로 비부착성 죽은 세포는 배양에서 제거해야 합니다.
16. 배양 물이 70-80 % 밀도에 도달 할 때까지 3-4 일마다 배지를 교체하십시오.
17. 섬유아세포를 채취하려면 PBS로 세척하고 인큐베이터에서 37°C에서 3분 동안 트립신/EDTA 용액으로 배양합니다.
18. 반응을 중지하려면 3-5mL의 따뜻한 완전 성장 배지(10% FBS를 함유한 DMEM 또는 RPMI)를 추가합니다. 혈구계로 세포를 계산하기 위해 세포 현탁액의 부분 표본을 취합니다. 현탁액을 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 흡인에 의해 배지를 제거합니다.
19. 섬유아세포를 PRP 배지(DMEM, 20% PRP, 1% 1M HEPES 완충액, 1% 100x 비필수 아미노산 혼합물, 1% 100x L-글루타민, 1% 100x 페니실린/스트렙토마이신, 1% 100x 피루브산나트륨, 2U/mL 헤파린)의 37°C 배양기에서 배양한다.
    참고: 권장되는 최소 세포 밀도는 4,000개의 생존 세포/^cm2입니다.
20. 섬유아세포 증식에 대한 PRP 효과를 평가하기 위해 PRP 농도가 다른 PRP 배지(1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 및 50%) 및 2U/mL 헤파린 또는 고전적 배양 배지 조건(10% FBS)에서 웰당 8 x 10³ 세포의 밀도로 24웰 플레이트의 종자 섬유아세포(계대 2). 배양 7일 후, 바이탈 염료(cell proliferation violet)를 세포에 첨가하고 유세포 분석기로 증식을 평가한다.
21. 세포골격 재배열을 연구하기 위해 96시간 동안 0.5% FBS가 보충된 완전한 FBS 성장 DMEM(2.14단계 참조)에서 1 x 10⁵ cells/mL 농도의 24웰 흑색/투명 평평한 바닥 플레이트의 종자 세포. 10% FBS 또는 다른 PRP 농도(1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%)로 세포를 7일 동안 처리합니다.
    1. 섬유아세포를 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정하고 RT에서 0.1% Triton X-100으로 5분 동안 투과시킵니다. 섬유아세포를 50mL의 5U/mL 팔로이딘으로 염색하고 PBS로 2배 세척한 다음 50mg/mL의 1mg/mL 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 5분 동안 표시합니다. Cytation 3 세포 이미징 다중 모드 판독기(BioTek)를 사용하여 팔로이딘 염색을 시각화했습니다.

결과

이 특허 기술은 표준화된 PRP 제제를 생산하는 데 사용되는 간단하고 빠르며 재현 가능한 의료 기기입니다. 1,500 x g 에서 5분 동안 원심분리한 후 정맥 전혈에서 PRP를 제조할 수 있는 원스텝 완전 폐쇄 시스템입니다(분리 젤 기술로 인해). 원심분리 후 얻은 PRP는 젤 아래에 있는 적혈구와 백혈구에서 제거됩니다. 여러 차례 관을 반전시킨 후 겔 위에 있는 혈소판이 혈장에 재현탁되고 PRP를 사?...

토론

상처 세포 치료에서 다른 필러 재료에 비해 자가 섬유아세포를 천연 대안으로 사용하면 우수한 생체 적합성, 부작용 최소화, 수확 및 사용 용이성 등의 장점이 있습니다. 그러나 일상적인 임상 환경에서 이러한 치료제를 사용하기 전에 이식 전후에 성장 특징을 확인하고 분리된 섬유아세포의 생물학적 기능과 안전성을 평가하기 위해 적절한 전임상 연구가 필요합니다. 따라서, 분리 과정 직후, 세...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well black clear flat bottom	BD Falcon	353219	32/case
Cell trace Violet Dye	Thermo Fischer Scientific	C34557	180 assays
CuteCell PRP	Regen Lab SA	CC-PRP-3T	3 tubes per package
DAPI	Sigma	D9542	1 mg
DMEM	Gibco	52400-025	500 mL
FBS	Gibco	10270106	500 mL
Glutamine 200 mM	Gibco	25030024	100 mL
Hematology Counter	Sysmex	KK-21N
Heparin 5000E Liquemine	Drossapharm AG		0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M	Gibco	15630-056	100 mL
Liberase DH	Roche	5401054001	2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x	Gibco	11140-035	100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL	Gibco	11360-039	100 mL
Penicillin streptomycin	Gibco	15140122	100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488	Molecular Probes	A12379	300 units
RPMI	Gibco	31966-021	500 mL
Trypsin 1x 0.25%	Gibco	25050-014	100 mL
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200056	100 mL