Produção de Plasma Autólogo Rico em Plaquetas para Impulsionar a Expansão In Vitro de Fibroblastos Humanos

Resumo

Este protocolo apresenta um dispositivo que produz PRP para impulsionar a expansão in vitro de células em um sistema de cultura de fibroblastos 100% autólogo.

Resumo

Atualmente, há grande interesse clínico no uso de fibroblastos autólogos para reparação cutânea. Na maioria dos casos, a cultura de células da pele in vitro é necessária. No entanto, a cultura celular usando meios de cultura xenogênicos ou alogênicos tem algumas desvantagens (i.e., risco de transmissão de agentes infecciosos ou expansão celular lenta). Aqui, um sistema de cultura autóloga é desenvolvido para a expansão de células de fibroblastos da pele humana in vitro usando o plasma rico em plaquetas (PRP) do próprio paciente. Os fibroblastos dérmicos humanos são isolados do paciente durante a abdominoplastia. As culturas são acompanhadas por até 7 dias usando um meio suplementado com soro fetal bovino (SFB) ou PRP. O conteúdo de células sanguíneas em preparações de PRP, proliferação e diferenciação de fibroblastos são avaliados. Este protocolo descreve o método para obter uma preparação padronizada e não ativada de PRP usando um dispositivo médico dedicado. A preparação requer apenas um dispositivo médico (CuteCell-PRP) e centrífuga. Este dispositivo é adequado sob condições de prática médica suficientes e é um sistema fechado de uma etapa, apirogênico e estéril que requer uma centrifugação única e suave de rotação de 1.500 x g por 5 minutos. Após a centrifugação, os componentes sanguíneos são separados e o plasma rico em plaquetas é facilmente coletado. Este dispositivo permite uma preparação rápida, consistente e padronizada de PRP que pode ser usado como um suplemento de cultura celular para expansão in vitro de células humanas. O PRP obtido aqui contém uma concentração plaquetária de 1,5 vezes em comparação com o sangue total em conjunto, com uma remoção preferencial de glóbulos vermelhos e brancos. Demonstrou-se que o PRP apresenta um efeito potencializador na proliferação celular em comparação com a SFB (7,7x) e que os fibroblastos são ativados no tratamento com PRP.

Introdução

A medicina regenerativa visa curar ou substituir tecidos e órgãos danificados pela idade, doença ou trauma, bem como corrigir defeitos congênitos. Na terapia autóloga, células ou tecidos são retirados de um paciente, expandidos ou modificados e, em seguida, reintroduzidos no doador. Essa forma terapêutica tem amplo potencial no campo da dermatologia¹. Na terapia autóloga de fibroblastos, os fibroblastos de um paciente são cultivados e reinjetados para tratar rugas, rítides ou cicatrizes de acne. Como os fibroblastos são as principais células funcionais da derme, a injeção de fibroblastos autólogos pode ser mais benéfica do que outras terapias no rejuvenescimento^facial2.

Na pele, os fibroblastos são responsáveis pela síntese e secreção de proteínas extracelulares (colágeno, elastina, ácido hialurônico e glicosaminoglicanos). Eles também liberam fatores de crescimento que regulam a função celular, migração e interações célula-matriz/célula-célula na homeostase normal da pele e cicatrização de feridas³. Os fibroblastos dérmicos já foram introduzidos como potencial terapia celular clínica para cicatrização de feridas^{cutâneas4, regeneração} tecidual5 ou preenchimentos dérmicos em procedimentos estéticos e de cirurgia^plástica6. Alguns estudos até sugerem que, no contexto da medicina regenerativa, os fibroblastos podem ser uma terapia celular mais prática e eficaz do que as células-tronco mesenquimais7.

Para obter um número suficiente de fibroblastos para aplicações clínicas, a expansão celular é geralmente obrigatória. A cultura de células ex vivo/in vitro requer meio basal suplementado com fatores de crescimento, proteínas e enzimas para apoiar a adesão e proliferação celular. O soro fetal bovino (SFB) é um suplemento comum para meios de cultura celular, pois o sangue fetal 1) é rico em fatores de crescimento em comparação com o sangue adulto e 2) apresenta baixo conteúdo de anticorpos⁸. À medida que a terapia celular progride, há preocupações sobre a segurança das condições clássicas de cultura de células nas quais a SFB é adicionada ao meio de cultura. Além disso, há uma tendência de substituir a SFB por alternativas⁹. Vários substitutos de FBS têm mostrado resultados promissores¹⁰.

A alternativa de plasma rico em plaquetas (PRP) foi selecionada aqui, e desenvolvemos um dispositivo médico para produzir uma preparação padronizada de PRP, denominada CuteCell-PRP. O uso pretendido deste dispositivo é a preparação de PRP autólogo para ser usado como um suplemento de meio de cultura para expansão in vitro de células autólogas sob condições de GMP.

O PRP é definido como uma suspensão concentrada de plaquetas no plasma. Como existem inúmeros protocolos de preparação, que diferem em 1) a quantidade de sangue necessária, 2) os tipos de dispositivos usados e 3) o protocolo de centrifugação, as concentrações plaquetárias resultantes variam de um pouco acima a mais de 10x o valor basal do sangue. Além disso, as preparações de PRP contêm níveis variáveis de contaminação de glóbulos vermelhos e brancos. A terminologia "PRP" é, portanto, usada para descrever produtos que variam muito em sua composição biológica e potenciais efeitos terapêuticos.

Na maioria dos estudos, a substituição da SFB é obtida usando diferentes concentrações de PRP que é ativado (por trombina ou cálcio). Essa ativação artificial provoca uma liberação imediata e importante de fatores de crescimento plaquetário de 15 min até 24 h¹¹. Portanto, acredita-se que a ativação plaquetária seja indesejável para aplicações em culturas celulares, nas quais a liberação lenta de fatores de crescimento a partir da degranulação plaquetária gradual é necessária.

A terapia com PRP envolve a preparação de plaquetas autólogas em plasma concentrado¹². A concentração plaquetária ideal não é clara, e uma ampla gama de dispositivos comerciais está disponível para preparar o PRP¹³. Essa falta de padronização decorre da inconsistência entre os estudos e levou a uma caixa preta em relação à dosagem e ao momento da injeção. Este protocolo descreve um procedimento para obtenção de PRP autólogo usando este dispositivo de PRP dedicado para expandir fibroblastos da pele em um modelo de cultura ex vivo 100% autóloga.

Protocolo

O protocolo do estudo seguiu a Declaração de Helsinque, e todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes de participarem do estudo. As amostras de pele são obtidas de mulheres saudáveis submetidas à abdominoplastia no Departamento de Cirurgia Plástica, Reconstrutiva e Estética dos Hospitais Universitários de Genebra (Genebra, Suíça). O procedimento está em conformidade com os princípios da Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo comitê de ética institucional local (protocolo #3126).

1. Elaboração do PRP

NOTA: Os tubos CuteCell-PRP (Tabela de Materiais) são projetados para a rápida preparação de PRP a partir de um pequeno volume de sangue do paciente em um sistema de circuito fechado.

1. Coleta de sangue total
   OBS: Colher sangue autólogo de uma veia periférica do braço utilizando agulha borboleta conectada diretamente ao tubo de PRP, conforme protocolo de coleta do instituto médico. O sangue pode ser retirado diretamente através da cânula venosa se o paciente estiver sob anestesia.
   1. Abra a embalagem blister do tubo. Realizar a punção venosa e preencher o número desejado de tubos de PRP com sangue total. O vácuo dentro dos tubos permitirá a coleta automática do volume necessário de sangue (~10 mL).
   2. Vire cuidadosamente os tubos de cabeça para baixo várias vezes para misturar o sangue com anticoagulante.
   3. Dentro de um gabinete de biossegurança (classe 2), remova 100 μL de sangue total usando uma seringa de 1 mL para contagens adicionais do número de células sanguíneas.
2. Centrifugação
   NOTA: Certifique-se de que a centrífuga está correctamente equilibrada antes de a iniciar.
   1. Uma vez que o sangue é coletado nos tubos de PRP, se necessário, prepare um tubo de contrapeso (fornecido separadamente) com água no mesmo nível que o sangue no tubo de PRP. Coloque os tubos cheios na centrífuga opostos uns aos outros, garantindo que a máquina esteja equilibrada.
   2. Centrifugar amostras a 1.500 x g por 5 min.
      NOTA: Defina a velocidade de rotação correspondente de acordo com as instruções do fabricante da centrífuga. Após a centrifugação, o sangue será fracionado. Os glóbulos vermelhos e brancos ficam presos sob o gel, e as plaquetas se depositam na superfície do gel (Figura 1).
3. Inverter suavemente o tubo de PRP 20x para ressuspender o depósito plaquetário no sobrenadante plasmático.
   NOTA: Certifique-se de que as plaquetas estão totalmente separadas do gel. O plasma deve mudar de claro e transparente para turvo. Se houver agregados plaquetários, eles devem ser coletados com o plasma.
4. Para coletar o PRP, retire a solução de plasma do tubo usando um dispositivo de transferência de seringa conectado a uma seringa de 10 mL.
   OBS: Cerca de 5 mL de PRP serão obtidos de cada tubo. A solução de PRP está agora pronta para misturar na preparação final do meio. A solução pode ser mantida à temperatura ambiente (RT) sob o gabinete de segurança até as etapas futuras envolvendo analisador hematológico e uso.
5. Antes de usar o PRP, determinar a concentração plaquetária, o volume plaquetário médio e o número de hemácias e leucócitos usando um analisador hematológico automatizado (Tabela de material). Para isso, retire cuidadosamente 100 μL da solução e transfira para um tubo de 1,5 mL.
   NOTA: PRP é usado como um suplemento de cultura autóloga em uma concentração entre 5-20% v/v. A concentração ótima de PRP precisa ser determinada para cada linhagem celular. Para prevenir a formação de coágulos de fibrina, o meio de cultura final deve ser suplementado com 2 U/mL de heparina.

2. Isolamento de fibroblastos autólogos e cultura em meio suplementado com SFB ou PRP

1. Lavar as amostras de pele em solução salina tamponada com fosfato (PBS) agitando suavemente em um tubo de polipropileno de 50 mL.
2. Se a amostra de pele for relativamente grande (>10 cm 2), coloque a amostra na tampa de uma placa de cultura de tecidos de 150 cm² (lado epidérmico para baixo). Remova o tecido adiposo subcutâneo usando uma pinça e tesoura. Para evitar que o tecido seque, lave o tecido a cada poucos minutos em PBS.
   NOTA: Use placa de cultura de tecido menor para amostras menores.
3. Quando o corte de gordura estiver completo, corte o tecido em tiras de aproximadamente 0,5 cm x 1,5 cm usando um bisturi estéril.
4. Adicionar 5 mL de mistura colagenase-dispase (Tabela de Materiais; 14 unidades Wünsch/mL) a um tubo estéril de 15 mL.
5. Transfira o tecido cortado para o tubo, garantindo que os pedaços de tecido estejam submersos na solução. Tampe o tubo com segurança.
6. Colocar os tubos numa incubadora a 37 °C com agitação orbital durante 150 minutos. Após a incubação, coloque o tubo contendo o tecido no armário de biossegurança.
7. Coloque a tampa de uma placa de cultura estéril de 100 mm de cabeça para baixo no armário de biossegurança. Transfira a solução de tecido digerido para o fundo da placa de cultura de 100 mm, sem respingos. Se algum pedaço de tecido permanecer no tubo, use uma pipeta estéril de 1 mL ou pinça estéril para transferir os pedaços de tecido para o fundo da placa de cultura de 100 mm.
8. Com a tira da epiderme voltada para cima, separe a lâmina de epiderme intacta da derme usando dois pares de pinças. Segure a derme da tira de tecido com um par de pinças e a borda da epiderme com outro par de pinças. Descasque a derme e a epiderme em dois pedaços, mantendo os pedaços separados na mesma tampa. Tente realizar essa etapa rapidamente e repita a manipulação para cada pedaço de tecido.
9. Transfira as peças dérmicas para uma nova placa de cultura de 100 mm contendo PBS.
10. Com pinça de laboratório, colocar as peças dérmicas em tubo de polipropileno de 15 mL com 3 mL de tripsina/PBS a 0,3%. Incubar durante 10-20 minutos em banho-maria a 37 °C e inverter o tubo várias vezes a cada 2-3 minutos.
11. Para interromper a reação enzimática, adicione 3 a 5 mL de meio de crescimento completo gelado (meio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM] ou RPMI contendo 10% de FBS). Vórtice o tubo vigorosamente várias vezes. Filtrar a suspensão de fibroblastos através de uma tela de náilon de 85 μm (colocada sobre o topo de um tubo de 50 mL) para remover detritos dérmicos.
12. Centrifugar durante 10 min a 150 x g, a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 100−1.000 μL de meio de crescimento completo.
13. Usando azul de tripano (fator de diluição de x2) misturado com a suspensão celular, conte o número de células totais e viáveis preenchendo a câmara do hemocitômetro.
    NOTA: A viabilidade celular depende das condições utilizadas para a digestão enzimática. Para aumentar a recuperação celular e a viabilidade celular, a amostra de pele pode ser cortada em pedaços menores.
14. Placa 3−10 x 10⁴ células em 5 mL de meio de cultura completo de SFB (DMEM, 10% de FBS inativado termicamente por 60 min a 56 °C, solução tampão 1% M HEPES, mistura de aminoácidos não essenciais 1% 100x, 1% 100x L-glutamina, 1% 100x penicilina/estreptomicina, 1% 100x piruvato de sódio) em um frasco de cultura de tecidos^{25 cm2} . Incubar a 37 °C.
    NOTA: Os fibroblastos viáveis fixam-se ao frasco dentro de 24 h e começam a exibir a forma fusiforme em 2-3 dias.
15. No dia 2, aspirar o meio contendo células não aderentes e adicionar meio fresco.
    NOTA: Como as células mortas no meio de cultura afetam o crescimento de fibroblastos viáveis, as células mortas não aderentes devem ser removidas da cultura.
16. Troque o meio a cada 3−4 dias até que a cultura atinja 70−80% de confluência.
17. Para colher fibroblastos, lavar com PBS e incubar com solução de tripsina/EDTA por 3 min a 37 °C na incubadora.
18. Para parar a reação, adicione 3 a 5 mL de meio de crescimento completo morno (DMEM ou RPMI contendo 10% de FBS). Tome uma alíquota da suspensão celular para contar as células com o hemocitômetro. Centrifugar a suspensão por 5 min a 200 x g e retirar o meio por aspiração.
19. Cultura do fibroblasto em meio PRP (DMEM, PRP 20%, tampão HEPES 1% 1M, mistura de aminoácidos não essenciais 100x 1%, L-glutamina 100x, penicilina/estreptomicina 100x, piruvato de sódio 100x 1%, heparina 2U/mL) na incubadora a 37 °C.
    NOTA: A densidade celular mínima recomendada é de 4.000 células viáveis/cm².
20. Para avaliar os efeitos do PRP sobre a proliferação fibroblástica, foram utilizados fibroblastos de sementes (passagem 2) em placas de 24 poços a uma densidade de 8 x 10³ células por poço em meio de PRP com diferentes concentrações de PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50%) e com 2 U/mL de heparina ou em condições clássicas de meio de cultura (10% SFB). Após 7 dias de cultivo, adicionar um corante vital (violeta de proliferação celular) às células e avaliar a proliferação por citometria de fluxo.
21. Para estudar rearranjos citoesqueléticos, as células de sementes em 96 placas de fundo plano bem preto/claro a uma concentração de 1 x 10⁵ células/mL em DMEM de crescimento completo de FBS (ver etapa 2.14) suplementadas com 0,5% de FBS por 24 horas. Tratar as células com SFB a 10% ou diferentes concentrações de PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50%) por 7 dias.
    1. Fixar os fibroblastos com paraformaldeído a 4% por 10 min e permeabilizar com Triton X-100 a 0,1% por 5 min na RT. Manchar os fibroblastos com 50 mL de faloidina 5 U/mL, lavar 2x com PBS e marcar com 50 mL de 1 mg/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 5 min. Cytation 3 cell imaging multimode reader (BioTek) foi usado para visualizar a coloração de faloidina.

Resultados

Esta tecnologia patenteada é um dispositivo médico simples, rápido e reprodutível usado para produzir preparações padronizadas de PRP. É um sistema de uma etapa, totalmente fechado, que permite a preparação do PRP a partir do sangue total venoso após 5 min de centrifugação a 1.500 x g (devido à tecnologia de gel separador). O PRP obtido após a centrifugação é eliminado dos glóbulos vermelhos e brancos, que ficam abaixo do gel. Após várias inversões tubárias, as plaquetas que estão em cima ...

Discussão

As vantagens do uso de fibroblastos autólogos como uma alternativa natural em comparação com outros materiais de preenchimento na terapia celular de feridas incluem boa biocompatibilidade, efeitos colaterais mínimos e facilidade de coleta e uso. No entanto, antes de usar essas terapêuticas em um ambiente clínico diário, estudos pré-clínicos adequados são necessários para identificar as características de crescimento e avaliar a função biológica e a segurança dos fibroblastos isolados antes e após o trans...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well black clear flat bottom	BD Falcon	353219	32/case
Cell trace Violet Dye	Thermo Fischer Scientific	C34557	180 assays
CuteCell PRP	Regen Lab SA	CC-PRP-3T	3 tubes per package
DAPI	Sigma	D9542	1 mg
DMEM	Gibco	52400-025	500 mL
FBS	Gibco	10270106	500 mL
Glutamine 200 mM	Gibco	25030024	100 mL
Hematology Counter	Sysmex	KK-21N
Heparin 5000E Liquemine	Drossapharm AG		0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M	Gibco	15630-056	100 mL
Liberase DH	Roche	5401054001	2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x	Gibco	11140-035	100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL	Gibco	11360-039	100 mL
Penicillin streptomycin	Gibco	15140122	100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488	Molecular Probes	A12379	300 units
RPMI	Gibco	31966-021	500 mL
Trypsin 1x 0.25%	Gibco	25050-014	100 mL
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200056	100 mL