Producción de plasma autólogo rico en plaquetas para impulsar la expansión in vitro de fibroblastos humanos

Resumen

Este protocolo presenta un dispositivo que produce PRP para impulsar la expansión in vitro de las células en un sistema de cultivo de fibroblastos 100% autólogo.

Resumen

Actualmente existe un gran interés clínico en el uso de fibroblastos autólogos para la reparación de la piel. En la mayoría de los casos, se requiere el cultivo de células de la piel in vitro. Sin embargo, el cultivo celular que utiliza medios de cultivo xenogénicos o alogénicos tiene algunas desventajas (es decir, riesgo de transmisión de agentes infecciosos o expansión celular lenta). Aquí, se desarrolla un sistema de cultivo autólogo para la expansión de células de fibroblastos de la piel humana in vitro utilizando el propio plasma rico en plaquetas (PRP) del paciente. Los fibroblastos dérmicos humanos se aíslan del paciente mientras se somete a una abdominoplastia. Los cultivos se siguen durante un máximo de 7 días utilizando un medio suplementado con suero bovino fetal (FBS) o PRP. Se evalúa el contenido de células sanguíneas en las preparaciones de PRP, la proliferación y la diferenciación de fibroblastos. Este protocolo describe el método para obtener una preparación estandarizada y no activada de PRP utilizando un dispositivo médico dedicado. La preparación requiere solo un dispositivo médico (CuteCell-PRP) y una centrífuga. Este dispositivo es adecuado en condiciones de práctica médica suficientes y es un sistema cerrado de un solo paso, apirogénico y estéril que requiere una sola centrifugación de centrifugación de centrifugación suave de 1.500 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, los componentes sanguíneos se separan y el plasma rico en plaquetas se recoge fácilmente. Este dispositivo permite una preparación rápida, consistente y estandarizada de PRP que se puede utilizar como un suplemento de cultivo celular para la expansión in vitro de células humanas. El PRP obtenido aquí contiene una concentración de plaquetas de 1,5 veces en comparación con la sangre total junta, con una eliminación preferencial de glóbulos rojos y blancos. Está demostrado que el PRP presenta un efecto potenciador en la proliferación celular en comparación con FBS (7.7x) y que los fibroblastos se activan con el tratamiento con PRP.

Introducción

La medicina regenerativa tiene como objetivo curar o reemplazar tejidos y órganos dañados por la edad, enfermedad o trauma, así como corregir defectos congénitos. En la terapia autóloga, las células o tejidos se extraen de un paciente, se expanden o modifican, y luego se vuelven a introducir al donante. Esta forma de terapéutica tiene un amplio potencial en el campo de la dermatología¹. En la terapia con fibroblastos autólogos, los fibroblastos de un paciente se cultivan y se reinyectan para tratar arrugas, arrugas o cicatrices de acné. Como los fibroblastos son las principales células funcionales de la dermis, la inyección de fibroblastos autólogos puede ser más beneficiosa que otras terapias en el rejuvenecimiento facial².

En la piel, los fibroblastos son responsables de la síntesis y secreción de proteínas extracelulares (es decir, colágeno, elastina, ácido hialurónico y glicosaminoglicanos). También liberan factores de crecimiento que regulan la función celular, la migración y las interacciones célula-matriz / célula-célula en la homeostasis normal de la piel y la cicatrización de heridas³. Los fibroblastos dérmicos ya se han introducido como una terapia celular clínica potencial para la cicatrización de heridas cutáneas⁴, la regeneración tisular⁵ o los rellenos dérmicos en procedimientos estéticos y de cirugía plástica⁶. Algunos estudios incluso sugieren que, en el contexto de la medicina regenerativa, los fibroblastos pueden ser una terapia celular más práctica y efectiva que las células madre mesenquimales⁷.

Para obtener un número suficiente de fibroblastos para aplicaciones clínicas, la expansión celular suele ser obligatoria. El cultivo celular ex vivo/in vitro requiere un medio basal suplementado con factores de crecimiento, proteínas y enzimas para apoyar la adhesión y proliferación celular. El suero fetal bovino (FBS) es un suplemento común para medios de cultivo celular, porque la sangre fetal 1) es rica en factores de crecimiento en comparación con la sangre adulta y 2) presenta un bajo contenido de anticuerpos⁸. A medida que avanza la terapia celular, existen preocupaciones sobre la seguridad de las condiciones clásicas de cultivo celular en las que se agrega FBS al medio de cultivo. Además, ahora hay una tendencia a reemplazar FBS con alternativas⁹. Varios sustitutos de FBS han mostrado resultados prometedores¹⁰.

La alternativa de plasma rico en plaquetas (PRP) ha sido seleccionada aquí, y hemos desarrollado un dispositivo médico para producir una preparación estandarizada de PRP, llamado CuteCell-PRP. El uso previsto de este dispositivo es la preparación de PRP autólogo para ser utilizado como un suplemento de medios de cultivo para la expansión in vitro de células autólogas en condiciones GMP.

El PRP se define como una suspensión plaquetaria concentrada en plasma. Debido a que existen numerosos protocolos de preparación, que difieren en 1) la cantidad de sangre necesaria, 2) los tipos de dispositivos utilizados y 3) el protocolo de centrifugación, las concentraciones de plaquetas resultantes varían de ligeramente por encima a más de 10 veces el valor basal de la sangre. Además, las preparaciones de PRP contienen niveles variables de contaminación de glóbulos rojos y blancos. Por lo tanto, la terminología "PRP" se utiliza para describir productos que varían mucho en su composición biológica y posibles efectos terapéuticos.

En la mayoría de los estudios, la sustitución de FBS se logra utilizando diferentes concentraciones de PRP que se activa (por trombina o calcio). Esta activación artificial provoca una liberación inmediata e importante de factores de crecimiento plaquetario desde 15 min hasta 24 h¹¹. Por lo tanto, se cree que la activación plaquetaria es indeseable para aplicaciones en cultivos celulares, en los que se requiere la liberación lenta de factores de crecimiento a partir de la desgranulación plaquetaria gradual.

La terapia PRP implica la preparación de plaquetas autólogas en plasma concentrado¹². La concentración óptima de plaquetas no está clara, y hay una amplia gama de dispositivos comerciales disponibles para preparar PRP¹³. Esta falta de estandarización se debe a la inconsistencia entre los estudios y ha llevado a una caja negra con respecto a la dosis y el momento de la inyección. Este protocolo describe un procedimiento para obtener PRP autólogo utilizando este dispositivo PRP dedicado para expandir fibroblastos de la piel en un modelo de cultivo ex vivo 100% autólogo.

Protocolo

El protocolo del estudio cumplió con la Declaración de Helsinki, y todos los pacientes proporcionaron su consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio. Se obtienen muestras de piel de mujeres sanas sometidas a abdominoplastia en el Departamento de Cirugía Plástica, Reconstructiva y Estética de los Hospitales Universitarios de Ginebra (Ginebra, Suiza). El procedimiento se ajusta a los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité de ética institucional local (protocolo #3126).

1. Preparación del PRP

NOTA: Los tubos CuteCell-PRP (Tabla de materiales) están diseñados para la preparación rápida de PRP a partir de un pequeño volumen de sangre del paciente en un sistema de circuito cerrado.

1. Recolección de sangre total
   NOTA: Recolecte sangre autóloga de una vena periférica del brazo utilizando una aguja de mariposa conectada directamente al tubo PRP, de acuerdo con el protocolo de recolección del instituto médico. La sangre se puede extraer directamente a través de la cánula venosa si el paciente está bajo anestesia.
   1. Abra el blíster tubular. Realice la punción venosa y llene el número deseado de tubos de PRP con sangre entera. El vacío dentro de los tubos permitirá la recolección automática del volumen necesario de sangre (~ 10 ml).
   2. Gire cuidadosamente los tubos boca abajo varias veces para mezclar la sangre con anticoagulante.
   3. Dentro de un gabinete de bioseguridad (clase 2), extraiga 100 μL de sangre total total usando una jeringa de 1 ml para obtener más recuentos de células sanguíneas.
2. Centrifugación
   NOTA: Asegúrese de que la centrífuga esté correctamente equilibrada antes de iniciarla.
   1. Una vez que la sangre se recoge en los tubos de PRP, si es necesario, prepare un tubo de contrapeso (suministrado por separado) con agua al mismo nivel que la sangre en el tubo de PRP. Coloque los tubos llenos en la centrífuga uno frente al otro, asegurándose de que la máquina esté equilibrada.
   2. Centrifugar muestras a 1.500 x g durante 5 min.
      NOTA: Ajuste la velocidad de rpm correspondiente de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la centrífuga. Después de la centrifugación, la sangre se fraccionará. Los glóbulos rojos y blancos quedan atrapados debajo del gel, y las plaquetas se depositan en la superficie del gel (Figura 1).
3. Invierta suavemente el tubo de PRP 20x para resuspender el depósito de plaquetas en el sobrenadante plasmático.
   NOTA: Asegúrese de que las plaquetas estén completamente separadas del gel. El plasma debe cambiar de claro y transparente a turbio. Si hay agregados plaquetarios, deben recogerse con el plasma.
4. Para recolectar PRP, tome la solución plasmática del tubo usando un dispositivo de transferencia de jeringa conectado a una jeringa de 10 ml.
   NOTA: Se obtendrán aproximadamente 5 ml de PRP de cada tubo. La solución PRP ahora está lista para mezclar en la preparación final del medio. La solución se puede mantener a temperatura ambiente (RT) debajo del gabinete de seguridad hasta los pasos futuros que involucran el analizador de hematología y el uso.
5. Antes de usar el PRP, determine la concentración de plaquetas, el volumen medio de plaquetas y el número de glóbulos rojos y blancos utilizando un analizador hematológico automatizado (Tabla de materiales). Para ello, retire con cuidado 100 μL de la solución y transfiérala a un tubo de 1,5 ml.
   NOTA: El PRP se utiliza como suplemento de cultivo autólogo a una concentración entre 5-20% v/v. La concentración óptima de PRP debe determinarse para cada línea celular. Para prevenir la formación de coágulos de fibrina, los medios de cultivo finales deben complementarse con 2 U/ml de heparina.

2. Aislamiento de fibroblastos autólogos y cultivo en medios suplementados con FBS o PRP

1. Lave las muestras de piel en solución salina tamponada con fosfato (PBS) agitando suavemente en un tubo de polipropileno de 50 ml.
2. Si la muestra de piel es relativamente grande (>10 cm 2), coloque la muestra en la tapa de una placa de cultivo de tejido de 150 cm² (lado epidérmico hacia abajo). Retire el tejido graso subcutáneo con un par de fórceps y tijeras. Para evitar que el tejido se seque, enjuague el tejido cada pocos minutos en PBS.
   NOTA: Utilice una placa de cultivo de tejidos más pequeña para muestras más pequeñas.
3. Cuando se complete el recorte de grasa, corte el tejido en tiras de aproximadamente 0,5 cm x 1,5 cm con un bisturí estéril.
4. Agregue 5 ml de mezcla de colagenasa-dispasa (tabla de materiales; 14 unidades de Wünsch/ml) a un tubo estéril de 15 ml.
5. Transfiera el tejido cortado al tubo, asegurándose de que las piezas de tejido se sumerjan en la solución. Tapa el tubo de forma segura.
6. Colocar los tubos en una incubadora a 37 °C con agitación orbital durante 150 min. Después de la incubación, coloque el tubo que contiene el tejido en el gabinete de bioseguridad.
7. Coloque la tapa de una placa de cultivo estéril de 100 mm boca abajo en el gabinete de bioseguridad. Transfiera la solución de tejido digerido al fondo de la placa de cultivo de 100 mm, sin salpicaduras. Si queda algún pedazo de tejido en el tubo, use una pipeta estéril de 1 ml o pinzas estériles para transferir las piezas de tejido al fondo de la placa de cultivo de 100 mm.
8. Con la tira de la epidermis hacia arriba, separe la hoja de epidermis intacta de la dermis usando dos pares de fórceps. Sostenga la dermis de la tira de tejido con un par de fórceps y el borde de la epidermis con otro par de fórceps. Separe la dermis y la epidermis en dos piezas, manteniendo las piezas separadas en la misma tapa. Intente realizar este paso rápidamente y repita la manipulación para cada pieza de tejido.
9. Transfiera las piezas dérmicas a una nueva placa de cultivo de 100 mm que contenga PBS.
10. Usando pinzas de laboratorio, coloque las piezas dérmicas en un tubo de polipropileno de 15 ml con 3 ml de tripsina/PBS al 0,3%. Incubar durante 10-20 min en un baño maría a 37 °C e invertir el tubo varias veces cada 2-3 min.
11. Para detener la reacción enzimática, agregue 3-5 ml de medio de crecimiento completo helado (medio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM] o RPMI que contiene 10% de FBS). Vortex el tubo vigorosamente varias veces. Filtre la suspensión de fibroblastos a través de una malla de nylon de 85 μm (colocada sobre la parte superior de un tubo de 50 ml) para eliminar los residuos dérmicos.
12. Centrifugar durante 10 min a 150 x g, a 4 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100−1.000 μL de medio de crecimiento completo.
13. Usando azul de tripano (factor de dilución de x2) mezclado con la suspensión celular, contar el número de células totales y viables llenando la cámara del hemocitómetro.
    NOTA: La viabilidad celular depende de las condiciones utilizadas para la digestión enzimática. Para aumentar la recuperación celular y la viabilidad celular, la muestra de piel se puede cortar en trozos más pequeños.
14. Placa 3−10 x 10⁴ células en 5 ml de medio de cultivo completo de FBS (DMEM, 10% FBS inactivado térmicamente durante 60 min a 56 °C, solución tampón HEPES 1% 1 M, mezcla de aminoácidos no esenciales 100x 100x, 1% L-glutamina 100x, 1% 100x penicilina/estreptomicina, 1% piruvato sódico 100x) en un matraz de cultivo tisular de 25 cm² . Incubar a 37 °C.
    NOTA: Los fibroblastos viables se adherirán al matraz dentro de las 24 h y comenzarán a exhibir la forma del huso en 2-3 días.
15. En el día 2, aspirar el medio que contiene células no adherentes y añadir medio fresco.
    NOTA: Como las células muertas en el medio de cultivo afectan el crecimiento de fibroblastos viables, las células muertas no adherentes deben eliminarse del cultivo.
16. Cambiar el medio cada 3−4 días hasta que el cultivo alcance el 70−80% de confluencia.
17. Para cosechar fibroblastos, lavar con PBS e incubar con solución de tripsina/EDTA durante 3 min a 37 °C en la incubadora.
18. Para detener la reacción, agregue 3-5 ml de medio de crecimiento completo caliente (DMEM o RPMI que contiene 10% de FBS). Tomar una alícuota de la suspensión celular para contar las células con el hemocitómetro. Centrifugar la suspensión durante 5 min a 200 x g y retirar el medio por aspiración.
19. Cultivar el fibroblasto en medio PRP (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M solución tampón HEPES, 1% 100x mezcla de aminoácidos no esenciales, 1% 100x L-glutamina, 1% 100x penicilina/estreptomicina, 1% 100x piruvato de sodio, 2 U/ml de heparina) en la incubadora a 37 °C.
    NOTA: La densidad celular mínima recomendada es de 4.000 células viables/^cm2.
20. Evaluar los efectos del PRP sobre la proliferación de fibroblastos, fibroblastos de semilla (paso 2) en 24 placas de pocillos a una densidad de 8 x 10³ células por pocillo en medio de PRP con diferentes concentraciones de PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% y 50%) y con 2 U/ml de heparina o en condiciones de medio de cultivo clásico (10% FBS). Después de 7 días de cultivo, añadir un colorante vital (proliferación celular violeta) a las células y evaluar la proliferación por citometría de flujo.
21. Para estudiar los reordenamientos citoesqueléticos, las células semilla en 96 placas de fondo plano bien negro/claro a una concentración de 1 x 10 5 células/ml en DMEM de crecimiento FBS completo (ver paso 2.14) suplementadas con FBS al^0,5 % durante 24 h. Trate las células con 10% de FBS o diferentes concentraciones de PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% y 50%) durante 7 días.
    1. Fijar los fibroblastos con paraformaldehído al 4% durante 10 min y permeabilizar con Triton X-100 al 0,1% durante 5 min en RT. Colorear los fibroblastos con 50 mL de faloidina 5 U/mL, lavar 2x con PBS y marcar con 50 mL de 1 mg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 min. Se utilizó el lector multimodo de imágenes celulares de 3 células de citación (BioTek) para visualizar la tinción de faloidina.

Resultados

Esta tecnología patentada es un dispositivo médico simple, rápido y reproducible utilizado para producir preparaciones estandarizadas de PRP. Es un sistema de un solo paso, totalmente cerrado, que permite la preparación de PRP a partir de sangre total venosa después de 5 min de centrifugación a 1.500 x g (debido a la tecnología de gel separador). El PRP obtenido después de la centrifugación se elimina de los glóbulos rojos y blancos, que se encuentran debajo del gel. Después de varias inversiones del ...

Discusión

Las ventajas de usar fibroblastos autólogos como una alternativa natural en comparación con otros materiales de relleno en la terapia celular de heridas incluyen una buena biocompatibilidad, efectos secundarios mínimos y facilidad de recolección y uso. Sin embargo, antes de usar estas terapias en un entorno clínico diario, se necesitan estudios preclínicos adecuados para identificar las características de crecimiento y evaluar la función biológica y la seguridad de los fibroblastos aislados tanto antes como desp...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well black clear flat bottom	BD Falcon	353219	32/case
Cell trace Violet Dye	Thermo Fischer Scientific	C34557	180 assays
CuteCell PRP	Regen Lab SA	CC-PRP-3T	3 tubes per package
DAPI	Sigma	D9542	1 mg
DMEM	Gibco	52400-025	500 mL
FBS	Gibco	10270106	500 mL
Glutamine 200 mM	Gibco	25030024	100 mL
Hematology Counter	Sysmex	KK-21N
Heparin 5000E Liquemine	Drossapharm AG		0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M	Gibco	15630-056	100 mL
Liberase DH	Roche	5401054001	2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x	Gibco	11140-035	100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL	Gibco	11360-039	100 mL
Penicillin streptomycin	Gibco	15140122	100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488	Molecular Probes	A12379	300 units
RPMI	Gibco	31966-021	500 mL
Trypsin 1x 0.25%	Gibco	25050-014	100 mL
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200056	100 mL