in vitroヒト線維芽細胞増殖を促進するための自己多血小板血漿の産生

要約

このプロトコルは、100%自家線維芽細胞培養システムにおける細胞のin vitro増殖を促進するためにPRPを産生するデバイスを提示します。

要約

現在、皮膚修復のための自家線維芽細胞の使用に大きな臨床的関心があります。ほとんどの場合、インビトロでの皮膚細胞の培養が必要です。しかしながら、異種異系または同種異系培養培地を用いた細胞培養には、いくつかの欠点(すなわち、感染因子の伝播または遅い細胞増殖のリスク)がある。ここでは、患者自身の多血小板血漿(PRP)を用いて、in vitroでヒト皮膚線維芽細胞を増殖させるための自家培養系が開発されています。ヒト皮膚線維芽細胞は、腹部形成術を受けている間に患者から分離される。培養は、ウシ胎児血清(FBS)またはPRPのいずれかを添加した培地を使用して最大7日間追跡されます。PRP製剤中の血球含有量、増殖、および線維芽細胞の分化が評価されます。このプロトコルは、専用の医療機器を使用してPRPの標準化された活性化されていない製剤を得るための方法を説明しています。調製に必要なのは医療機器(CuteCell-PRP)と遠心分離機のみです。この装置は、十分な医療行為条件下で適しており、1,500 x g の単一のソフトスピン遠心分離を5分間必要とするワンステップ、非発熱性、および滅菌閉鎖システムです。遠心分離後、血液成分が分離され、多血小板血漿が容易に収集されます。このデバイスは、ヒト細胞のin vitro増殖のための細胞培養サプリメントとして使用できるPRPの迅速で一貫性のある標準化された調製を可能にします。ここで得られたPRPは、全血と比較して1.5倍の血小板濃度を含み、赤血球と白血球を優先的に除去します。PRPはFBSと比較して細胞増殖の促進効果(7.7倍)を示し、PRP処理により線維芽細胞が活性化することが示されています。

概要

再生医療は、加齢や病気、外傷などによって傷ついた組織や臓器を治癒・置換し、先天性欠損症を矯正することを目的としています。自家療法では、細胞または組織は患者から引き出され、拡張または修飾され、その後ドナーに再導入されます。この治療法は、皮膚科の分野で幅広い可能性を秘めています¹。自家線維芽細胞療法では、患者の線維芽細胞を培養して再注入し、しわ、鼻水、またはにきびの傷跡を治療します。線維芽細胞は真皮の主要な機能細胞であるため、自家線維芽細胞の注射は、顔の若返りにおいて他の治療法よりも有益である可能性があります²。

皮膚では、線維芽細胞は細胞外タンパク質(すなわち、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、およびグリコサミノグリカン)の合成と分泌に関与しています。また、正常な皮膚恒常性と創傷治癒において、細胞機能、遊走、細胞-マトリックス/細胞-細胞相互作用を調節する成長因子を放出します³。皮膚線維芽細胞は、皮膚創傷治癒⁴、組織再生⁵、または審美的および形成外科手術における皮膚充填剤⁶の潜在的な臨床細胞療法としてすでに導入されています。いくつかの研究は、再生医療の文脈では、線維芽細胞が間葉系幹細胞よりも実用的で効果的な細胞療法である可能性があることを示唆しています⁷。

臨床応用に十分な数の線維芽細胞を得るためには、通常、細胞増殖が必須である。Ex vivo/in vitro細胞培養には、細胞の接着と増殖をサポートするために、成長因子、タンパク質、酵素を添加した基礎培地が必要です。ウシ胎児血清(FBS)は、胎児の血液が成人の血液と比較して成長因子が豊富であり、2)抗体含有量が低いため、細胞培養培地の一般的なサプリメントです⁸。細胞治療が進むにつれて、FBSを培地に添加する古典的な細胞培養条件の安全性が懸念される。さらに、現在、FBSを代替^案9に置き換える傾向があります。いくつかのFBS代替品は有望な結果を示しています¹⁰。

ここでは多血小板血漿(PRP)の代替品を選択し、CuteCell-PRPと名付けられたPRPの標準化された製剤を製造するための医療機器を開発しました。この装置の使用目的は、GMP条件下での自家細胞のin vitro増殖のための培地サプリメントとして使用される自家PRPの調製である。

PRPは、血漿中の濃縮血小板懸濁液として定義される。1)必要な血液量、2)使用するデバイスの種類、および3)遠心分離プロトコルが異なる多数の準備プロトコルがあるため、結果として得られる血小板濃度は、血液ベースライン値のわずかに上から10倍以上まで変化します。さらに、PRP製剤には、さまざまなレベルの赤血球および白血球汚染が含まれています。したがって、「PRP」という用語は、生物学的組成および潜在的な治療効果が大きく異なる製品を説明するために使用されます。

ほとんどの研究では、FBS置換は、(トロンビンまたはカルシウムによって)活性化される異なる濃度のPRPを使用して達成されます。この人工的な活性化は、血小板成長因子の即時かつ重要な放出を15分から24時間¹¹まで誘発する。したがって、血小板活性化は、段階的な血小板脱顆粒からの成長因子の徐放が必要とされる細胞培養における用途には望ましくないと考えられている。

PRP療法には、濃縮血漿中の自家血小板の調製が含まれます¹²。最適な血小板濃度は不明であり、PRP¹³を調製するために幅広い商用デバイスが利用可能です。この標準化の欠如は、研究間の不一致に起因し、注射の投与量とタイミングに関するブラックボックスにつながっています。このプロトコルは、この専用PRPデバイスを使用して自家PRPを取得し、100%自家ex vivo培養モデルにおいて皮膚線維芽細胞を拡張する手順を説明する。

プロトコル

研究プロトコルはヘルシンキ宣言に準拠しており、すべての患者は研究に参加する前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。皮膚サンプルは、ジュネーブ大学病院(スイス、ジュネーブ)の形成外科、再建外科、美容外科で腹部形成術を受けている健康な女性から得られます。この手順はヘルシンキ宣言の原則に準拠しており、地元の制度倫理委員会(プロトコル#3126)によって承認されました。

1. PRPの準備

注:CuteCell-PRPチューブ(材料表)は、閉回路システムで少量の患者の血液からPRPを迅速に調製するように設計されています。

1. 全血の採取
   注:医療機関の収集プロトコルに従って、PRPチューブに直接接続されたバタフライニードルを使用して、腕の末梢静脈から自己血を採取します。患者が麻酔下にある場合、血液は静脈カニューレを通して直接採取することができます。
   1. チューブブリスターパックを開きます。静脈穿刺を行い、所望の数のPRPチューブを全血で満たす。チューブ内の真空により、必要な量の血液(~10mL)を自動的に採取することができます。
   2. チューブを数回慎重に逆さまにして、血液を抗凝固剤と混合します。
   3. バイオセーフティキャビネット(クラス2)内で、1 mLシリンジを使用して100 μLの総全血を除去し、さらに血球数をカウントします。
2. 遠心分離
   注意: 遠心分離機を起動する前に、遠心分離機のバランスが正しく取れていることを確認してください。
   1. PRPチューブに血液を採取したら、必要に応じて、PRPチューブ内の血液と同じレベルの水でカウンターバランスチューブ(別売り)を準備します。充填されたチューブを互いに反対側の遠心分離機に配置し、機械のバランスが取れていることを確認します。
   2. サンプルを1,500 x g で5分間遠心分離します。
      注意: 遠心分離機の製造元の指示に従って、対応するrpm速度を設定してください。遠心分離後、血液は分画されます。赤血球と白血球はゲルの下に閉じ込められ、血小板はゲルの表面に定着します(図1)。
3. PRPチューブを20倍静かに反転させて、血漿上清中の血小板沈着物を再懸濁する。
   注意: 血小板がゲルから完全に剥離していることを確認してください。プラズマは透明で透明から濁った状態に変化するはずです。血小板凝集体が存在する場合は、血漿とともに収集する必要があります。
4. PRPを収集するには、10 mLシリンジに接続されたシリンジ移送装置を使用して、チューブから血漿溶液を取り出します。
   注:各チューブから約5mLのPRPが得られます。これで、PRP溶液は最終的な培地調製で混合する準備が整いました。溶液は、血液分析装置と使用を含む将来のステップまで、安全キャビネットの下で室温(RT)に保つことができます。
5. PRPを使用する前に、自動血液分析装置を使用して、血小板濃度、平均血小板量、および赤血球と白血球の数を決定します(資料表)。これを行うには、100 μLの溶液を慎重に引き出し、1.5 mLチューブに移します。
   注:PRPは、5〜20%v / vの濃度で自家培養サプリメントとして使用されます。PRPの最適濃度は、細胞株ごとに決定する必要があります。フィブリン血餅の形成を防ぐために、最終培地に2 U/mLのヘパリンを補充する必要があります。

2. FBSまたはPRP添加培地における自家線維芽細胞の単離および培養

1. 50 mLのポリプロピレンチューブで軽く振とうして、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で皮膚サンプルを洗浄します。
2. 皮膚サンプルが比較的大きい(>10cm2)場合は、サンプルを150cm2の組織培養皿の蓋(表皮側を下にして)に置く。鉗子とはさみを使用して皮下脂肪組織を取り除きます。組織が乾燥するのを防ぐために、PBSで数分ごとに組織を洗い流してください。
   注:小さなサンプルには、より小さな組織培養皿を使用してください。
3. 脂肪のトリミングが完了したら、滅菌メスを使用して組織を約0.5 cm x 1.5 cmのストリップに切断します。
4. 5 mLのコラゲナーゼ-ディスパーゼミックス(材料表;14ヴュンシュ単位/ mL)を滅菌15 mLチューブに加えます。
5. 切断した組織をチューブに移し、組織片が溶液に沈んでいることを確認します。チューブにしっかりとキャップをします。
6. チューブを37°Cのインキュベーターに入れ、軌道を150分間振とうします。インキュベーション後、組織を含むチューブをバイオセーフティキャビネットに入れます。
7. 滅菌100 mm培養皿の蓋を逆さまにしてバイオセーフティキャビネットに入れます。消化した組織溶液を、飛散せずに100 mm培養皿の底に移します。チューブ内に組織片が残っている場合は、滅菌済みの1 mLピペットまたは滅菌鉗子を使用して、組織片を100 mm培養皿の底に移します。
8. 表皮ストリップを上に向けて、2対の鉗子を使用して、無傷の表皮シートを真皮から分離します。組織ストリップの真皮を一対の鉗子で、表皮の端を別の一対の鉗子で保持します。真皮と表皮を2つに分けてはがし、分離した部分を同じ蓋の上に置きます。この手順をすばやく実行し、組織ごとに操作を繰り返します。
9. 真皮片をPBSを含む新しい100 mm培養皿に移します。
10. 実験用鉗子を使用して、3 mLの0.3%トリプシン/ PBSを含む15 mLのポリプロピレンチューブに真皮片を置きます。37°Cの水浴中で10〜20分間インキュベートし、2〜3分ごとにチューブを数回反転させます。
11. 酵素反応を停止するには、3〜5 mLの氷冷完全増殖培地(10%FBSを含むダルベッコ改変イーグル培地[DMEM]またはRPMI)を追加します。チューブを数回激しく渦巻きます。線維芽細胞懸濁液を85 μmのナイロンメッシュ(50 mLチューブの上部に配置)でろ過し、真皮の破片を取り除きます。
12. 150 x g、4°Cで10分間遠心分離します。 上清を吸引し、ペレットを100〜1,000 μLの完全増殖培地に再懸濁します。
13. 細胞懸濁液と混合したトリパンブルー(希釈倍率x2)を用いて、血球計算盤のチャンバーに充填することにより総細胞数および生細胞数をカウントする。
    注:細胞の生存率は、酵素消化に使用される条件によって異なります。細胞回収率と細胞生存率を高めるために、皮膚サンプルをより小さな断片に切断することができます。
14. プレート3−10 x 10⁴ 細胞を5 mLの完全FBS増殖培地(DMEM、10%FBSを56°Cで60分間熱不活性化、1%1 M HEPES緩衝液、1%100x非必須アミノ酸混合物、1%100xL-グルタミン、1%100xペニシリン/ストレプトマイシン、1%100xピルビン酸ナトリウム)を25 cm² の組織培養フラスコに入れます。37°Cでインキュベートします。
    注:生存可能な線維芽細胞は24時間以内にフラスコに付着し、2〜3日で紡錘形を示し始めます。
15. 2日目に、非接着細胞を含む培地を吸引し、新鮮な培地を加える。
    注:培地中の死細胞は生菌線維芽細胞の増殖に影響を与えるため、非接着性の死細胞を培養液から除去する必要があります。
16. 培養液が70〜80%のコンフルエントに達するまで、3〜4日ごとに培地を交換します。
17. 線維芽細胞を回収するには、PBSで洗浄し、トリプシン/EDTA溶液とともにインキュベーター内で37°Cで3分間インキュベートします。
18. 反応を停止するには、3〜5 mLの温かい完全増殖培地(10%FBSを含むDMEMまたはRPMI)を追加します。細胞懸濁液のアリコートを取り、血球計算盤で細胞を数えます。懸濁液を200 x g で5分間遠心分離し、吸引により培地を除去します。
19. 線維芽細胞をPRP培地(DMEM、20%PRP、1% 1 M HEPES緩衝液、1% 100x非必須アミノ酸混合物、1% 100x L-グルタミン、1% 100x ペニシリン/ストレプトマイシン、1% 100x ピルビン酸ナトリウム、2 U/mLヘパリン)で培養し、37°Cのインキュベーターで培養します。
    注:推奨される最小細胞密度は4,000生細胞/ cm²です。
20. 線維芽細胞の増殖に対するPRP効果を評価するために、異なるPRP濃度(1%、5%、10%、20%、30%、40%、および50%)のPRP培地および2 U / mLヘパリンまたは古典的な培地条件下(10%FBS)で、ウェルあたり8 x 10³ 細胞の密度で24ウェルプレート中の種子線維芽細胞(継代2)。7日間の培養後、バイタル色素(細胞増殖バイオレット)を細胞に加え、フローサイトメトリーで増殖を評価します。
21. 細胞骨格の再配列を研究するために、96ウェルブラック/クリアフラットボトムプレートに1 x 10 5細胞/mLの濃度で0.5%FBSを添加した^0.5 %FBSを24時間補充します。10%FBSまたは異なるPRP濃度(1%、5%、10%、20%、30%、40%、および50%)で細胞を7日間処理します。
    1. 線維芽細胞を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、0.1%Triton X-100でRTで5分間透過処理します。 線維芽細胞を50 mLの5 U / mLファロイジンで染色し、PBSで2回洗浄し、50 mLの1 mg / mL 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で5分間マークを付けます。Cytation 3細胞イメージングマルチモードリーダー(BioTek)を使用して、ファロイジン染色を視覚化しました。

結果

この特許取得済みの技術は、標準化されたPRP製剤の製造に使用される、シンプルで高速かつ再現性のある医療機器です。これは、1,500 x g で5分間の遠心分離後に静脈全血からPRPを調製できるワンステップの完全閉鎖システムです(分離ゲル技術による)。遠心分離後に得られたPRPは、ゲルの下にある赤血球と白血球から除去されます。数回のチューブ反転の後、ゲルの上にある血小板が血...

ディスカッション

創傷細胞治療において他の充填材料と比較して、自家線維芽細胞を天然の代替物として使用する利点には、良好な生体適合性、最小限の副作用、および採取および使用の容易さが含まれる。ただし、これらの治療法を日常の臨床現場で使用する前に、移植の前後に単離された線維芽細胞の増殖の特徴を特定し、生物学的機能と安全性を評価するために、適切な前臨床試験が必要です。したが?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well black clear flat bottom	BD Falcon	353219	32/case
Cell trace Violet Dye	Thermo Fischer Scientific	C34557	180 assays
CuteCell PRP	Regen Lab SA	CC-PRP-3T	3 tubes per package
DAPI	Sigma	D9542	1 mg
DMEM	Gibco	52400-025	500 mL
FBS	Gibco	10270106	500 mL
Glutamine 200 mM	Gibco	25030024	100 mL
Hematology Counter	Sysmex	KK-21N
Heparin 5000E Liquemine	Drossapharm AG		0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M	Gibco	15630-056	100 mL
Liberase DH	Roche	5401054001	2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x	Gibco	11140-035	100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL	Gibco	11360-039	100 mL
Penicillin streptomycin	Gibco	15140122	100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488	Molecular Probes	A12379	300 units
RPMI	Gibco	31966-021	500 mL
Trypsin 1x 0.25%	Gibco	25050-014	100 mL
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200056	100 mL