In Vitro İnsan Fibroblast Genişlemesini Artırmak için Otolog Trombosit Bakımından Zengin Plazma Üretimi

Özet

Bu protokol, %100 otolog fibroblast kültür sisteminde hücrelerin in vitro genişlemesini artırmak için PRP üreten bir cihaz sunar.

Özet

Günümüzde otolog fibroblastların cilt onarımı için kullanımına büyük klinik ilgi vardır. Çoğu durumda, in vitro cilt hücrelerinin kültürü gereklidir. Bununla birlikte, ksenojenik veya allojenik kültür ortamını kullanan hücre kültürünün bazı dezavantajları vardır (yani, enfeksiyöz ajan iletimi veya yavaş hücre genişlemesi riski). Burada, bir hastanın kendi trombosit bakımından zengin plazması (PRP) kullanılarak insan derisi fibroblast hücrelerinin in vitro genişlemesi için otolog bir kültür sistemi geliştirilmiştir. İnsan dermal fibroblastları abdominoplasti yapılırken hastadan izole edilir. Kültürler, fetal sığır serumu (FBS) veya PRP ile desteklenmiş bir ortam kullanılarak 7 güne kadar takip edilir. PRP preparatlarında kan hücresi içeriği, proliferasyonu ve fibroblast farklılaşması değerlendirilir. Bu protokol, özel bir tıbbi cihaz kullanarak standartlaştırılmış, aktive edilmemiş bir PRP preparatı elde etme yöntemini açıklamaktadır. Hazırlık sadece bir tıbbi cihaz (CuteCell-PRP) ve santrifüj gerektirir. Bu cihaz, yeterli tıbbi uygulama koşulları altında uygundur ve 5 dakika boyunca 1.500 x g'lık tek, yumuşak bir spin santrifüjleme gerektiren tek adımlı, aprilojenik ve steril bir kapalı sistemdir. Santrifüjlemeden sonra, kan bileşenleri ayrılır ve trombosit bakımından zengin plazma kolayca toplanır. Bu cihaz, insan hücrelerinin in vitro genişlemesi için bir hücre kültürü takviyesi olarak kullanılabilecek hızlı, tutarlı ve standartlaştırılmış bir PRP preparatına izin verir. Burada elde edilen PRP, kırmızı ve beyaz kan hücrelerinin tercihli olarak uzaklaştırılmasıyla, birlikte tam kana kıyasla 1.5 kat trombosit konsantrasyonu içerir. PRP'nin FBS'ye (7.7x) kıyasla hücre proliferasyonunda artırıcı bir etki gösterdiği ve PRP tedavisi üzerine fibroblastların aktive olduğu gösterilmiştir.

Giriş

Rejeneratif tıp, yaş, hastalık veya travma nedeniyle hasar gören doku ve organları iyileştirmeyi veya değiştirmeyi ve konjenital kusurları düzeltmeyi amaçlar. Otolog tedavide, hücreler veya dokular bir hastadan çekilir, genişletilir veya değiştirilir, daha sonra donöre yeniden verilir. Bu terapötik form, dermatoloji alanında geniş bir potansiyele sahiptir¹. Otolog fibroblast tedavisinde, bir hastanın fibroblastları kırışıklıkları, ritidleri veya akne izlerini tedavi etmek için kültürlenir ve yeniden enjekte edilir. Fibroblastlar dermisteki ana fonksiyonel hücreler olduğundan, otolog fibroblastların enjeksiyonu yüz gençleştirmede diğer tedavilerden daha faydalı olabilir².

Deride, fibroblastlar hücre dışı proteinlerin (yani kollajen, elastin, hyaluronik asit ve glikozaminoglikanlar) sentezinden ve salgılanmasından sorumludur. Ayrıca normal cilt homeostazında ve yara iyileşmesinde hücre fonksiyonunu, göçünü ve hücre-matriks/hücre-hücre etkileşimlerini düzenleyen büyüme faktörlerini serbest bırakırlar³. Dermal fibroblastlar, estetik ve plastik cerrahi prosedürlerinde cilt yara iyileşmesi⁴, doku rejenerasyonu⁵ veya dermal dolgu maddeleri için potansiyel bir klinik hücre tedavisi olarak tanıtılmıştır⁶. Bazı çalışmalar, rejeneratif tıp bağlamında, fibroblastların mezenkimal kök hücrelerden daha pratik ve etkili bir hücre tedavisi olabileceğini düşündürmektedir⁷.

Klinik uygulamalar için yeterli sayıda fibroblast elde etmek için, hücre genişlemesi genellikle zorunludur. Ex vivo / in vitro hücre kültürü, hücre yapışmasını ve çoğalmasını desteklemek için büyüme faktörleri, proteinler ve enzimlerle desteklenmiş bazal ortam gerektirir. Fetal sığır serumu (FBS), hücre kültürü ortamı için yaygın bir takviyedir, çünkü fetal kan 1) yetişkin kanına kıyasla büyüme faktörleri bakımından zengindir ve 2) düşük antikor içeriği sunar⁸. Hücre tedavisi ilerledikçe, FBS'nin kültür ortamına eklendiği klasik hücre kültürü koşullarının güvenliği konusunda endişeler vardır. Ayrıca, şimdi FBS'yi alternatif⁹ ile değiştirme eğilimi var. Birkaç FBS yedeği umut verici sonuçlar göstermiştir¹⁰.

Burada trombositten zengin plazma (PRP) alternatifi seçildi ve PRP'nin CuteCell-PRP adlı standart bir preparatını üretmek için tıbbi bir cihaz geliştirdik. Bu cihazın kullanım amacı, GMP koşulları altında otolog hücrelerin in vitro genişlemesi için bir kültür ortamı takviyesi olarak kullanılmak üzere otolog PRP'nin hazırlanmasıdır.

PRP, plazmada konsantre trombosit süspansiyonu olarak tanımlanır. 1) ihtiyaç duyulan kan miktarı, 2) kullanılan cihaz türleri ve 3) santrifüjleme protokolünde farklılık gösteren çok sayıda hazırlık protokolü olduğundan, ortaya çıkan trombosit konsantrasyonları kan bazal değerinin biraz üstünden 10 katından fazlasına kadar değişir. Ek olarak, PRP preparatları değişken seviyelerde kırmızı ve beyaz kan hücresi kontaminasyonu içerir. Bu nedenle "PRP" terminolojisi, biyolojik bileşimlerinde ve potansiyel terapötik etkilerinde büyük farklılıklar gösteren ürünleri tanımlamak için kullanılır.

Çoğu çalışmada, FBS ikamesi, aktive edilen farklı PRP konsantrasyonları kullanılarak (trombin veya kalsiyum ile) elde edilir. Bu yapay aktivasyon, trombosit büyüme faktörlerinin 15 dakikadan 24 saate kadar¹¹ saate kadar derhal ve önemli bir şekilde salınmasına neden olur. Bu nedenle, trombosit aktivasyonunun, kademeli trombosit degranülasyonundan büyüme faktörlerinin yavaş salınımının gerekli olduğu hücre kültürlerindeki uygulamalar için istenmeyen bir durum olduğuna inanılmaktadır.

PRP tedavisi, konsantre plazma^12'de otolog trombositlerin hazırlanmasını içerir. Optimal trombosit konsantrasyonu belirsizdir ve PRP^13'ü hazırlamak için çok çeşitli ticari cihazlar mevcuttur. Bu standardizasyon eksikliği, çalışmalar arasındaki tutarsızlıktan kaynaklanmaktadır ve enjeksiyonun dozu ve zamanlaması ile ilgili bir kara kutuya yol açmıştır. Bu protokol, %100 otolog ex vivo kültür modelinde cilt fibroblastlarını genişletmek için bu özel PRP cihazını kullanarak otolog PRP elde etmek için bir prosedürü açıklamaktadır.

Protokol

Çalışma protokolü Helsinki Deklarasyonu'na uyuyordu ve tüm hastalar çalışmaya katılmadan önce yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Cenevre Üniversitesi Hastaneleri (Cenevre, İsviçre) Plastik, Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Bölümü'nde abdominoplasti uygulanan sağlıklı kadınlardan deri örnekleri alınmaktadır. Prosedür, Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine uygundur ve yerel kurumsal etik komitesi tarafından onaylanmıştır (protokol #3126).

1. PRP hazırlanması

NOT: CuteCell-PRP tüpleri (Malzeme Tablosu), kapalı devre sistemde hastanın kanının küçük bir hacminden PRP'nin hızlı bir şekilde hazırlanması için tasarlanmıştır.

1. Tam kan toplanması
   NOT: Tıp enstitüsünün toplama protokolüne göre, PRP tüpüne doğrudan bağlı bir kelebek iğnesi kullanarak kolun periferik damarından otolog kan toplayın. Hasta anestezi altındaysa kan doğrudan venöz kanülden çekilebilir.
   1. Tüp blister paketini açın. Venöz ponksiyonu gerçekleştirin ve istediğiniz sayıda PRP tüpünü tam kanla doldurun. Tüplerin içindeki vakum, gerekli kan hacminin (~ 10 mL) otomatik olarak toplanmasını sağlayacaktır.
   2. Kanı antikoagülanla karıştırmak için tüpleri dikkatlice birkaç kez baş aşağı çevirin.
   3. Bir biyogüvenlik kabininin içinde (sınıf 2), daha fazla kan hücresi sayısı sayımı için 1 mL'lik bir şırınga kullanarak 100 μL toplam tam kanı çıkarın.
2. Santrifüjleme
   NOT: Çalıştırmadan önce santrifüjün doğru şekilde dengelendiğinden emin olun.
   1. PRP tüplerinde kan toplandıktan sonra, gerekirse, PRP tüpündeki kanla aynı seviyeye kadar su ile bir karşı denge tüpü (ayrı olarak verilir) hazırlayın. Doldurulmuş tüpleri birbirinin karşısındaki santrifüje yerleştirin ve makinenin dengelendiğinden emin olun.
   2. Numuneleri 5 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj edin.
      NOT: İlgili rpm hızını santrifüj üreticisinin talimatlarına göre ayarlayın. Santrifüjlemeden sonra, kan fraksiyone olur. Kırmızı ve beyaz kan hücreleri jelin altında sıkışır ve trombositler jelin yüzeyine yerleşir (Şekil 1).
3. Plazma süpernatanındaki trombosit birikintisini yeniden askıya almak için PRP tüpünü 20 kat ters çevirin.
   NOT: Trombositlerin jelden tamamen ayrıldığından emin olun. Plazma berrak ve şeffaftan bulanıklığa değişmelidir. Trombosit agregaları varsa, plazma ile toplanmalıdır.
4. PRP toplamak için, 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı bir şırınga transfer cihazı kullanarak plazma çözeltisini tüpten alın.
   NOT: Her tüpten yaklaşık 5 mL PRP elde edilecektir. PRP çözeltisi artık son ortam hazırlığında karıştırılmaya hazırdır. Çözelti, hematoloji analizörü ve kullanımını içeren gelecekteki adımlara kadar güvenlik kabininin altında oda sıcaklığında (RT) tutulabilir.
5. PRP'yi kullanmadan önce, otomatik bir hematoloji analizörü kullanarak trombosit konsantrasyonunu, ortalama trombosit hacmini ve kırmızı ve beyaz kan hücrelerinin sayısını belirleyin (Malzeme tablosu). Bunu yapmak için, çözeltinin 100 μL'sini dikkatlice geri çekin ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   NOT: PRP,% 5-20 v / v arasındaki bir konsantrasyonda otolog bir kültür takviyesi olarak kullanılır. PRP'nin optimal konsantrasyonu her hücre hattı için belirlenmelidir. Fibrin pıhtı oluşumunu önlemek için, son kültür ortamına 2 U / mL heparin eklenmelidir.

2. FBS veya PRP takviyeli ortamlarda otolog fibroblastların ve kültürün izolasyonu

1. Cilt numunelerini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 50 mL'lik bir polipropilen tüpte hafifçe çalkalayarak yıkayın.
2. Cilt örneği nispeten büyükse (>10 cm2), numuneyi 150^cm2'lik bir doku kültürü kabının kapağına (epidermal yan aşağı) yerleştirin. Bir çift forseps ve makas kullanarak deri altı yağ dokusunu çıkarın. Dokunun kurumasını önlemek için, PBS'de birkaç dakikada bir dokuyu durulayın.
   NOT: Daha küçük numuneler için daha küçük doku kültürü kabı kullanın.
3. Yağ kesme işlemi tamamlandığında, steril bir neşter kullanarak dokuyu yaklaşık 0,5 cm x 1,5 cm'lik şeritler halinde kesin.
4. Steril 15 mL'lik bir tüpe 5 mL kollajenaz-dispaz karışımı (Malzeme Tablosu; 14 Wünsch ünitesi/mL) ekleyin.
5. Kesilen dokuyu tüpe aktarın, doku parçalarının çözeltiye batırılmasını sağlayın. Tüpü güvenli bir şekilde kapatın.
6. Tüpleri 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin ve 150 dakika boyunca orbital sallantıya sahip olun. İnkübasyondan sonra, dokuyu içeren tüpü biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
7. Steril 100 mm'lik bir kültür kabının kapağını biyogüvenlik kabinine baş aşağı yerleştirin. Sindirilmiş doku çözeltisini sıçramadan 100 mm'lik kültür kabının dibine aktarın. Tüpte herhangi bir doku parçası kalırsa, doku parçalarını 100 mm'lik kültür kabının altına aktarmak için steril 1 mL'lik bir pipet veya steril forseps kullanın.
8. Epidermis şeridi yukarı bakacak şekilde, sağlam epidermis tabakasını iki çift forseps kullanarak dermisten ayırın. Doku şeridinin dermisini bir çift forseps ile ve epidermisin kenarını başka bir çift forseps ile tutun. Dermis ve epidermisi iki parça halinde soyun, ayrılan parçaları aynı kapakta tutun. Bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirmeye çalışın ve her doku parçası için manipülasyonu tekrarlayın.
9. Dermal parçaları PBS içeren yeni bir 100 mm kültür kabına aktarın.
10. Laboratuvar forsepslerini kullanarak, dermal parçaları 3 mL% 0.3 tripsin / PBS içeren 15 mL'lik bir polipropilen tüpe yerleştirin. 37 ° C'lik bir su banyosunda 10-20 dakika inkübe edin ve tüpü her 2-3 dakikada bir birkaç kez ters çevirin.
11. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için, 3-5 mL buz gibi soğuk tam büyüme ortamı (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı [DMEM] veya% 10 FBS içeren RPMI) ekleyin. Tüpü birkaç kez kuvvetlice vorteksleyin. Dermal kalıntıları gidermek için fibroblast süspansiyonunu 85 μm'lik bir naylon ağdan (50 mL'lik bir tüpün üstüne yerleştirilmiş) filtreleyin.
12. 150 x g'de, 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve peleti 100−1.000 μL tam büyüme ortamında yeniden askıya alın.
13. Hücre süspansiyonu ile karıştırılmış tripan mavisi (x2 seyreltme faktörü) kullanarak, hemositometrenin odasını doldurarak toplam ve canlı hücrelerin sayısını sayın.
    NOT: Hücre canlılığı, enzimatik sindirim için kullanılan koşullara bağlıdır. Hücre iyileşmesini ve hücre canlılığını arttırmak için, cilt örneği daha küçük parçalara ayrılabilir.
14. 25^cm2'lik bir doku kültürü şişesinde 5 mL tam FBS büyüme ortamında (DMEM, 56 ° C'de 60 dakika boyunca inaktive edilmiş% 10 FBS,% 1 1 M HEPES tampon çözeltisi,% 100x esansiyel olmayan amino asit karışımı,% 100x L-glutamin,% 100x penisilin / streptomisin,% 1 100x sodyum piruvat plakası 3−10 x 10 x^{4 hücre.} 37 °C'de inkübe edin.
    NOT: Canlı fibroblastlar 24 saat içinde şişeye yapışacak ve 2-3 gün içinde iğ şeklini sergilemeye başlayacaktır.
15. 2. günde, yapışkan olmayan hücreler içeren ortamı aspire edin ve taze ortam ekleyin.
    NOT: Kültür ortamındaki ölü hücreler canlı fibroblastların büyümesini etkilediğinden, yapışkan olmayan, ölü hücreler kültürden uzaklaştırılmalıdır.
16. Kültür% 70-80 akıcılığa ulaşana kadar ortamı her 3-4 günde bir değiştirin.
17. Fibroblastları hasat etmek için, PBS ile yıkayın ve inkübatörde 37 ° C'de 3 dakika boyunca tripsin / EDTA çözeltisi ile inkübe edin.
18. Reaksiyonu durdurmak için, 3-5 mL sıcak tam büyüme ortamı (% 10 FBS içeren DMEM veya RPMI) ekleyin. Hemositometre ile hücreleri saymak için hücre süspansiyonunun bir alikotunu alın. Süspansiyonu 200 x g'de 5 dakika santrifüj edin ve ortamı aspirasyonla çıkarın.
19. PRP besiyerindeki fibroblastın (DMEM, %20 PRP, %1 1 M HEPES tampon çözeltisi, %1 100x esansiyel olmayan amino asit karışımı, %1 100x L-glutamin, %1 100x penisilin/streptomisin, %1 100x sodyum piruvat, 2 U/mL heparin) inkübatörde 37 °C'de kültürlenmesi.
    NOT: Önerilen minimum hücre yoğunluğu 4.000 canlı hücre/^cm2'dir.
20. PRP'nin fibroblast proliferasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, farklı PRP konsantrasyonlarına (%1, %5, %10, %20, %30, %40 ve %50) ve 2 U/mL heparin veya klasik kültür ortamı koşullarında (%10 FBS) PRP besiyerinde kuyu başına 8 x 10³ hücre yoğunluğunda 24 kuyucuk plakasında tohum fibroblastları (pasaj 2). 7 günlük kültürden sonra, hücrelere hayati bir boya (hücre proliferasyon menekşesi) ekleyin ve proliferasyonu akış sitometrisi ile değerlendirin.
21. Sitoiskelet yeniden düzenlemelerini incelemek için, tam FBS büyüme DMEM'inde 1 x 10 5 hücre / mL konsantrasyonunda 96 kuyu siyah / berrak düz taban plakasındaki tohum hücreleri (bkz. adım 2.14) 24 saat boyunca%^0.5 FBS ile desteklenmiştir. Hücreleri 7 gün boyunca% 10 FBS veya farklı PRP konsantrasyonları (% 1,% 5,% 10,% 20,% 30,% 40 ve% 50) ile tedavi edin.
    1. Fibroblastları 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve RT'de 5 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 ile geçirgenleştirin. fibroblastları 50 mL 5 U / mL faloidin ile lekeleyin, PBS ile 2 kez yıkayın ve 5 dakika boyunca 50 mL 1 mg / mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile işaretleyin. Sitasyon 3 hücreli görüntüleme multimod okuyucu (BioTek) kullanılarak faloidin boyanması görüntülendi.

Sonuçlar

Bu patentli teknoloji, standartlaştırılmış PRP preparatları üretmek için kullanılan basit, hızlı ve tekrarlanabilir bir tıbbi cihazdır. 1.500 x g'de 5 dakikalık santrifüjlemeden sonra (ayırıcı jel teknolojisi nedeniyle) PRP'nin venöz tam kandan hazırlanmasını sağlayan tek adımlı, tamamen kapalı bir sistemdir. Santrifüjleme sonrası elde edilen PRP, jelin altına oturan kırmızı ve beyaz kan hücrelerinden temizlenir. Birkaç tüp inversiyonundan sonra jelin üstünde bulunan trombosi...

Tartışmalar

Otolog fibroblastların yara hücresi tedavisinde diğer dolgu maddelerine kıyasla doğal bir alternatif olarak kullanılmasının avantajları arasında iyi biyouyumluluk, minimal yan etkiler ve hasat ve kullanım kolaylığı sayılabilir. Bununla birlikte, bu terapötikleri günlük klinik ortamda kullanmadan önce, büyüme özelliklerini tanımlamak ve transplantasyondan önce ve sonra izole fibroblastların biyolojik fonksiyonunu ve güvenliğini değerlendirmek için uygun klinik öncesi çalışmalar gereklidir....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well black clear flat bottom	BD Falcon	353219	32/case
Cell trace Violet Dye	Thermo Fischer Scientific	C34557	180 assays
CuteCell PRP	Regen Lab SA	CC-PRP-3T	3 tubes per package
DAPI	Sigma	D9542	1 mg
DMEM	Gibco	52400-025	500 mL
FBS	Gibco	10270106	500 mL
Glutamine 200 mM	Gibco	25030024	100 mL
Hematology Counter	Sysmex	KK-21N
Heparin 5000E Liquemine	Drossapharm AG		0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M	Gibco	15630-056	100 mL
Liberase DH	Roche	5401054001	2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x	Gibco	11140-035	100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL	Gibco	11360-039	100 mL
Penicillin streptomycin	Gibco	15140122	100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488	Molecular Probes	A12379	300 units
RPMI	Gibco	31966-021	500 mL
Trypsin 1x 0.25%	Gibco	25050-014	100 mL
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200056	100 mL