Получение аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы для усиления экспансии фибробластов человека in vitro

Резюме

Этот протокол представляет собой устройство, которое производит PRP для стимулирования экспансии клеток in vitro в 100% аутологичной системе культивирования фибробластов.

Аннотация

В настоящее время существует большой клинический интерес к использованию аутологичных фибробластов для восстановления кожи. В большинстве случаев требуется культивирование клеток кожи in vitro. Однако культивирование клеток с использованием ксеногенных или аллогенных питательных сред имеет некоторые недостатки (например, риск передачи инфекционного агента или медленную экспансию клеток). Здесь разрабатывается система аутологичного культивирования для расширения клеток фибробластов кожи человека in vitro с использованием собственной обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) пациента. Дермальные фибробласты человека выделяются у пациента во время абдоминопластики. Посевы проводят в течение 7 дней с использованием среды, дополненной либо фетальной бычьей сывороткой (FBS), либо PRP. Оценивают содержание клеток крови в препаратах PRP, пролиферацию и дифференцировку фибробластов. В этом протоколе описан способ получения стандартизированного, неактивированного препарата PRP с использованием специального медицинского изделия. Для приготовления препарата требуется только медицинский прибор (CuteCell-PRP) и центрифуга. Это устройство подходит для достаточных условий медицинской практики и представляет собой одноступенчатую, апирогенную и стерильную закрытую систему, которая требует однократного центрифугирования с мягким вращением 1,500 x g в течение 5 минут. После центрифугирования компоненты крови отделяются, и богатая тромбоцитами плазма легко собирается. Это устройство позволяет быстро, последовательно и стандартизированно получать PRP, который можно использовать в качестве добавки к клеточным культурам для экспансии клеток человека in vitro. PRP, полученный здесь, содержит 1,5-кратную концентрацию тромбоцитов по сравнению с цельной кровью вместе, с преимущественным удалением эритроцитов и лейкоцитов. Показано, что PRP оказывает стимулирующее действие в пролиферации клеток по сравнению с FBS (7,7x) и что фибробласты активируются при лечении PRP.

Введение

Регенеративная медицина направлена на лечение или замену тканей и органов, поврежденных возрастом, болезнью или травмой, а также на исправление врожденных дефектов. При аутологичной терапии клетки или ткань изымаются у пациента, расширяются или модифицируются, а затем снова вводятся донору. Эта форма терапии имеет широкий потенциал в области дерматологии¹. При терапии аутологичными фибробластами фибробласты пациента культивируются и повторно вводятся для лечения морщин, ритид или шрамов от угревой сыпи. Поскольку фибробласты являются основными функциональными клетками дермы, инъекция аутологичных фибробластов может быть более полезной, чем другие методы лечения омоложения лица².

В коже фибробласты отвечают за синтез и секрецию внеклеточных белков (то есть коллагена, эластина, гиалуроновой кислоты и гликозаминогликанов). Они также высвобождают факторы роста, которые регулируют функцию клеток, миграцию и взаимодействия между клетками и матриксом/клетками при нормальном гомеостазе кожи и заживлении ран³. Дермальные фибробласты уже были введены в качестве потенциальной клинической клеточной терапии для заживления кожных ран⁴, регенерации^{тканей 5} или дермальных наполнителей в процедурах эстетической и пластической хирургии⁶. Некоторые исследования даже предполагают, что в контексте регенеративной медицины фибробласты могут быть более практичной и эффективной клеточной терапией, чем мезенхимальные стволовые клетки⁷.

Для получения достаточного количества фибробластов для клинического применения обычно обязательна клеточная экспансия. Культура клеток ex vivo / in vitro требует базальной среды, дополненной факторами роста, белками и ферментами для поддержки клеточной адгезии и пролиферации. Фетальная бычья сыворотка (FBS) является распространенной добавкой для сред для культивирования клеток, поскольку кровь плода 1) богата факторами роста по сравнению с кровью взрослого человека и 2) имеет низкое содержание антител⁸. По мере развития клеточной терапии возникают опасения по поводу безопасности классических условий культивирования клеток, в которых FBS добавляется в питательную среду. Кроме того, в настоящее время наблюдается тенденция к замене FBS альтернативами⁹. Несколько заменителей FBS показали многообещающие результаты¹⁰.

Здесь была выбрана альтернатива обогащенной тромбоцитами плазме (PRP), и мы разработали медицинское устройство для производства стандартизированного препарата PRP под названием CuteCell-PRP. Предполагаемое использование этого устройства заключается в приготовлении аутологичного PRP для использования в качестве добавки питательной среды для экспансии аутологичных клеток in vitro в условиях GMP.

PRP определяется как концентрированная суспензия тромбоцитов в плазме. Поскольку существует множество протоколов подготовки, которые различаются по 1) количеству необходимой крови, 2) типам используемых устройств и 3) протоколу центрифугирования, результирующие концентрации тромбоцитов варьируются от чуть выше до более чем в 10 раз по сравнению с исходным значением крови. Кроме того, препараты PRP содержат различные уровни загрязнения эритроцитов и лейкоцитов. Таким образом, терминология «PRP» используется для описания продуктов, которые сильно различаются по своему биологическому составу и потенциальным терапевтическим эффектам.

В большинстве исследований замещение FBS достигается с использованием различных концентраций PRP, который активируется (тромбином или кальцием). Эта искусственная активация провоцирует немедленное и важное высвобождение факторов роста тромбоцитов от 15 мин до 24 ч¹¹. Поэтому считается, что активация тромбоцитов нежелательна для применений в клеточных культурах, в которых требуется медленное высвобождение факторов роста от постепенной дегрануляции тромбоцитов.

PRP-терапия включает приготовление аутологичных тромбоцитов в концентрированной плазме¹². Оптимальная концентрация тромбоцитов неясна, и существует широкий спектр коммерческих устройств для получения PRP¹³. Это отсутствие стандартизации является результатом несогласованности между исследованиями и привело к черному ящику в отношении дозировки и времени инъекции. Этот протокол описывает процедуру получения аутологичного PRP с использованием этого специального устройства PRP для расширения фибробластов кожи в 100% аутологичной модели культуры ex vivo.

протокол

Протокол исследования соответствовал Хельсинкской декларации, и все пациенты предоставили письменное информированное согласие перед участием в исследовании. Образцы кожи берутся у здоровых женщин, перенесших абдоминопластику в отделении пластической, реконструктивной и эстетической хирургии университетских клиник Женевы (Женева, Швейцария). Процедура соответствует принципам Хельсинкской декларации и была одобрена местным институциональным комитетом по этике (протокол #3126).

1. Подготовка PRP

ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки CuteCell-PRP (Таблица материалов) предназначены для быстрого приготовления PRP из небольшого объема крови пациента в системе замкнутого контура.

1. Сбор цельной крови
   ПРИМЕЧАНИЕ: Забор аутологичной крови из периферической вены руки с помощью иглы-бабочки, непосредственно подключенной к трубке PRP, в соответствии с протоколом сбора медицинского института. Кровь может быть взята непосредственно через венозную канюлю, если пациент находится под наркозом.
   1. Откройте блистерную упаковку тубы. Выполните венозную пункцию и заполните нужное количество PRP-пробирок цельной кровью. Вакуум внутри пробирок позволит автоматически собирать необходимый объем крови (~10 мл).
   2. Осторожно переверните пробирки вверх дном несколько раз, чтобы смешать кровь с антикоагулянтом.
   3. Внутри шкафа биобезопасности (класс 2) удалите 100 мкл общей цельной крови с помощью шприца объемом 1 мл для дальнейшего подсчета количества клеток крови.
2. Центрифугирование
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед запуском убедитесь, что центрифуга правильно сбалансирована.
   1. После того, как кровь собрана в пробирки PRP, при необходимости подготовьте пробирку с противовесом (поставляется отдельно) с водой до того же уровня, что и кровь в пробирке PRP. Поместите заполненные пробирки в центрифугу напротив друг друга, убедившись, что машина сбалансирована.
   2. Центрифужные образцы в дозе 1 500 x g в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите соответствующую частоту вращения в минуту в соответствии с инструкциями производителя центрифуги. После центрифугирования кровь станет фракционированной. Эритроциты и лейкоциты задерживаются под гелем, а тромбоциты оседают на поверхности геля (рис. 1).
3. Осторожно инвертируйте трубку PRP 20x, чтобы ресуспендировать отложение тромбоцитов в надосадочной жидкости плазмы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что тромбоциты полностью отделены от геля. Плазма должна измениться от прозрачной и прозрачной до мутной. Если присутствуют агрегаты тромбоцитов, их следует собрать вместе с плазмой.
4. Чтобы собрать PRP, возьмите раствор плазмы из пробирки с помощью устройства для переноса шприца, подключенного к шприцу объемом 10 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из каждой пробирки будет получено около 5 мл PRP. Теперь раствор PRP готов к смешиванию с готовой окончательной средой. Раствор можно хранить при комнатной температуре (RT) под шкафом безопасности до будущих этапов, связанных с гематологическим анализатором и использованием.
5. Перед использованием PRP определите концентрацию тромбоцитов, средний объем тромбоцитов и количество эритроцитов и лейкоцитов с помощью автоматизированного гематологического анализатора (Таблица материала). Для этого осторожно извлеките 100 мкл раствора и перелейте в пробирку объемом 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PRP используется в качестве аутологичной добавки к культуре в концентрации от 5 до 20% по об. Оптимальная концентрация PRP должна быть определена для каждой клеточной линии. Чтобы предотвратить образование фибринового сгустка, конечную питательную среду следует дополнить 2 ЕД/мл гепарина.

2. Выделение аутологичных фибробластов и культуры в средах, дополненных FBS или PRP

1. Промойте образцы кожи в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), осторожно встряхнув полипропиленовую пробирку объемом 50 мл.
2. Если образец кожи относительно большой (>10 см 2 ), поместите образец на крышку 150 см² чашки для культивирования тканей (эпидермальной стороной вниз). Удалите подкожно-жировую клетчатку с помощью щипцов и ножниц. Чтобы предотвратить высыхание ткани, промывайте салфетку каждые несколько минут в PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте меньшую чашку для культивирования тканей для небольших образцов.
3. Когда обрезка жира будет завершена, разрежьте ткань примерно на полоски размером примерно 0,5 см х 1,5 см с помощью стерильного скальпеля.
4. Добавьте 5 мл смеси коллагеназы и диспазы (таблица материалов; 14 единиц Вюнша / мл) в стерильную пробирку объемом 15 мл.
5. Перенесите разрезанную ткань в трубку, убедившись, что кусочки ткани погружены в раствор. Надежно закройте тюбик.
6. Поместите пробирки в инкубатор при температуре 37 °C с орбитальным встряхиванием в течение 150 мин. После инкубации поместите пробирку, содержащую ткань, в шкаф биобезопасности.
7. Поместите крышку стерильной чашки для культивирования диаметром 100 мм вверх дном в шкаф биобезопасности. Переложите переваренный тканевый раствор на дно 100-миллиметровой чашки для культуры, не разбрызгивая. Если в пробирке остались какие-либо кусочки ткани, используйте стерильную пипетку объемом 1 мл или стерильные щипцы для переноса кусочков ткани на дно 100-миллиметровой чашки для культивирования.
8. Полоской эпидермиса лицом вверх отделите неповрежденный лист эпидермиса от дермы с помощью двух пар щипцов. Удерживайте дерму тканевой полоски парой щипцов и край эпидермиса другой парой щипцов. Разделите дерму и эпидермис на две части, держа отдельные кусочки на одном веке. Постарайтесь выполнить этот шаг быстро и повторите манипуляцию для каждого кусочка ткани.
9. Перенесите кусочки кожи в новую 100-миллиметровую культуральную чашку, содержащую PBS.
10. Используя лабораторные щипцы, поместите кусочки кожи в полипропиленовую пробирку объемом 15 мл с 3 мл 0,3% трипсина / PBS. Инкубировать 10-20 мин на водяной бане при температуре 37 °С и переворачивать пробирку несколько раз каждые 2−3 мин.
11. Чтобы остановить ферментативную реакцию, добавьте 3−5 мл ледяной полной питательной среды (модифицированная среда Дульбекко Eagle [DMEM] или RPMI, содержащая 10% FBS). Энергично прокрутите трубку несколько раз. Отфильтруйте суспензию фибробластов через нейлоновую сетку размером 85 мкм (помещенную поверх пробирки объемом 50 мл) для удаления кожного мусора.
12. Центрифуга в течение 10 мин при 150 x g, при 4 °C. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 100−1000 мкл полной питательной среды.
13. Используя трипановый синий (коэффициент разведения x2), смешанный с клеточной суспензией, подсчитайте количество общих и жизнеспособных клеток, заполнив камеру гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток зависит от условий, используемых для ферментативного пищеварения. Чтобы увеличить восстановление клеток и жизнеспособность клеток, образец кожи можно разрезать на более мелкие кусочки.
14. Планшет 3−10 x 10⁴ клетки в 5 мл полной питательной среды FBS (DMEM, 10% FBS, инактивированный теплом в течение 60 мин при 56 °C, 1% 1 М буферного раствора HEPES, 1% 100x смесь заменимых аминокислот, 1% 100x L-глутамин, 1% 100x пенициллин/стрептомицин, 1% 100x пируват натрия) в колбе для культуры тканей 25 см² . Инкубировать при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособные фибробласты прикрепляются к колбе в течение 24 часов и начинают проявлять веретенообразную форму через 2−3 дня.
15. На 2-й день аспирируйте среду, содержащую неадгезивные клетки, и добавьте свежую среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мертвые клетки в питательной среде влияют на рост жизнеспособных фибробластов, неприлипшие, мертвые клетки должны быть удалены из культуры.
16. Меняйте среду каждые 3−4 дня, пока культура не достигнет 70−80% слияния.
17. Чтобы собрать фибробласты, промойте PBS и инкубируйте с раствором трипсина/ЭДТА в течение 3 мин при 37 °C в инкубаторе.
18. Чтобы остановить реакцию, добавляют 3−5 мл теплой полной питательной среды (DMEM или RPMI, содержащей 10% FBS). Возьмите аликвоту клеточной суспензии, чтобы подсчитать клетки с помощью гемоцитометра. Центрифугируют суспензию в течение 5 мин при 200 x g и удаляют среду с помощью аспирации.
19. Культивируют фибробласты в среде PRP (DMEM, 20% PRP, 1% 1 М буферного раствора HEPES, 1% 100x смеси заменимых аминокислот, 1% 100x L-глутамина, 1% 100x пенициллина/стрептомицина, 1% 100x пирувата натрия, 2 ЕД/мл гепарина) в инкубаторе при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная рекомендуемая плотность клеток составляет 4,000 жизнеспособных клеток/^см2.
20. Для оценки влияния PRP на пролиферацию фибробластов семенные фибробласты (пассаж 2) в 24 луночных планшетах с плотностью 8 х 10³ клеток на лунку в среде PRP с различными концентрациями PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% и 50%) и с 2 ЕД/мл гепарина или в условиях классической культуральной среды (10% FBS). После 7 дней культивирования добавьте в клетки жизненно важный краситель (фиолетовый пролиферат клеток) и оцените пролиферацию с помощью проточной цитометрии.
21. Для изучения цитоскелетных перестроек семенные клетки в 96 лунках черных/прозрачных пластин с плоским дном в концентрации 1 x 10 5 клеток/мл в полном ДМЭМ роста FBS (см. шаг 2.14) добавляли^0,5 % FBS в течение 24 ч. Обрабатывайте клетки 10% FBS или различными концентрациями PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% и 50%) в течение 7 дней.
    1. Зафиксируйте фибробласты 4% параформальдегидом в течение 10 мин и пермеабилизируйте 0,1% Triton X-100 в течение 5 мин при ЛТ. Окрасьте фибробласты 50 мл 5 ЕД / мл фаллоидина, промыть 2 раза PBS и пометить 50 мл 1 мг / мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин. Для визуализации окрашивания фаллоидина использовали многомодовый считыватель изображений клеток Cytation 3 (BioTek).

Результаты

Эта запатентованная технология представляет собой простое, быстрое и воспроизводимое медицинское устройство, используемое для производства стандартизированных препаратов PRP. Это одноступенчатая, полностью закрытая система, которая позволяет получать PRP из венозной цельной крови по?...

Обсуждение

Преимущества использования аутологичных фибробластов в качестве естественной альтернативы по сравнению с другими наполнителями в терапии раневых клеток включают хорошую биосовместимость, минимальные побочные эффекты и простоту сбора и использования. Однако, прежде чем использоват...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well black clear flat bottom	BD Falcon	353219	32/case
Cell trace Violet Dye	Thermo Fischer Scientific	C34557	180 assays
CuteCell PRP	Regen Lab SA	CC-PRP-3T	3 tubes per package
DAPI	Sigma	D9542	1 mg
DMEM	Gibco	52400-025	500 mL
FBS	Gibco	10270106	500 mL
Glutamine 200 mM	Gibco	25030024	100 mL
Hematology Counter	Sysmex	KK-21N
Heparin 5000E Liquemine	Drossapharm AG		0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M	Gibco	15630-056	100 mL
Liberase DH	Roche	5401054001	2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x	Gibco	11140-035	100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL	Gibco	11360-039	100 mL
Penicillin streptomycin	Gibco	15140122	100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488	Molecular Probes	A12379	300 units
RPMI	Gibco	31966-021	500 mL
Trypsin 1x 0.25%	Gibco	25050-014	100 mL
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200056	100 mL