Produzione di plasma autologo ricco di piastrine per aumentare l'espansione in vitro dei fibroblasti umani

Riepilogo

Questo protocollo presenta un dispositivo che produce PRP per aumentare l'espansione in vitro delle cellule in un sistema di coltura di fibroblasti autologhi al 100%.

Abstract

Attualmente c'è un grande interesse clinico nell'uso di fibroblasti autologhi per la riparazione della pelle. Nella maggior parte dei casi, è necessaria la coltura di cellule della pelle in vitro. Tuttavia, la coltura cellulare che utilizza terreni di coltura xenogenici o allogenici presenta alcuni svantaggi (ad esempio, rischio di trasmissione di agenti infettivi o lenta espansione cellulare). Qui, viene sviluppato un sistema di coltura autologo per l'espansione delle cellule di fibroblasti della pelle umana in vitro utilizzando il plasma ricco di piastrine (PRP) di un paziente. I fibroblasti dermici umani sono isolati dal paziente durante l'addominoplastica. Le colture vengono seguite per un massimo di 7 giorni utilizzando un terreno integrato con siero bovino fetale (FBS) o PRP. Viene valutato il contenuto delle cellule del sangue nelle preparazioni di PRP, la proliferazione e la differenziazione dei fibroblasti. Questo protocollo descrive il metodo per ottenere una preparazione standardizzata e non attivata di PRP utilizzando un dispositivo medico dedicato. La preparazione richiede solo un dispositivo medico (CuteCell-PRP) e una centrifuga. Questo dispositivo è adatto in condizioni di pratica medica sufficienti ed è un sistema chiuso monopassaggio, apirogeno e sterile che richiede una singola centrifugazione a rotazione morbida di 1.500 x g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, i componenti del sangue vengono separati e il plasma ricco di piastrine viene facilmente raccolto. Questo dispositivo consente una preparazione rapida, coerente e standardizzata del PRP che può essere utilizzato come integratore di coltura cellulare per l'espansione in vitro delle cellule umane. Il PRP qui ottenuto contiene una concentrazione piastrinica di 1,5 volte rispetto al sangue intero insieme, con una rimozione preferenziale dei globuli rossi e bianchi. È dimostrato che il PRP presenta un effetto potenziante nella proliferazione cellulare rispetto alla FBS (7,7x) e che i fibroblasti vengono attivati dopo il trattamento con PRP.

Introduzione

La medicina rigenerativa mira a guarire o sostituire tessuti e organi danneggiati da età, malattie o traumi, nonché a correggere difetti congeniti. Nella terapia autologa, le cellule o i tessuti vengono prelevati da un paziente, espansi o modificati, quindi reintrodotti nel donatore. Questa forma di terapia ha un ampio potenziale nel campo della dermatologia¹. Nella terapia con fibroblasti autologhi, i fibroblasti di un paziente vengono coltivati e reiniettati per trattare rughe, ritidi o cicatrici da acne. Poiché i fibroblasti sono le principali cellule funzionali nel derma, l'iniezione di fibroblasti autologhi può essere più vantaggiosa di altre terapie nel ringiovanimento del viso².

Nella pelle, i fibroblasti sono responsabili della sintesi e della secrezione di proteine extracellulari (cioè collagene, elastina, acido ialuronico e glicosaminoglicani). Rilasciano anche fattori di crescita che regolano la funzione cellulare, la migrazione e le interazioni cellula-matrice / cellula-cellula nella normale omeostasi cutanea e nella guarigione delle ferite³. I fibroblasti dermici sono già stati introdotti come potenziale terapia cellulare clinica per la guarigione delle ferite cutanee⁴, la rigenerazione dei tessuti⁵ o i filler dermici nelle procedure di chirurgia estetica e plastica⁶. Alcuni studi suggeriscono addirittura che, nel contesto della medicina rigenerativa, i fibroblasti possono essere una terapia cellulare più pratica ed efficace rispetto alle cellule staminali mesenchimali⁷.

Per ottenere un numero sufficiente di fibroblasti per applicazioni cliniche, l'espansione cellulare è solitamente obbligatoria. La coltura cellulare ex vivo/in vitro richiede terreno basale integrato con fattori di crescita, proteine ed enzimi per supportare l'adesione e la proliferazione cellulare. Il siero bovino fetale (FBS) è un integratore comune per i terreni di coltura cellulare, perché il sangue fetale 1) è ricco di fattori di crescita rispetto al sangue adulto e 2) presenta un basso contenuto di anticorpi⁸. Con il progredire della terapia cellulare, ci sono preoccupazioni sulla sicurezza delle condizioni di coltura cellulare classica in cui FBS viene aggiunto al terreno di coltura. Inoltre, vi è ora una tendenza a sostituire FBS con alternative⁹. Diversi sostituti FBS hanno mostrato risultati promettenti¹⁰.

L'alternativa al plasma ricco di piastrine (PRP) è stata selezionata qui e abbiamo sviluppato un dispositivo medico per produrre una preparazione standardizzata di PRP, denominata CuteCell-PRP. L'uso previsto di questo dispositivo è la preparazione di PRP autologo da utilizzare come integratore di terreni di coltura per l'espansione in vitro di cellule autologhe in condizioni GMP.

Il PRP è definito come una sospensione piastrinica concentrata nel plasma. Poiché esistono numerosi protocolli di preparazione, che differiscono in 1) la quantità di sangue necessaria, 2) i tipi di dispositivi utilizzati e 3) il protocollo di centrifugazione, le concentrazioni piastriniche risultanti variano da leggermente superiore a oltre 10 volte il valore basale del sangue. Inoltre, i preparati di PRP contengono livelli variabili di contaminazione dei globuli rossi e bianchi. La terminologia "PRP" viene quindi utilizzata per descrivere prodotti che variano notevolmente nella loro composizione biologica e nei potenziali effetti terapeutici.

Nella maggior parte degli studi, la sostituzione FBS si ottiene utilizzando diverse concentrazioni di PRP che viene attivato (da trombina o calcio). Questa attivazione artificiale provoca un rilascio immediato e importante di fattori di crescita piastrinica da 15 min fino a 24 h¹¹. Pertanto, si ritiene che l'attivazione piastrinica sia indesiderabile per le applicazioni in colture cellulari, in cui è richiesto il lento rilascio di fattori di crescita dalla graduale degranulazione piastrinica.

La terapia PRP prevede la preparazione di piastrine autologhe nel plasma concentrato¹². La concentrazione piastrinica ottimale non è chiara e una vasta gamma di dispositivi commerciali sono disponibili per preparare PRP¹³. Questa mancanza di standardizzazione deriva dall'incoerenza tra gli studi e ha portato a una scatola nera per quanto riguarda il dosaggio e la tempistica dell'iniezione. Questo protocollo descrive una procedura per ottenere PRP autologo utilizzando questo dispositivo PRP dedicato per espandere i fibroblasti cutanei in un modello di coltura ex vivo autologo al 100%.

Protocollo

Il protocollo di studio era conforme alla Dichiarazione di Helsinki e tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto prima di partecipare allo studio. I campioni di pelle sono ottenuti da donne sane sottoposte ad addominoplastica nel Dipartimento di Chirurgia Plastica, Ricostruttiva ed Estetica degli Ospedali Universitari di Ginevra (Ginevra, Svizzera). La procedura è conforme ai principi della Dichiarazione di Helsinki ed è stata approvata dal comitato etico istituzionale locale (protocollo #3126).

1. Preparazione del PRP

NOTA: I tubi CuteCell-PRP (Table of Materials) sono progettati per la rapida preparazione del PRP da un piccolo volume di sangue del paziente in un sistema a circuito chiuso.

1. Raccolta di sangue intero
   NOTA: Prelevare sangue autologo da una vena periferica del braccio utilizzando un ago a farfalla direttamente collegato al tubo PRP, secondo il protocollo di raccolta dell'istituto medico. Il sangue può essere prelevato direttamente attraverso la cannula venosa se il paziente è sotto anestesia.
   1. Aprire il blister tubo. Eseguire la puntura venosa e riempire il numero desiderato di tubi PRP con sangue intero. Il vuoto all'interno delle provette consentirà la raccolta automatica del volume di sangue necessario (~ 10 ml).
   2. Capovolgere con attenzione i tubi più volte per mescolare il sangue con l'anticoagulante.
   3. All'interno di un armadio di biosicurezza (classe 2), rimuovere 100 μL di sangue intero totale utilizzando una siringa da 1 mL per ulteriori conteggi del numero di cellule del sangue.
2. Centrifugazione
   NOTA: Assicurarsi che la centrifuga sia bilanciata correttamente prima di avviarla.
   1. Una volta raccolto il sangue nelle provette PRP, se necessario, preparare un tubo controbilanciato (fornito separatamente) con acqua allo stesso livello del sangue nel tubo PRP. Posizionare i tubi riempiti nella centrifuga uno di fronte all'altro, assicurandosi che la macchina sia bilanciata.
   2. Centrifugare i campioni a 1.500 x g per 5 min.
      NOTA: Impostare la velocità di giri corrispondente in base alle istruzioni del produttore della centrifuga. Dopo la centrifugazione, il sangue diventerà frazionato. I globuli rossi e bianchi sono intrappolati sotto il gel e le piastrine si depositano sulla superficie del gel (Figura 1).
3. Capovolgere delicatamente il tubo PRP 20x per risospendere il deposito piastrinico nel surnatante plasmatico.
   NOTA: Assicurarsi che le piastrine siano completamente staccate dal gel. Il plasma dovrebbe cambiare da chiaro e trasparente a torbido. Se sono presenti aggregati piastrinici, devono essere raccolti con il plasma.
4. Per raccogliere il PRP, prelevare la soluzione al plasma dalla provetta utilizzando un dispositivo di trasferimento della siringa collegato a una siringa da 10 ml.
   NOTA: Da ogni provetta si otterranno circa 5 ml di PRP. La soluzione PRP è ora pronta per essere miscelata nella preparazione finale del mezzo. La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente (RT) sotto l'armadio di sicurezza fino alle fasi future che coinvolgono l'analizzatore ematologico e l'uso.
5. Prima di utilizzare il PRP, determinare la concentrazione piastrinica, il volume piastrinico medio e il numero di globuli rossi e bianchi utilizzando un analizzatore ematologico automatizzato (tabella del materiale). Per fare ciò, prelevare con cautela 100 μL della soluzione e trasferirli in un tubo da 1,5 ml.
   NOTA: PRP è usato come integratore di coltura autologa ad una concentrazione compresa tra 5-20% v / v. La concentrazione ottimale di PRP deve essere determinata per ogni linea cellulare. Per prevenire la formazione di coaguli di fibrina, il terreno di coltura finale deve essere integrato con 2 U/mL di eparina.

2. Isolamento di fibroblasti autologhi e coltura in terreni integrati con FBS o PRP

1. Lavare i campioni di pelle in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) agitando delicatamente in un tubo di polipropilene da 50 ml.
2. Se il campione di pelle è relativamente grande (>10 cm 2), posizionare il campione sul coperchio di una capsula di coltura tissutale di 150 cm² (lato epidermico verso il basso). Rimuovere il tessuto adiposo sottocutaneo usando un paio di pinze e forbici. Per evitare che il tessuto si secchi, sciacquare il tessuto ogni pochi minuti in PBS.
   NOTA: Utilizzare un piatto di coltura tissutale più piccolo per campioni più piccoli.
3. Quando il taglio del grasso è completo, tagliare il tessuto in strisce di circa 0,5 cm x 1,5 cm usando un bisturi sterile.
4. Aggiungere 5 mL di miscela collagenasi-dispasi (Tabella dei materiali; 14 unità di Wünsch/ml) in un tubo sterile da 15 ml.
5. Trasferire il tessuto tagliato nel tubo, assicurandosi che i pezzi di tessuto siano immersi nella soluzione. Tappare saldamente il tubo.
6. Posizionare i tubi in un'incubatrice a 37 °C con agitazione orbitale per 150 minuti. Dopo l'incubazione, posizionare il tubo contenente il tessuto nell'armadio di biosicurezza.
7. Posizionare il coperchio di un piatto di coltura sterile da 100 mm capovolto nell'armadio di biosicurezza. Trasferire la soluzione di tessuto digerito sul fondo del piatto di coltura da 100 mm, senza schizzi. Se nel tubo rimangono pezzi di tessuto, utilizzare una pipetta sterile da 1 mL o una pinza sterile per trasferire i pezzi di tessuto sul fondo del piatto di coltura da 100 mm.
8. Con la striscia dell'epidermide rivolta verso l'alto, separare il foglio dell'epidermide intatto dal derma usando due paia di pinze. Tenere il derma della striscia di tessuto con un paio di pinze e il bordo dell'epidermide con un altro paio di pinze. Staccare il derma e l'epidermide in due pezzi, mantenendo i pezzi separati sulla stessa palpebra. Prova a eseguire rapidamente questo passaggio e ripeti la manipolazione per ogni pezzo di tessuto.
9. Trasferire i pezzi dermici in un nuovo piatto di coltura da 100 mm contenente PBS.
10. Utilizzando una pinza da laboratorio, posizionare i pezzi dermici in un tubo di polipropilene da 15 ml con 3 ml di tripsina / PBS allo 0,3%. Incubare per 10-20 minuti a bagnomaria a 37 °C e capovolgere il tubo più volte ogni 2-3 minuti.
11. Per fermare la reazione enzimatica, aggiungere 3-5 ml di terreno di coltura completo ghiacciato (terreno di coltura Eagle modificato di Dulbecco [DMEM] o RPMI contenente il 10% di FBS). Vortice il tubo vigorosamente più volte. Filtrare la sospensione di fibroblasti attraverso una rete di nylon da 85 μm (posizionata sopra la parte superiore di un tubo da 50 ml) per rimuovere i residui dermici.
12. Centrifugare per 10 min a 150 x g, a 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 100−1.000 μL di terreno di crescita completo.
13. Utilizzando il blu di tripano (fattore di diluizione x2) miscelato con la sospensione cellulare, contare il numero di cellule totali e vitali riempiendo la camera dell'emocitometro.
    NOTA: La vitalità cellulare dipende dalle condizioni utilizzate per la digestione enzimatica. Per aumentare il recupero cellulare e la vitalità cellulare, il campione di pelle può essere tagliato in pezzi più piccoli.
14. Piastra 3-10 x 10⁴ cellule in 5 ml di terreno di coltura FBS completo (DMEM, 10% FBS inattivato termicamente per 60 minuti a 56 °C, 1% 1 M soluzione tampone HEPES, 1% 100x miscela di aminoacidi non essenziali, 1% 100x L-glutammina, 1% 100x penicillina/streptomicina, 1% 100x piruvato di sodio) in un matraccio di coltura tissutale 25 cm² . Incubare a 37 °C.
    NOTA: I fibroblasti vitali si attaccheranno al pallone entro 24 ore e inizieranno a mostrare la forma del fuso in 2-3 giorni.
15. Il giorno 2, aspirare il terreno contenente cellule non aderenti e aggiungere terreno fresco.
    NOTA: Poiché le cellule morte nel terreno di coltura influenzano la crescita dei fibroblasti vitali, le cellule morte non aderenti devono essere rimosse dalla coltura.
16. Cambiare il terreno ogni 3-4 giorni fino a quando la coltura raggiunge il 70-80% di confluenza.
17. Per raccogliere i fibroblasti, lavare con PBS e incubare con soluzione di tripsina/EDTA per 3 minuti a 37 °C nell'incubatore.
18. Per interrompere la reazione, aggiungere 3-5 ml di terreno di coltura completo caldo (DMEM o RPMI contenente il 10% di FBS). Prendere un'aliquota della sospensione cellulare per contare le cellule con l'emocitometro. Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 200 x g e rimuovere il fluido mediante aspirazione.
19. Coltura del fibroblasto in terreno PRP (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M soluzione tampone HEPES, 1% 100x miscela di aminoacidi non essenziali, 1% 100x L-glutammina, 1% 100x penicillina/streptomicina, 1% 100x piruvato di sodio, 2 U/mL eparina) nell'incubatore a 37 °C.
    NOTA: La densità minima di cella raccomandata è di 4.000 cellule vitali/cm².
20. Per valutare gli effetti del PRP sulla proliferazione dei fibroblasti, i fibroblasti del seme (passaggio 2) in piastre da 24 pozzetti ad una densità di 8 x 10³ cellule per pozzetto in mezzo PRP con diverse concentrazioni di PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50%) e con 2 U/mL di eparina o in condizioni di terreno di coltura classico (10% FBS). Dopo 7 giorni di coltura, aggiungere un colorante vitale (viola di proliferazione cellulare) alle cellule e valutare la proliferazione mediante citometria a flusso.
21. Per studiare i riarrangiamenti citoscheletrici, le cellule seme in 96 piastre a fondo piatto nero / chiaro a una concentrazione di 1 x 10 5 cellule / ml in DMEM di crescita FBS completa (vedi fase 2.14) integrato con^0,5 % FBS per 24 ore. Trattare le cellule con FBS al 10% o diverse concentrazioni di PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50%) per 7 giorni.
    1. Fissare i fibroblasti con paraformaldeide al 4% per 10 minuti e permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,1% per 5 minuti su RT. Colorare i fibroblasti con 50 ml di falloidina 5 U/mL, lavare 2x con PBS e marcare con 50 ml di 1 mg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti. Il lettore multimodale di imaging cellulare Cytation 3 (BioTek) è stato utilizzato per visualizzare la colorazione della falloidina.

Risultati

Questa tecnologia brevettata è un dispositivo medico semplice, veloce e riproducibile utilizzato per produrre preparati PRP standardizzati. Si tratta di un sistema monopassaggio, completamente chiuso che consente la preparazione di PRP da sangue venoso intero dopo 5 minuti di centrifugazione a 1.500 x g (grazie alla tecnologia del gel separatore). Il PRP ottenuto dopo la centrifugazione viene eliminato dai globuli rossi e bianchi, che si trovano sotto il gel. Dopo diverse inversioni del tubo, le piastrine che s...

Discussione

I vantaggi dell'utilizzo di fibroblasti autologhi come alternativa naturale rispetto ad altri materiali di riempimento nella terapia cellulare della ferita includono una buona biocompatibilità, effetti collaterali minimi e facilità di raccolta e utilizzo. Tuttavia, prima di utilizzare queste terapie in un contesto clinico quotidiano, sono necessari studi preclinici adeguati per identificare le caratteristiche di crescita e valutare la funzione biologica e la sicurezza dei fibroblasti isolati sia prima che dopo il trapi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well black clear flat bottom	BD Falcon	353219	32/case
Cell trace Violet Dye	Thermo Fischer Scientific	C34557	180 assays
CuteCell PRP	Regen Lab SA	CC-PRP-3T	3 tubes per package
DAPI	Sigma	D9542	1 mg
DMEM	Gibco	52400-025	500 mL
FBS	Gibco	10270106	500 mL
Glutamine 200 mM	Gibco	25030024	100 mL
Hematology Counter	Sysmex	KK-21N
Heparin 5000E Liquemine	Drossapharm AG		0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M	Gibco	15630-056	100 mL
Liberase DH	Roche	5401054001	2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x	Gibco	11140-035	100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL	Gibco	11360-039	100 mL
Penicillin streptomycin	Gibco	15140122	100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488	Molecular Probes	A12379	300 units
RPMI	Gibco	31966-021	500 mL
Trypsin 1x 0.25%	Gibco	25050-014	100 mL
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200056	100 mL