Y-27632 يثري العائد من الخلايا الصباغية البشرية من أنسجة الجلد الكبار

Summary

هذه الورقة تفيد بأن إضافة Y-27632 إلى تيفا المتوسطة يمكن أن تزيد بشكل كبير من العائد من الخلايا الصباغية من أنسجة الجلد الكبار.

Abstract

إن عزل وثقافة الخلايا الصباغية الأولية من أنسجة الجلد مهمة جداً للبحوث البيولوجية وقد استخدمت على نطاق واسع للتطبيقات السريرية. عزل الخلايا الصباغية الأولية من أنسجة الجلد عن طريق الطريقة التقليدية عادة ما يستغرق حوالي 3 إلى 4 أسابيع لتمرير ما يكفي. والأهم من ذلك، فإن الأنسجة المستخدمة عادة ما تكون من قبل الوليد، ولا يزال يشكل تحدياً لعزل الخلايا الصباغية الأولية بكفاءة عن الأنسجة البالغة. لقد طورنا مؤخرًا طريقة عزل جديدة للميلانوسيات تضيف Y-27632، وهو مثبط Rho kinase، إلى متوسط الثقافة الأولي لمدة 48 ساعة. نحن الآن وصف هذه الطريقة الجديدة بمزيد من التفصيل باستخدام البشرة الكبار لثقافة بكفاءة الخلايا الصباغية الأولية. الأهم من ذلك، ونحن نظهر أن الخلايا الصباغية التي تم الحصول عليها من أنسجة البالغين التي أعدتها هذه الطريقة الجديدة يمكن أن تعمل بشكل طبيعي. هذا البروتوكول الجديد سوف تستفيد بشكل كبير دراسات عيوب التصبغ والميلانوما باستخدام الخلايا الميلانوسية الأولية التي أعدت من أنسجة الجلد الكبار الوصول إليها بسهولة.

Introduction

كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير بروتوكول بسيط وفعال لعزل الخلايا الصباغية عن البشرة من الجلد للبالغين للأبحاث البيولوجية والتطبيقات السريرية. الصباغيات، التي تقع في البشرة القاعدية من الجلد وفي بصيلات الشعر، تلعب دورا هاما في تصبغ الجلد والشعر من خلال إنتاج الميلانين¹. إن تصبغ الجلد الناتج من الخلايا الصباغية الجلدية يعمل كمصفاة للأشعة فوق البنفسجية التي تقلل / تمنع تلف الحمض النووي للخلايا الكامنة في الجلد². انتشار غير طبيعي من الخلايا الصباغية في الجلد أمر شائع جدا، كما هو الحال في تشكيل نيفي حميدة (الشامات) التي الخلايا الصباغية يحتمل أن تتحول إلى نمو oncogenic تليها الشيخوخة الخلوية³.

منذ عام 1957، كانت العزلة والثقافة اللاحقة للميلانوسيات الأولية البشرية ممكنة⁴، ولكن فقط منذ عام 1982 كان هناك طريقة فعالة يمكن أن تنشئ ثقافات الخلايا الميلانوسية البشرية من البشرة^5. الطريقة التقليدية لعزل الخلايا الصباغية الأولية من البشرة ينطوي على هضم الأنزيمية على خطوتين. باختصار ، يتم هضم الجلد في البداية مع عدم السيك مع فصل البشرة عن الأدمة ، وبعد ذلك يتم هضم البشرة مع التربسين لإنتاج تعليق يحتوي على الخلايا الصباغية والكيرتينوسيات ، والتي يمكن بعد ذلك أن تزرع بشكل انتقائي في وسائل الإعلام المختلفة. حاليا، والثقافة الأولية عادة ما يستغرق حوالي 3 إلى 4 أسابيع للميلانوسيات للوصول إلى التقاء باستخدام الطريقة التقليدية، والتي من المرجح أن يرجع ذلك إلى انخفاض كفاءة عزلتهم. لذلك، فإن زيادة الإنتاج الأولي للميلانوسيات من أنسجة الجلد البالغة تكون مفيدة جداً لكل من البحوث المختبرية والتطبيقات السريرية.

العديد من عوامل النمو, وقد ثبت أن معظمها تفرز بواسطة keratinocytes (على سبيل المثال, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF و SCF)^5-8-8, تنظيم تمايز وانتشار الميلانوسيات الثدييات. في غياب طبقات التغذية، وعدم وجود تلك العوامل النمو يؤدي إلى انخفاض انتشار الخلايا الصباغية وزيادة المبرمج⁹. يمكن أن تؤدي الثقافة المشتركة للكيراتينوسيات كخلايا مغذيات والخلايا الصباغية إلى انتشار الصباغي المتسارع وتقليل المبرمج. ومع ذلك، فإن طريقة الثقافة المشتركة لا تتطلب فقط المزيد من أنسجة الجلد لإعداد الكيراتينوسيات، وهو أمر غير عملي، ولكن أيضا لا يمكن أن تعمل بكفاءة لأن ظروف الثقافة المطلوبة من قبل الخلايا الصباغية لا تفضل نمو الكيراتينوسيت، والعكس بالعكس.

وقد ذكرت الدراسات السابقة أن إضافة Y-27632، وهو المانع روك، في وسط النمو يمكن أن تعزز من العائد من خلايا البشرة الأولية البشرية من أنسجة الجلد^10-14-14. ولذلك، سيكون من المثير للاهتمام لاختبار ما إذا كان عزل الخلايا الصباغية الأولية البشرية سوف تستفيد من وجود Y-27632. في الواقع، إضافة Y-27632 في التفا المتوسطة¹⁵، الذي يحتوي على TPA، IBMX،_{نا 3}VO₄ و dbcAMP، زادت بشكل كبير من العائد من الخلايا الصباغية الأولية المعزولة من أنسجة الدبلين في الثقافات الأولية¹⁶. بالمقارنة مع البروتوكول التقليدي، هذا البروتوكول الجديد هو أكثر كفاءة في زيادة العائد من الخلايا الصباغية¹⁶. لذلك، يصف هذا البروتوكول الطريقة الجديدة بالتفصيل باستخدام أنسجة الجلد للبالغين على أساس دراسة سابقة¹⁶ من أجل تعزيز تطبيقها في البحوث البيولوجية الأساسية والتطبيقية.

Protocol

وقد وافقت لجنة أخلاقيات البحوث البشرية على استخدام أنسجة قلفة البالغين في هذا البروتوكول (رقم 2015120401، التاريخ: 12 مايو 2015).

ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات التالية في بيئة معقمة لمنع تلوث الخلايا والثقافات.

1- الأعمال التحضيرية

1. جمع أنسجة قلفة الكبار الطازجة من عمليات الختان الجراحية في أنابيب 15 مل تحتوي على 10 مل من الفوسفات المالحة العازلة (PBS) وتخزينها في 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: فصل الأنسجة على النحو المفصل أدناه في غضون 24 ساعة بعد الختان.
2. إعداد الكواشف والثقافة المتوسطة.
   1. إعداد 3٪ P / S (البنسلين / ستريبتوميسين) كحل الغسيل. مزيج 50 مل من برنامج تلفزيوني مع 1.5 مل من البنسلين (100 U /mL) وstreptomycin (100 ملغ / لتر) (P / S).
   2. إعداد حل الإنهاء (حل تحييد) لتحييد الهضم الأنزيمي. ملحق 1٪ P / S، 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) في المتوسط DMEM.
   3. إعداد تيفا المتوسطة إلى الخلايا الصباغية الثقافة: لحم الخنزير F12; 10٪ FBS؛ 1x P/S/S Glutamine; 50 نانوغرام/مل 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-خلات (TPA)؛ 1 x 10^-4 M 3-isobutyl-1-ميثيل زانتين (IBMX); 1 μM_{Na 3}VO₄؛ 1 × 10^-3 M N-6,2′-O-ديبوتيريلدينوزين-3′, 5′-دوري أحادي الفوسفات (dbcAMP).

2. الطريقة التقليدية

1. المعالجة المسبقة للأنسجة الجلدية
   1. شطف كل قلفة الكبار مرة واحدة مع 10 مل من 75٪ الإيثانول (الكحول) لمدة 30 s، ثم شطف مرتين مع 10 مل من محلول الغسيل (3٪ P / S)، لمدة 5 دقائق لكل من.
      ملاحظة: غسل الأنسجة قبل الظهر مع 10 مل من برنامج تلفزيوني في البداية إذا كان هناك الكثير من الدم. يتم إعداد جميع الغسلات في أطباق ثقافة الخلايا 100 ملم.
   2. كشط كل نسيج من الأنسجة مع شفرة الجراحية لإزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد والأنسجة الضامة فضفاضة في غلاف طبق ثقافة خلية 100 ملم.
      ملاحظة: استخدم مشرطًا لكشط طبقات الدهون حتى يبقى البشرة الرقيقة والأدمة الكثيفة فقط.
   3. نقل كل قبلة الكبار في آخر 100 مم طبق الثقافة مع الجانب الأدمة إلى أسفل.
      ملاحظة: قطع كل أنسجة قلفة الكبار إلى 3-4 ملم شرائط واسعة باستخدام شفرة مشرط لجعل عمل dispase أكثر كفاءة.
   4. إضافة 2.5 ملغ / مل dispase إلى كل 100 ملم طبق الثقافة مع أنسجة قلفة الكبار واحتضان لمدة 16 إلى 20 ساعة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يتم هضم كل غرام من الأنسجة مع 10 مل من محلول الخلع.
2. فصل البشرة عن أنسجة اللزجة البالغة
   1. بعد الهضم لمدة 16 إلى 20 ساعة، افصل البشرة عن الأدمة باستخدام الملاقط. الاستيلاء على جانب واحد من حافة الجلد من الأنسجة مع ملاقط واحد والموقف المقابل للجزء البشرة مع آخر مع ملاقط وقشر بلطف قبالة البشرة.
   2. اغسل البشرة 3x بمحلول الغسيل (3% P/S)، ثم قم بنقل البشرة إلى أنبوب.
   3. غمر البشرة عن طريق إضافة 5 مل من 0.05٪ التربسين في أنبوب واحتضان في حمام مائي لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: هز الأنبوب لضمان غمر البشرة بالكامل قبل الحضانة.
3. جمع الخلايا الأساسية وثقافتها
   1. إضافة حجم مساو من حل الإنهاء (10٪ FBS، 1٪ P / S في DMEM) لتحييد التربسين والماصات الحل صعودا وهبوطا 10-15 مرات لفصل خلايا البشرة.
   2. مرر تعليق الخلية إلى أنبوب جديد 50 مل من خلال مرشح شبكة 100 ميكرومتر لإزالة الحطام.
   3. جهاز طرد مركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
   4. إزالة فائقة وإضافة 10 مل من التطعيم تيفا المتوسطة لإعادة تعليق الخلايا.
   5. بذور الخلايا resuspended في طبق ثقافة 100 ملم.
   6. الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
   7. تغيير الوسط كل 2 أيام.
   8. مرور الخلايا عندما تصل إلى التقاء 80٪.

3. الطريقة الجديدة

ملاحظة: الإجراء لإعداد الأنسجة والهضم في طريقة جديدة هو نفسه كما هو موضح أعلاه للأسلوب التقليدي، والفرق الوحيد هو أن الخلايا الطازجة المعزولة هي resuspended في 10 مل من تيفا المتوسطة التي تحتوي على 10 μM Y-27632.

1. بعد يومين من البذر، استبدل الوسائط بوسيلة تيفا العادية بدون Y-27632. بعد ذلك، شروط الثقافة هي نفسها بين الأساليب الجديدة والتقليدية.

4. تمرير الخلية

1. إزالة المتوسطة تيفا وشطف كل طبق الثقافة مرتين مع برنامج تلفزيوني.
2. إضافة 2 مل من 0.05٪ التربسين لكل 100 ملم طبق ثقافة الخلية.
   ملاحظة: هز الطبق لضمان الاتصال الكافي بين الإنزيمات الهضمية والجزء السفلي من الطبق.
3. جسّد في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
4. استخدام المجهر للتحقق من الخلايا، وتأكد من أن معظم الخلايا قد فصلت من طبق ثقافة الخلية.
   ملاحظة: اضغط بلطف على الطبق لتحرير الخلايا لتجميعها وتعويمها في المحلل. إطالة وقت الهضم إذا لم تعلق معظم الخلايا بعد النقر ، ولكن لا يزيد عن 5 دقائق أكثر.
5. نقل الخلايا الصباغية في أنبوب 15 مل بعد تحييد نشاط التربسين بإضافة 2 مل من حل الإنهاء. جهاز طرد مركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
6. Resuspend كل بيليه الخلية مع 10 مل من تيفا المتوسطة بعد إزالة ببطء supernatant، ومن ثم عد عدد الخلايا الصباغية.
7. لوحة حول 1 × 10⁶ الخلايا الصباغية في 10 مل من تيفا المتوسطة لكل 100 ملم طبق ثقافة الخلية.
8. تجديد خلية ثقافة المتوسطة كل 48 ح.

النتائج

يظهر الشكل 1 رسم تخطيطي يقارن بين الأساليب التقليدية والجديدة. الإجراء لإعداد الأنسجة والهضم مع طريقة جديدة هو نفس الإجراء للأسلوب التقليدي، والفرق الوحيد هو أن الخلايا المعزولة هي إعادة تعليق في 10 مل من تيفا المتوسطة في وجود 10 μM Y-27632. بعد يومين من البذر، استبدل الوسائط بو?...

Discussion

واستند البروتوكول الموصوف هنا إلى منشور صدر مؤخراً¹⁶. وينبغي إيلاء بعض الاهتمام للخطوات الحاسمة التالية لتحقيق أفضل النتائج باستخدام الأسلوب الجديد. أولاً، الفصل الناجح بين البشرة والأدمة أمر بالغ الأهمية. قطع أنسجة قلفة الكبار إلى شرائط واسعة 3-4 مم باستخدام شفرة مشرط لجعل ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA)	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation