Y-27632 Enriquece o rendimento de melanócitos humanos de tecidos de pele adultos

Resumo

Este artigo relata que a adição de Y-27632 ao meio TIVA pode aumentar significativamente o rendimento de melanócitos de tecidos de pele adultos.

Resumo

O isolamento e a cultura dos melanócitos primários dos tecidos da pele é muito importante para a pesquisa biológica e tem sido amplamente utilizado para aplicações clínicas. Isolar melanócitos primários dos tecidos da pele pelo método convencional geralmente leva cerca de 3 a 4 semanas para passar o suficiente. Mais importante, os tecidos utilizados geralmente são prepúcios recém-nascidos e ainda é um desafio isolar eficientemente os melanócitos primários de tecidos adultos. Recentemente desenvolvemos um novo método de isolamento para melanócitos que adiciona Y-27632, um inibidor de Rho quinase, ao meio de cultura inicial por 48 h. Em comparação com o protocolo convencional, este novo método aumenta drasticamente o rendimento dos melanócitos e encurta o tempo necessário para isolar melanócitos de tecidos foreskin. Descrevemos agora este novo método com mais detalhes usando epiderme adulta para cultivar de forma eficiente melanócitos primários. É importante ressaltar que os melanócitos obtidos a partir de tecidos adultos preparados por este novo método podem funcionar normalmente. Este novo protocolo beneficiará significativamente os estudos de defeitos de pigmentação e melanomas usando melanócitos primários preparados a partir de tecidos de pele adultos de fácil acesso.

Introdução

O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo simples e eficaz para isolar melanócitos da epiderme da pele adulta para pesquisa biológica e aplicações clínicas. Os melanócitos, localizados na epiderme basal da pele e nos folículos capilares, desempenham um papel importante na pigmentação da pele e do cabelo, produzindo melanina¹. A pigmentação da pele resultante dos melanócitos epidérmicos atua como um filtro de radiação ultravioleta que reduz/previne danos ao DNA às células subjacentes na pele². A proliferação anormal de melanócitos na pele é bastante comum, como na formação de nevi benigno (mols) em que os melanócitos potencialmente se transformam em crescimento oncogênico seguido pela senescência celular³.

Desde 1957, o isolamento e a cultura subsequente dos melanócitos primários humanos são possíveis⁴, mas somente desde 1982 existe um método eficiente que pode estabelecer de forma reproduzivelmente culturas de melanócitos humanos a partir da epiderme⁵. O método convencional para isolar melanócitos primários da epiderme envolve uma digestão enzimática de duas etapas. Resumidamente, a pele é inicialmente digerida com despase para separar a epiderme da derme, após a qual a epiderme é digerida com trippsina para produzir suspensões contendo melanócitos e queratinócitos, que podem então ser cultivados seletivamente em diferentes mídias. Atualmente, a cultura inicial geralmente leva cerca de 3 a 4 semanas para que os melanócitos atinjam a confluência usando o método convencional, o que é provável devido à baixa eficiência de seu isolamento. Portanto, aumentar a produção inicial de melanócitos a partir de tecidos de pele adultos seria bastante útil tanto para pesquisas laboratoriais quanto para aplicações clínicas.

Muitos fatores de crescimento, a maioria dos quais têm se mostrado secretados por queratinócitos (por exemplo, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF e SCF)^5-8, regulam a diferenciação e proliferação de melanócitos mamíferos. Na ausência de camadas alimentadores, a falta desses fatores de crescimento leva à diminuição da proliferação de melanócitos e ao aumento da apoptose⁹. A co-cultura dos queratinócitos como células alimentadoras e melanócitos poderia levar à acelerada proliferação de melanócitos e à redução da apoptose. No entanto, o método de cocultura não só exige mais tecidos da pele para preparar queratinócitos, o que não é prático, mas também não poderia funcionar de forma eficiente porque as condições culturais exigidas pelos melanócitos não favorecem o crescimento do queratinócito, e vice-versa.

Estudos anteriores relataram que a adição do Y-27632, um inibidor de ROCHA, no meio de crescimento pode aumentar o rendimento das células epidérmicas primárias humanas dos tecidos da pele^10-14. Portanto, seria interessante testar se o isolamento dos melanócitos primários humanos beneficiaria da presença de Y-27632. De fato, a adição de Y-27632 no meio TIVA de inoculação¹⁵, que contém TPA, IBMX, Na₃VO₄ e dbcAMP, aumentou significativamente o rendimento de melanócitos primários isolados dos tecidos prepúcios nas culturas iniciais¹⁶. Em comparação com o protocolo convencional, este novo protocolo é significativamente mais eficiente no aumento do rendimento dos melanócitos¹⁶. Portanto, este protocolo descreve o novo método em detalhes utilizando tecidos de pele adultos com base em um estudo anterior^16, a fim de promover sua aplicação em pesquisas biológicas básicas e aplicadas.

Protocolo

O uso de tecidos de prepúcio adulto neste protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana (nº 2015120401, data: 12 de maio de 2015).

NOTA: Realize todos os seguintes procedimentos em um ambiente estéril para evitar contaminações de células e culturas.

1. Preparativos

1. Reúna tecidos de prepúcio adulto frescos de cirurgias de circuncisão em tubos de 15 mL contendo 10 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) e armazene em 4 °C.
   NOTA: Separe os tecidos conforme detalhado abaixo dentro de 24 horas após sua excisão.
2. Prepare reagentes e meio de cultura.
   1. Prepare 3% P/S (penicilina/estreptomicina) como solução de lavagem. Misture 50 mL de PBS com 1,5 mL de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/L) (P/S).
   2. Prepare a solução de terminação (solução de neutralização) para neutralização da digestão enzimática. Suplementação 1% P/S, 10% soro bovino fetal (FBS) em meio DMEM.
   3. Preparar melanócitos tiva para cultura: F12 de Ham; 10% FBS; 1x P⁄S⁄glutamina; 50 ng/mL 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato (TPA); 1 x 10^-4 M 3-isobutyl-1-metil xanthine (IBMX); 1 μm na₃VO_4; 1 x 10^-3 M N-6,2′-O-dibutyryladenosine-3′,5′-cíclico monofosfato (dbcAMP).

2. O método convencional

1. Pré-tratamento do tecido da pele
   1. Enxágüe cada tecido prepúcio adulto uma vez com 10 mL de 75% de etanol (álcool) para 30 s, e depois enxágue duas vezes com 10 mL de solução de lavagem (3% P/S), por 5 min cada.
      NOTA: Lave os tecidos de prepúcio com 10 mL de PBS no início se houver muito sangue. Todas as lavagens são preparadas em pratos de cultura celular de 100 mm.
   2. Raspe cada tecido de prepúcio com uma lâmina cirúrgica para remover tecidos adiposos subcutâneos e tecidos conjuntivos soltos na tampa de um prato de cultura celular de 100 mm.
      NOTA: Use um bisturi para raspar as camadas de gordura até que apenas a epiderme fina e a derme densa permaneçam.
   3. Transfira cada prepúcio adulto para outro prato de cultura de 100 mm com o lado dermis para baixo.
      NOTA: Corte cada tecido de prepúcio adulto em tiras de 3-4 mm de largura usando uma lâmina de bisturi para fazer o dispase funcionar de forma mais eficiente.
   4. Adicione 2,5 mg/mL dispase a cada prato de cultura de 100 mm com tecidos de prepúcio adulto e incubar por 16 a 20 h a 4 °C.
      NOTA: Cada grama de tecido é digerido com 10 mL de solução de despase.
2. Separação da epiderme do tecido prepúcio adulto
   1. Após a digestão por 16 a 20 h, separe a epiderme da derme usando pinças. Pegue um lado da borda dérmica do tecido com uma pinça e a posição correspondente da parte epidérmica com outra pinça e retire suavemente a epiderme.
   2. Lave a epiderme 3x com solução de lavagem (3% P/S) e, em seguida, transfira a epiderme para um tubo.
   3. Submergir a epiderme adicionando 5 mL de 0,05% de trippsina no tubo e incubar em um banho de água por 30 min a 37 °C.
      NOTA: Agite o tubo para garantir que a epiderme esteja completamente submersa antes da incubação.
3. Coleta e cultura de células primárias
   1. Adicione um volume igual de solução de terminação (10% FBS, 1% P/S em DMEM) para neutralizar a trippsina e pipetar a solução para cima e para baixo 10-15 vezes para separar as células epidérmicas.
   2. Passe a suspensão da célula em um novo tubo de 50 mL através de um filtro de malha de 100 μm para remover detritos.
   3. Centrifugar a 200 x g por 5 min.
   4. Remova o supernascimento e adicione 10 mL de meio TIVA de inoculação para resuspensar as células.
   5. Semear as células resuspended em um prato de cultura de 100 mm.
   6. Cultura em uma incubadora de 37° C com 5% de CO₂.
   7. Troque o meio a cada 2 dias.
   8. Células de passagem quando atingem 80% de confluência.

3. O novo método

NOTA: O procedimento de preparação e digestão tecidual no novo método é o mesmo descrito acima para o método convencional, sendo que as únicas células frescas isoladas são resuspengiadas em 10 mL de meio TIVA contendo 10 μM Y-27632.

1. Dois dias após a semeadura, substitua a mídia por um meio TIVA normal sem Y-27632. Depois disso, as condições culturais são as mesmas entre os métodos novos e convencionais.

4. Passagem celular

1. Retire o meio TIVA e enxágue cada prato de cultura duas vezes com PBS.
2. Adicione 2 mL de 0,05% de trippsina por prato de cultura celular de 100 mm.
   NOTA: Agite o prato para garantir o contato adequado entre enzimas digestivas e o fundo do prato.
3. Digerir em uma incubadora de 37 °C por 2 min.
4. Use um microscópio para verificar as células, e certifique-se de que a maioria das células se dissociou do prato de cultura celular.
   NOTA: Toque suavemente no prato para soltar as células para arredondar e flutuar na solução. Prolongue o tempo de digestão se a maioria das células não suspender após o toque, mas não mais do que 5 minutos.
5. Transfira os melanócitos para um tubo de 15 mL depois de neutralizar a atividade de trippsina adicionando 2 mL de solução de rescisão. Centrifugar a 200 x g por 5 min.
6. Resuspengue cada pelota celular com 10 mL de meio TIVA depois de remover lentamente o supernasce e, em seguida, contar o número de melanócitos.
7. Placa cerca de 1 x 10⁶ melanócitos em 10 mL de meio TIVA por prato de cultura celular de 100 mm.
8. Renove o meio de cultura celular a cada 48 horas.

Resultados

A Figura 1 mostra um diagrama esquemático comparando os métodos convencionais e os novos. O procedimento de preparação e digestão tecidual com o novo método é o mesmo que o procedimento para o método convencional, sendo que a única diferença é que as células isoladas são resuspengiadas em 10 mL de meio TIVA na presença de 10 μM Y-27632. Dois dias após a semeadura, substitua a mídia por um meio TIVA normal sem Y-27632. O método convencional de isolar melanócitos primários ...

Discussão

O protocolo descrito aqui foi baseado em uma publicação recente¹⁶. Alguma atenção deve ser dada aos seguintes passos críticos para alcançar os melhores resultados com o novo método. Em primeiro lugar, a separação bem sucedida da epiderme e da derme é crucial. Corte os tecidos de prepúcio adulto em tiras de 3-4 mm de largura usando uma lâmina de bisturi para fazer o dispase funcionar com mais profundidade e facilidade para separar a epiderme da derme. Em segundo lugar, ao separar essas ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA)	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation