Y-27632 丰富成人皮肤组织中人类黑色素细胞的产量

摘要

本文报告，在TIVA培养基中加入Y-27632可以显著提高成人皮肤组织中黑色素细胞的产生。

摘要

原发性黑色素细胞与皮肤组织的分离和培养在生物研究中非常重要，已广泛应用于临床应用。通过传统方法从皮肤组织中隔离原发性黑色素细胞通常需要大约 3 到 4 周才能充分通过。更重要的是，使用的组织通常是新生儿前皮，从成人组织中有效分离原发性黑色素细胞仍然是一个挑战。我们最近开发了一种新的黑色素细胞分离方法，将Y-27632（一种Rho激酶抑制剂）添加到初始培养基48小时。 与常规方案相比，这种新方法显著提高了黑色素细胞的产量，缩短了从前皮组织中分离黑色素细胞的时间。我们现在更详细地描述这种新方法，使用成人表皮来有效地培养原发性黑色素细胞。重要的是，我们表明，从这种新方法编写的成人组织中获得的黑色素细胞可以正常工作。这一新协议将显著有利于研究色素沉着缺陷黑色素瘤使用原发性黑色素细胞准备从容易访问的成人皮肤组织。

引言

本研究的目标是开发一种简单有效的方案，将黑色素细胞从成人皮肤的表皮中分离，用于生物研究和临床应用。黑色素细胞位于皮肤和毛囊的基底表皮中，通过产生黑色素^1，在皮肤和头发色素沉着中发挥重要作用。表皮黑色素细胞产生的皮肤色素沉着作为紫外线辐射过滤器，减少/防止DNA损伤皮肤基础细胞^2。黑色素细胞在皮肤中的异常增殖是很常见的，例如在良性neve（摩尔）的形成中，其中黑色素细胞有可能转化为致癌生长，然后是细胞衰老^3。

自1957年以来，人类原发性黑色素细胞的分离和随后的培养已经^{成为可能4，}但自1982年以来，才有一种有效的方法，可以从表皮5中重现人类黑色素细胞^的培养。将原发性黑色素细胞与表皮分离的传统方法涉及两步酶消化。简言之，皮肤最初被消化与脱皮，以分离表皮从真皮，然后表皮消化与三普辛产生悬浮液含有黑色素细胞和角蛋白细胞，然后可以有选择地生长在不同的介质。目前，初始培养通常需要大约3至4周的时间，黑色素细胞使用传统方法达到汇合，这很可能是由于它们的分离效率低。因此，增加成人皮肤组织最初生产的黑色素细胞对实验室研究和临床应用都很有帮助。

许多生长因子，其中多数已被证明由角蛋白细胞分泌（例如，+-MSH，ACTH，bFGF，NGF，ET-1，GM-CSF，HGF，LIF和SCF）5-8，调节哺乳动物黑色^5-8素细胞的分化和增殖。在没有喂食层的情况下，缺乏这些生长因子导致黑色素细胞的增殖减少，其凋亡增加^9。角蛋白细胞作为馈生细胞和黑色素细胞的共培养可导致黑色素细胞增殖加速和凋亡减少。然而，共培养方法不仅需要更多的皮肤组织来准备角蛋白细胞，这是不实际的，但也不有效工作，因为黑色素细胞所需的培养条件不偏向角蛋白细胞生长，反之亦然。

先前的研究已经报道，将Y-27632，一种 ROCK抑制剂，加入生长介质，可以提高人类原发性表皮细胞^{从皮肤组织10-14-的产量}。因此，测试人类原发性黑色素细胞的分离是否会受益于Y-27632的存在是很有趣的。事实上，Y-27632加入接种TIVA介质^15，其中含有TPA，IBMX，Na3VO4和₃dbcAMP，显著提高了₄原发性黑色素细胞在初始培养体¹⁶中从包皮组织分离的产量。与传统协议相比，这种新协议在提高黑色素细胞^{16的产量方面效率显著提高}。因此，本协议在此前的研究¹⁶的基础上，详细描述了使用成人皮肤组织的新方法，以促进其在基础和应用生物学研究中的应用。

研究方案

本协议中成人年金组织的使用已获人类研究伦理委员会（第2015120401号，日期:2015年5月12日）批准。

注:在无菌环境中执行以下所有程序，以防止细胞和培养物受到污染。

1. 准备工作

1. 在含有 10 mL 磷酸盐缓冲液 （PBS） 的 15 mL 管中收集包皮手术中的新鲜成人包皮组织，并储存在 4 °C 中。
   注:切除后24小时内将组织分离至下文详细操作。
2. 准备试剂和培养剂。
   1. 准备 3% P/S（青霉素/链霉素）作为洗涤溶液。将 50 mL 的 PBS 与 1.5 mL 的青霉素 （100 U/mL） 和链霉素 （100 mg/L） （P/S） 混合。
   2. 准备酶消化的终止溶液（中和溶液）。补充1%P/S，10%胎儿牛血清（FBS）到DMEM介质。
   3. 准备TIVA培养黑色素细胞:哈姆的F12;10% FBS;1x P=S=谷氨酰胺;50 纳克/mL 12-O-tetradecanoyl磷-13-醋酸盐（TPA）;1 x 10^-4 M 3-乙丁基-1-甲基苯丙胺 （IBMX）;1 μM Na₃VO₄;1 x 10^-3 M N-6，2°-O-dibutyryladenosine-3+，5°-循环单磷酸盐（dbcAMP）。

2. 传统方法

1. 皮肤组织预处理
   1. 用10 mL的75%乙醇（酒精）冲洗一次成人的年金组织一次，然后用10 mL的洗涤液（3%P/S）冲洗两次，每次冲洗5分钟。
      注:如果有很多血液，在开始时用 10 mL 的 PBS 清洗浴皮组织。所有洗涤都用100毫米细胞培养皿烹制。
   2. 用手术刀片刮除每个包皮组织，以去除100毫米细胞培养盘盖中皮下脂肪组织和松散的结缔组织。
      注:使用手术刀刮走脂肪层，直到只有薄表皮和密集的真皮保留。
   3. 将每个成人的表皮转移到另一个 100 mm 的培养皿中，皮毛侧向下。
      注:使用手术刀刀片将每个成人爱皮组织切成 3-4 mm 宽的条，使脱毛工作更高效。
   4. 将 2.5 mg/mL diss 添加到每个 100 mm 培养皿中，配以成人外皮组织，并在 4 °C 下孵育 16 至 20 小时。
      注:每克组织用10mL的解液消化。
2. 表皮与成人爱皮组织的分离
   1. 消化16至20小时后，使用钳子将表皮与真皮分离。用一个钳子抓住组织皮肤边缘的一侧，用另一个钳子抓住表皮部分的相应位置，轻轻剥下表皮。
   2. 用洗涤液（3% P/S）清洗表皮 3 倍，然后将表皮转移到管中。
   3. 将 5 mL 的 0.05% 三辛加入管中，在 37 °C 的水浴中孵育 30 分钟，使表皮淹没。
      注:摇动管子，确保表皮在孵化前完全浸入水中。
3. 原细胞的收集和培养
   1. 添加等量的端接溶液（10% FBS，1% P/S 在 DMEM 中），以中和 trypsin 并移液溶液上下 10-15 次，以分离表皮细胞。
   2. 通过 100 μm 网状过滤器将电池悬浮液插入新的 50 mL 管中，以清除碎屑。
   3. 在200 x g下离心5分钟。
   4. 去除上一提液，加入10 mL的接种TIVA介质，重新给细胞。
   5. 将重新暂停的细胞播种到100毫米培养皿中。
   6. 37°C 培养箱中的培养，具有 5% CO₂。
   7. 每 2 天更换一次介质。
   8. 当细胞达到80%的汇合时，通过细胞。

3. 新方法

注:新方法中组织制备和消化的过程与上述常规方法相同，唯一的区别是分离的新鲜细胞在含有10μM Y-27632的TIVA介质中重新产生。

1. 播种两天后，用不带 Y-27632 的正常 TIVA 介质替换介质。之后，新方法与传统方法之间的培养条件是相同的。

4. 细胞传通

1. 取出 TIVA 介质，然后用 PBS 冲洗每个培养皿两次。
2. 每100毫米细胞培养盘加入2 mL 0.05%的三辛。
   注:摇动盘子，确保消化酶和菜底之间充分接触。
3. 在37°C培养箱中消化2分钟。
4. 使用显微镜检查细胞，并确保大多数细胞与细胞培养皿分离。
   注:轻轻敲按盘子，释放细胞以四舍五入，并在溶液中浮动。延长消化时间，如果大多数细胞没有暂停后，攻丝，但不超过5分钟。
5. 通过添加2 mL的终止溶液，将黑色素细胞转移到15 mL管中后，加入2 mL的终止溶液，从而消除尝试素活性。在200 x g下离心5分钟。
6. 在慢慢去除上经剂后，用10 mL的TIVA培养基重新暂停每个细胞颗粒，然后计算黑色素细胞的数量。
7. 每100毫米细胞培养盘⁶10 mL的TIVA培养皿中约有1 x 10 6黑色素细胞。
8. 每 48 小时更新一次细胞培养培养。

结果

图 1显示了比较传统方法和新方法的示意图。新方法的组织制备和消化过程与传统方法的程序相同，唯一的区别是分离的细胞在10μM Y-27632存在的情况下在TIVA培养基10 mL中重新产生。播种两天后，用不带 Y-27632 的正常 TIVA 介质替换介质。将原发性黑色素细胞与皮肤组织分离的传统方法通常需要大约3至4周，黑色素细胞生长在足够数量通过，但更重要的是，组织通常来自新生儿?...

讨论

这里描述的协议是基于最近的出版物^16。应注意以下关键步骤，以便采用新方法获得最佳效果。首先，成功分离表皮和真皮至关重要。使用手术刀刀片将成人的外皮组织切成 3-4 mm 宽的条，使脱毛工作更彻底、更容易地将表皮与真皮分离。其次，在分离这两层时，应避免真皮污染，因为皮肤纤维细胞也可以生长在黑色素细胞培养基中。第三，三是消化步骤应小于30分钟;否则，它会...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA）	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation