Y-27632 Bereichert die Ausbeute menschlicher Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben

Zusammenfassung

Dieses Papier berichtet, dass die Zugabe von Y-27632 zu TIVA Medium kann die Ausbeute von Melanozyten aus erwachsenen Hautgewebe deutlich erhöhen.

Zusammenfassung

Die Isolierung und Kultur von primären Melanozyten aus Hautgeweben ist sehr wichtig für die biologische Forschung und wurde häufig für klinische Anwendungen verwendet. Die Isolierung von primären Melanozyten aus Hautgewebe nach der herkömmlichen Methode dauert in der Regel etwa 3 bis 4 Wochen, um ausreichend zu durchgehen. Noch wichtiger ist, dass die verwendeten Gewebe in der Regel neugeborene Vorhaut sind und es ist immer noch eine Herausforderung, primäre Melanozyten effizient aus erwachsenen Geweben zu isolieren. Wir haben vor kurzem eine neue Isolationsmethode für Melanozyten entwickelt, die Y-27632, einen Rho-Kinase-Inhibitor, zum ursprünglichen Kulturmedium für 48 h hinzufügt. Im Vergleich zum herkömmlichen Protokoll erhöht diese neue Methode dramatisch die Ausbeute von Melanozyten und verkürzt die Zeit, die erforderlich ist, um Melanozyten aus Vorhautgeweben zu isolieren. Wir beschreiben diese neue Methode nun ausführlicher mit Erwachsenenepidermis, um primäre Melanozyten effizient zu kulturieren. Wichtig ist, dass wir zeigen, dass Melanozyten aus erwachsenen Geweben, die mit dieser neuen Methode hergestellt werden, normal funktionieren können. Dieses neue Protokoll wird Studien zu Pigmentdefekten und Melanomen mit primären Melanozyten, die aus leicht zugänglichen erwachsenen Hautgeweben hergestellt werden, erheblich zugute kommen.

Einleitung

Ziel dieser Studie war es, ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung von Melanozyten aus der Epidermis der erwachsenen Haut für biologische Forschung und klinische Anwendungen zu entwickeln. Melanozyten, die sich in der Basalepidermis der Haut und in Haarfollikel befinden, spielen eine wichtige Rolle bei der Pigmentierung von Haut und Haaren durch die Produktion von Melanin¹. Die daraus resultierende Hautpigmentierung aus epidermalen Melanozyten wirkt als ultravioletter Strahlungsfilter, der DNA-Schäden an darunter liegenden Zellen in der Haut reduziert/verhindert². Die abnorme Proliferation von Melanozyten in der Haut ist durchaus üblich, wie bei der Bildung von gutartigen Nevi (Molen), bei denen Melanozyten potenziell zu onkogenem Wachstum transformieren können, gefolgt von zellulärer Seneszenz³.

Seit 1957 ist die Isolation und nachfolgende Kultur menschlicher Primärmelanozyten möglich⁴, aber erst seit 1982 gibt es eine effiziente Methode, die Reproduzierbar Kulturen menschlicher Melanozyten aus der Epidermis^etablierenkann 5 . Die herkömmliche Methode, primäre Melanozyten von der Epidermis zu isolieren, beinhaltet eine zweistufige enzymatische Verdauung. Kurz gesagt, die Haut wird zunächst mit Dispase verdaut, um die Epidermis von der Dermis zu trennen, danach wird die Epidermis mit Trypsin verdaut, um Suspensionen zu produzieren, die Melanozyten und Keratinozyten enthalten, die dann selektiv in verschiedenen Medien angebaut werden können. Derzeit dauert die Anfangskultur in der Regel etwa 3 bis 4 Wochen für Melanozyten, um die Konfluenz mit der herkömmlichen Methode zu erreichen, die wahrscheinlich auf die geringe Effizienz ihrer Isolierung zurückzuführen ist. Daher wäre die Erhöhung der erstmaligen Produktion von Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben sowohl für die Laborforschung als auch für klinische Anwendungen sehr hilfreich.

Viele Wachstumsfaktoren, von denen die meisten nachweislich durch Keratinozyten abgesondert werden (z.B. S-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF und SCF)^5-8, regulieren die Differenzierung und Proliferation von Säugetiermelanozyten. In Ermangelung von Feederschichten führt das Fehlen dieser Wachstumsfaktoren zu einer verminderten Proliferation von Melanozyten und ihrer erhöhten Apoptose⁹. Die Kokultur der Keratinozyten als Feederzellen und Melanozyten könnte zu einer beschleunigten Melanozytenproliferation und reduzierter Apoptose führen. Die Co-Kultur-Methode verlangt jedoch nicht nur mehr Hautgewebe, um Keratinozyten zuzubereiten, was nicht praktikabel ist, sondern konnte auch nicht effizient arbeiten, weil die von Melanozyten geforderten Kulturbedingungen das Keratinozytenwachstum nicht begünstigen und umgekehrt.

Frühere Studien haben berichtet, dass die Zugabe von Y-27632, einem ROCK-Hemmer, in das Wachstumsmedium die Ausbeute menschlicher primärer epidermaler Zellen aus Hautgewebe^n10-14verbessern kann. Daher wäre es interessant zu testen, ob die Isolierung menschlicher Primärmelanozyten von der Anwesenheit von Y-27632 profitieren würde. Tatsächlich erhöhte die Zugabe von Y-27632 in das Inokulations-TIVA-Medium¹⁵, das TPA, IBMX, Na₃VO₄ und dbcAMP enthält, die Ausbeute von primären Melanozyten, die aus Vorhautgeweben in den Ausgangskulturen isoliert sind, signifikant¹⁶. Im Vergleich zum herkömmlichen Protokoll ist dieses neue Protokoll deutlich effizienter bei der Erhöhung der Ausbeute an Melanozyten¹⁶. Daher beschreibt dieses Protokoll die neue Methode im Detail unter Verwendung von erwachsenen Hautgeweben auf der Grundlage einer früheren Studie^16, um ihre Anwendung in der Grundlagen- und angewandten biologischen Forschung zu fördern.

Protokoll

Die Verwendung von erwachsenen Vorhautgewebeinteilen in diesem Protokoll wurde von der Human Research Ethics Committee (Nr.2015120401, Datum: 12. Mai 2015) genehmigt.

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Verfahren in einer sterilen Umgebung durch, um Kontaminationen von Zellen und Kulturen zu verhindern.

1. Vorbereitungen

1. Sammeln Sie frisches vorhauthaltiges Gewebe aus Beschneidungsoperationen in 15 ml-Röhrchen, die 10 ml Phosphatpuffer-Saline (PBS) enthalten, und lagern Sie es in 4 °C.
   HINWEIS: Trennen Sie die Gewebe, wie unten beschrieben, innerhalb von 24 h nach ihrer Exzision.
2. Bereiten Sie Reagenzien und Kulturmedium.
   1. Bereiten Sie 3% P/S (Penicillin/Streptomycin) als Waschlösung vor. Mischen Sie 50 ml PBS mit 1,5 ml Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 mg/L) (P/S).
   2. Bereiten Sie die Terminlösung (Neutralisationslösung) zur Neutralisierung der enzymatischen Verdauung vor. Zuschlag 1% P/S, 10% fetales Rinderserum (FBS) in DMEM medium.
   3. Bereiten Sie TIVA Medium-zu-Kultur-Melanozyten vor: Ham s F12; 10% FBS; 1x P-S-Glutamin; 50 ng/mL 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA); 1 x 10^-4 M 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX); 1 M Na₃VO₄; 1 x 10^-3 M N-6,2-O-Dibutyryladenosin-3,5-zyklisches Monophosphat (dbcAMP).

2. Die konventionelle Methode

1. Hautgewebe-Vorbehandlung
   1. Spülen Sie jedes erwachsene Vorhautgewebe einmal mit 10 ml 75% Ethanol (Alkohol) für 30 s, und spülen Sie dann zweimal mit 10 ml Waschlösung (3% P/S), für jeweils 5 min.
      HINWEIS: Waschen Sie Vorhautgewebe mit 10 ml PBS am Anfang, wenn es viel Blut gibt. Alle Wässer werden in 100 mm Zellkulturschalen zubereitet.
   2. Zerkleinern Sie jedes Vorhautgewebe mit einer chirurgischen Klinge, um subkutane Fettgewebe und lose Bindegewebe in der Abdeckung einer 100 mm Zellkulturschale zu entfernen.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein Skalpell, um die Fettschichten wegzukratzen, bis nur die dünne Epidermis und die dichte Dermis übrig bleiben.
   3. Übertragen Sie jede erwachsene Vorhaut in eine weitere 100 mm Kulturschale mit der Dermisseite nach unten.
      HINWEIS: Schneiden Sie jedes erwachsene Vorhautgewebe in 3-4 mm breite Streifen mit einer Skalpellklinge, damit die Dispase effizienter funktioniert.
   4. Fügen Sie 2,5 mg/ml Dispase zu jeder 100 mm Kulturschale mit erwachsenen Vorhautgewebe und inkubieren für 16 bis 20 h bei 4 °C.
      HINWEIS: Jedes Gramm Gewebe wird mit 10 ml Dispase-Lösung verdaut.
2. Trennung der Epidermis vom erwachsenen Vorhautgewebe
   1. Nach der Verdauung für 16 bis 20 h, trennen Sie die Epidermis von der Dermis mit einer Pinzette. Schnappen Sie sich eine Seite der dermalen Kante des Gewebes mit einer Pinzette und die entsprechende Position des epidermalen Teils mit einer anderen Pinzette und schälen Sie die Epidermis sanft ab.
   2. Die Epidermis 3x mit Waschlösung (3% P/S) waschen und dann in ein Rohr geben.
   3. Untertauchen Sie die Epidermis, indem Sie 5 ml 0,05% Trypsin in die Röhre geben und in einem Wasserbad 30 min bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Schütteln Sie das Rohr, um sicherzustellen, dass die Epidermis vor der Inkubation vollständig untergetaucht ist.
3. Sammlung und Kultur von Primärzellen
   1. Fügen Sie ein gleiches Volumen der Terminlösung (10% FBS, 1% P/S in DMEM) hinzu, um das Trypsin und die Pipette 10-15 Mal nach oben und unten zu neutralisieren, um die epidermalen Zellen zu trennen.
   2. Übergeben Sie die Zellsuspension in ein neues 50 ml-Rohr durch einen 100-m-Netzfilter, um Schmutz zu entfernen.
   3. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.
   4. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml Impf-TIVA-Medium hinzu, um die Zellen wieder auszusetzen.
   5. Säen Sie die resuspendierten Zellen in eine 100 mm Kulturschale.
   6. Kultur in einem 37° C Inkubator mit 5%_CO2.
   7. Ändern Sie das Medium alle 2 Tage.
   8. Durchgangszellen, wenn sie 80% Zusammenfluss erreichen.

3. Die neue Methode

ANMERKUNG: Das Verfahren zur Gewebeaufbereitung und -verdauung in der neuen Methode ist das gleiche wie oben für die herkömmliche Methode beschrieben, wobei der einzige Unterschied darin besteht, dass die isolierten frischen Zellen in 10 ml TIVA-Medium resuspendiert werden, das 10 m Y-27632 enthält.

1. Ersetzen Sie das Medium zwei Tage nach dem Aussaat durch ein normales TIVA-Medium ohne Y-27632. Danach sind die Kulturbedingungen zwischen den neuen und den konventionellen Methoden gleich.

4. Zellpassaging

1. Entfernen Sie das TIVA-Medium und spülen Sie jedes Kulturgericht zweimal mit PBS.
2. Fügen Sie 2 ml 0,05% Trypsin pro 100 mm Zellkulturschale hinzu.
   HINWEIS: Schütteln Sie die Schale, um einen ausreichenden Kontakt zwischen Verdauungsenzymen und dem Boden der Schale zu gewährleisten.
3. In einem 37 °C-Inkubator für 2 min verdauen.
4. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Zellen zu überprüfen, und stellen Sie sicher, dass sich die meisten Zellen von der Zellkulturschale getrennt haben.
   HINWEIS: Tippen Sie vorsichtig auf die Schale, um die Zellen freizugeben, um sich aufzurunden und in der Lösung zu schweben. Verlängern Sie die Verdauungszeit, wenn die meisten Zellen nach dem Tippen nicht aussetzen, aber nicht mehr als 5 min.
5. Übertragen Sie die Melanozyten in ein 15 ml Rohr nach der Neutralisierung der Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 2 ml Terminlösung. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.
6. Setzen Sie jedes Zellpellet mit 10 ml TIVA Medium nach dem langsamen Entfernen des Überstandes aus, und zählen Sie dann die Anzahl der Melanozyten.
7. Platte ca. 1 x 10⁶ Melanozyten in 10 ml TIVA medium pro 100 mm Zellkulturschale.
8. Erneuern Sie das Zellkulturmedium alle 48 h.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt ein schematisches Diagramm, in dem die herkömmlichen und die neuen Methoden verglichen werden. Das Verfahren zur Gewebeaufbereitung und -verdauung mit der neuen Methode ist das gleiche wie das Verfahren für die herkömmliche Methode, wobei der einzige Unterschied darin besteht, dass die isolierten Zellen in 10 ml TIVA-Medium in Gegenwart von 10 M Y-27632 resuspendiert werden. Ersetzen Sie das Medium zwei Tage nach dem Aussaat durch ein normales TIVA-Medium ohne Y-27632. D...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll basiert auf einer kürzlich^{veröffentlichten 16}. Den folgenden kritischen Schritten sollte einige Aufmerksamkeit geschenkt werden, um mit der neuen Methode die besten Ergebnisse zu erzielen. Erstens ist eine erfolgreiche Trennung der Epidermis und der Dermis entscheidend. Schneiden Sie das erwachsene Vorhautgewebe mit einer Skalpellklinge in 3-4 mm breite Streifen, damit die Dispase gründlicher und einfacher wirken, um die Epidermis von der Dermis zu trennen. Zweit...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA)	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation