Y-27632 обогащает урожайность меланоцитов человека из тканей кожи взрослого человека

Резюме

В этой статье сообщается, что добавление Y-27632 к среде TIVA может значительно увеличить урожайность меланоцитов из тканей взрослой кожи.

Аннотация

Изоляция и культура первичных меланоцитов из тканей кожи очень важна для биологических исследований и широко используется для клинического применения. Изоляция первичных меланоцитов из тканей кожи обычным методом обычно занимает от 3 до 4 недель, чтобы пройти достаточно. Что еще более важно, ткани, используемые, как правило, новорожденных крайней плоти, и это все еще вызов, чтобы эффективно изолировать первичные меланоциты из взрослых тканей. Недавно мы разработали новый метод изоляции меланоцитов, который добавляет Y-27632, ингибитор орокиназы, к исходной среде культуры на 48 ч. По сравнению с обычным протоколом, этот новый метод резко увеличивает урожайность меланоцитов и сокращает время, необходимое для изоляции меланоцитов из тканей форечкина. Теперь мы подробно описываем этот новый метод с использованием эпидермиса для эффективной культуры первичных меланоцитов. Важно отметить, что мы показываем, что меланоциты, полученные из взрослых тканей, приготовленные этим новым методом, могут нормально функционировать. Этот новый протокол будет значительно пользу исследования дефектов пигментации и меланомы с использованием первичных меланоцитов, подготовленных из легко доступны взрослых тканей кожи.

Введение

Целью данного исследования была разработка простого и эффективного протокола по изоляции меланоцитов от эпидермиса взрослой кожи для биологических исследований и клинических применений. Меланоциты, которые расположены в базальном эпидермисе кожи и волосяных фолликулов, играют важную роль в пигментации кожи и волос, производя меланин^1. В результате пигментации кожи от эпидермальных меланоцитов действует как ультрафиолетовый фильтр излучения, который уменьшает / предотвращает повреждение ДНК для основных клеток в коже². Аномальное распространение меланоцитов в коже довольно часто, например, при формировании доброкачественных неви (кротов), в которых меланоциты потенциально трансформируются в онкогенный рост с последующим клеточным сенесценцией³.

С 1957 года изоляция и последующая культура первичных меланоцитов человека была возможна⁴, но только с 1982 года существует эффективный метод, который может воспроизводить культуры человеческих меланоцитов из эпидермиса⁵. Обычный метод изоляции первичных меланоцитов от эпидермиса включает в себя двухступенчатое ферментативное пищеварение. Короче говоря, кожа первоначально усваивается с диспазом, чтобы отделить эпидермис от дермы, после чего эпидермис усваивается с трипсином для производства суспензий, содержащих меланоциты и кератиноциты, которые затем могут быть выборочно выращены в различных средствах массовой информации. В настоящее время начальная культура обычно занимает от 3 до 4 недель для меланоцитов для достижения слияния с использованием обычного метода, который, вероятно, из-за низкой эффективности их изоляции. Таким образом, увеличение первоначального производства меланоцитов из тканей взрослой кожи было бы весьма полезным как для лабораторных исследований и клинических применений.

Многие факторы роста, большинство из которых, как было показано, выделяются кератиноцитами (например, З-МЗ, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF и SCF)^5-8, регулируют дифференциацию и распространение мелких меланоцитов млекопитающих. При отсутствии фидерных слоев, отсутствие этих факторов роста приводит к снижению пролиферации меланоцитов и их повышенного апоптоза^9. Сокультура кератиноцитов в качестве фидерных клеток и меланоцитов может привести к ускорению пролиферации меланоцитов и снижению апоптоза. Тем не менее, метод совместной культуры не только требует больше тканей кожи для подготовки кератиноцитов, что не практично, но и не может работать эффективно, потому что культурные условия, требуемые меланоцитов не способствует росту кератиноцитов, и наоборот.

Предыдущие исследования сообщали, что добавление Y-27632, ингибитора ROCK, в среду роста может повысить выход первичных эпидермальных клеток человека из тканей кожи^10-14. Поэтому было бы интересно проверить, выиграет ли изоляция первичных меланоцитов человека от присутствия Y-27632. Действительно, добавление Y-27632 в прививку TIVA среды¹⁵, которая содержит TPA, IBMX, Na₃VO₄ и dbcAMP, значительно увеличил урожайность первичных меланоцитов, изолированных от тканей предпышной кожи в начальных культурах¹⁶. По сравнению с обычным протоколом, этот новый протокол значительно более эффективен в увеличении урожайности меланоцитов^16. Таким образом, этот протокол описывает новый метод подробно с использованием тканей кожи взрослых на основе предыдущего исследования¹⁶ в целях содействия его применению в основных и прикладных биологических исследований.

протокол

Использование тканей взрослой плоти в этом протоколе было одобрено Комитетом по этике человека (No.2015120401, дата: 12 мая 2015 г.).

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие процедуры в стерильной среде для предотвращения загрязнения клеток и культур.

1. Подготовка

1. Соберите свежие ткани плоти взрослого человека из операций обрезания в 15 мЛ труб, содержащих 10 мл фосфатного буферного солевого раствора (PBS) и храните в 4 кк.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отделите ткани, как подробно ниже в течение 24 ч после их иссечения.
2. Подготовка реагентов и культуры среды.
   1. Подготовка 3% P / S (пенициллин / стрептомицин) в качестве стирального раствора. Смешайте 50 мЛ PBS с 1,5 мл пенициллина (100 U/mL) и стрептомицином (100 мг/л) (P/S).
   2. Подготовьте решение о прекращении (решение для нейтрализации) для нейтрализации ферментативного пищеварения. Дополнение 1% P/S, 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в DMEM-среду.
   3. Подготовка TIVA средних культур меланоцитов: ветчина F12; 10% FBS; 1x П'С'глутамин; 50 нг/мЛ 12-О-тетрадеканилфор-13-ацетат (ТПА); 1 х 10^-4 M 3-изобутил-1-метил ксантин (IBMX); 1 МКМ Na₃VO₄; 1 х 10^-3 М N-6,2"-О-дибутиладенозин-3", 5-циклический монофосфат (dbcAMP).

2. Обычный метод

1. Предлечение тканей кожи
   1. Промыть каждый взрослый крайней ткани крайней плоти один раз с 10 мл 75% этанола (алкоголь) в течение 30 с, а затем промыть дважды с 10 мЛ стирального раствора (3% P/ S), в течение 5 мин каждый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вымойте ткани плоти с 10 мл PBS в начале, если есть много крови. Все моет готовятся в 100 мм клеточной культуры блюда.
   2. Очистите каждую хинтическую ткань хирургическим лезвием для удаления подкожных жировых тканей и рыхлых соединительной ткани на крышке 100-мм клеточной культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте скальпель, чтобы очистить жировые слои прочь, пока только тонкий эпидермис и плотная дерма остаются.
   3. Перенесите каждую взрослую форескину в другое блюдо культуры 100 мм с дермой вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте каждую взрослую ткань плоти на 3-4 мм широкими полосками с помощью лезвия скальпеля, чтобы сделать диспасе работать более эффективно.
   4. Добавьте 2,5 мг/мл диспазу к каждому блюду культуры 100 мм со взрослыми тканями крайней плоти и инкубировать в течение 16-20 ч при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый грамм ткани усваивается 10 мл раствора диспаспе.
2. Отделение эпидермиса от ткани взрослой плоти
   1. После пищеварения на 16 до 20 ч, отделить эпидермис от дермы с помощью пинцета. Возьмите одну сторону дермального края ткани одним пинцетом и соответствующим положением эпидермальной части другим пинцетом и аккуратно снимите эпидермис.
   2. Вымойте эпидермис 3x с стиральным раствором (3% P/S), а затем перенесите эпидермис в трубку.
   3. Погрузите эпидермис, добавив 5 мл 0,05% трипсина в трубку и инкубировать в водяной бане в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните трубку, чтобы убедиться, что эпидермис полностью погружен до инкубации.
3. Сбор и культура первичных клеток
   1. Добавить равный объем решения прекращения (10% FBS, 1% P / S в DMEM), чтобы нейтрализовать трипсина и пипетки раствор вверх и вниз 10-15 раз, чтобы отделить эпидермальные клетки.
   2. Передайте суспензию ячейки в новую трубку 50 мл через фильтр сетки 100 мкм для удаления мусора.
   3. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
   4. Удалить супернатант и добавить 10 мл прививки TIVA среды для повторного регулирования клеток.
   5. Семя резвиированных клеток в 100 мм культуры блюдо.
   6. Культура в инкубаторе с 5% CO_2.
   7. Меняйте среду каждые 2 дня.
   8. Проход клетки, когда они достигают 80% слияния.

3. Новый метод

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура подготовки тканей и пищеварения в новом методе такая же, как описано выше для обычного метода, с той лишь разницей, что изолированные свежие клетки резуспенились в 10 мл среды TIVA, содержащей 10 М Y-27632.

1. Через два дня после посева замените носитель обычным средством TIVA без Y-27632. После этого культурные условия одинаковы между новыми и традиционными методами.

4. Прохождение клеток

1. Удалите среднюю TIVA и промойте каждое блюдо культуры дважды с PBS.
2. Добавьте 2 мл 0,05% трипсина на блюдо культуры клеток на 100 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните блюдо, чтобы обеспечить адекватный контакт между пищеварительными ферментами и нижней частью блюда.
3. Дайджест в инкубаторе 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
4. Используйте микроскоп, чтобы проверить клетки, и убедитесь, что большинство клеток отмежевались от клеточной культуры блюдо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно коснитесь блюда, чтобы освободить клетки, чтобы округлить и плавать в растворе. Продлить время пищеварения, если большинство клеток не приостанавливают после постукивания, но не более 5 мин.
5. Перенесите меланоциты в трубку 15 мЛ после нейтрализации активности трипсина, добавив 2 мЛ раствора прекращения. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
6. Resuspend каждой клетки гранулы с 10 мЛ TIVA среды после медленно удаления супернатанта, а затем подсчитать количество меланоцитов.
7. Плита около 1 х 10⁶ меланоцитов в 10 мл TIVA среднего на 100 мм клеточной культуры блюдо.
8. Обновить среду клеточной культуры каждые 48 ч.

Результаты

На рисунке 1 показана схематическая диаграмма, сравнивающая обычные и новые методы. Процедура подготовки тканей и пищеварения с помощью нового метода такая же, как и процедура обычного метода, с той лишь разницей, что изолированные клетки резуснулись в 10 мл среды TIVA в пр?...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, был основан на недавней публикации¹⁶. Особое внимание следует уделить следующим важнейшим шагам для достижения наилучших результатов с помощью нового метода. Во-первых, успешное разделение эпидермиса и дермы имеет решающее значение. Разрежьте тк...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA）	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation