Y-27632 成人皮膚組織からのヒトメラノサイトの収穫量を豊かにする

要約

本論文は、TIVA培地にY-27632を添加することで、成人の皮膚組織からのメラノサイトの収率を有意に増加させることができると報告している。

要約

皮膚組織からの原発メラノサイトの分離と培養は、生物学的研究にとって非常に重要であり、臨床応用に広く使用されている。従来の方法で皮膚組織から一次メラノサイトを単離することは、通常、十分に通過するのに約3〜4週間かかる。さらに重要なことは、使用される組織は通常新生児の前皮であり、成人組織から原発性メラノサイトを効率的に分離することは依然として課題である。我々は最近、Rhoキナーゼ阻害剤であるY-27632を初期培養培地に48時間添加するメラノサイトの新しい分離法を開発した。我々は、この新しい方法を、一次メラノサイトを効率的に培養するために成体表皮を用いてより詳細に記述する。重要なことは、この新しい方法で調製された成体組織から得られたメラノサイトが正常に機能できることを示す。この新しいプロトコルは、容易にアクセスできる成人皮膚組織から調製された原発性メラノサイトを用いた色素沈着欠陥および黒色腫の研究に大きな利益をもたらす。

概要

本研究の目的は、生物学的研究および臨床応用のために、成人皮膚の表皮からメラノサイトを分離するためのシンプルで効果的なプロトコルを開発することであった。皮膚の基底表皮や毛包に位置するメラノサイトは、メラニン¹を産生することによって皮膚および毛髪の色素沈着に重要な役割を果たす。表皮メラノサイトから得られた皮膚色素沈着は、皮膚²の下層細胞へのDNA損傷を減少/予防する紫外線照射フィルターとして作用する。皮膚におけるメラノサイトの異常増殖は、良性ネビ(ほくろ)の形成など、メラノサイトが発癌性増殖に変わる可能性があり、その後に細胞老化^が続くなど、非常に一般的である。

1957年以来、ヒト原発メラノサイトの分離とその後の培養は⁴つ可能であったが、1982年以来、表皮⁵からヒトメラノサイトの培養を再現的に確立できる効率的な方法があった。表皮から一次メラノサイトを分離する従来の方法は、2段階の酵素消化を伴う。簡単に言えば、皮膚は最初に表皮を真皮から分離するためにディスパスで消化され、その後表皮をトリプシンで消化してメラノサイトおよびケラチノサイトを含む懸濁液を産生し、異なる培地で選択的に成長させることができる。現在、初期培養は通常、メラノサイトが従来の方法を用いて合流に達するまでに約3〜4週間かかり、これはそれらの単離の効率が低いためである可能性が高い。したがって、成人の皮膚組織からのメラノサイトの初期産生を増加させることは、実験室での研究と臨床応用の両方に非常に有用であろう。

多くの成長因子は、その大部分が角化細胞(例えば、α-MSH、ACTH、bFGF、NGF、ET-1、GM-CSF、HGF、LIFおよびSCF)によって分泌されることが示されている^55-8、8哺乳類メラノサイトの分化および増殖を調節する。フィーダー層がない場合、これらの成長因子の欠如は、メラノサイトの増殖の減少およびそれらの増加したアポトーシス⁹につながる。ケラチノサイトをフィーダー細胞とメラノサイトとの共培養は、メラノサイトの増殖を加速し、アポトーシスを減少させる可能性がある。しかし、この共培養法は、より多くの皮膚組織を必要とし、ケラチノサイトを調製する必要があるが、これは実用的ではないが、メラノサイトに必要な培養条件がケラチノサイトの成長を好まないため、効率的に働くことができなかった。

これまでの研究では、ROCK阻害剤であるY-27632を成長培地に添加することで、皮膚組織^10~14-14からヒト初代表皮細胞の収率を高めることができることが報告されている。したがって、ヒトの原発メラノサイトの単離がY-27632の存在から恩恵を受けるかどうかをテストすることは興味深いであろう。実際に、TpA、IBMX、Na3_VO4およびdbcAMPを含む接種TIVA培地¹⁵にY-27632を添加すると、初期培養₃¹⁶において包皮組織から分離された一次メラノサイトの収率が有意に増加した。従来のプロトコルと比較して、この新しいプロトコルはメラノサイト¹⁶の収率を上げる上でかなり効率的である。したがって、このプロトコルは、基礎的および応用生物学的研究におけるその応用を促進するために、以前の研究¹⁶に基づいて成人皮膚組織を用いて新しい方法を詳細に記述する。

プロトコル

この議定書における成人包皮組織の使用は、人間研究倫理委員会(No.2015120401、日付:2015年5月12日)によって承認されています。

注:細胞や培養物の汚染を防ぐために、滅菌環境で次の手順をすべて実行します。

1. 準備

1. 10 mLのリン酸緩衝塩水(PBS)を含む15mLチューブで割礼手術から新鮮な成人包皮組織を収集し、4°Cで保存します。
   注:切除後24時間以内に、以下の詳細に従って組織を分離してください。
2. 試薬および培養培地を準備する。
   1. 洗浄液として3%P/S(ペニシリン/ストレプトマイシン)を調製します。PBS 50 mL をペニシリン 1.5 mL (100 U/mL) とストレプトマイシン (100 mg/L) (P/S) と混合します。
   2. 酵素消化の中和のための終了溶液(中和溶液)を準備します。1%P/S、10%ウシ胎児血清(FBS)をDMEM培地に補充する。
   3. メラノサイトを培養する TIVA 培地を準備します。10%FBS;1x P⁄S⁄グルタミン;50 ng/mL 12-O-テトラポアノイルホルボル-13-アセテート(TPA);1 x 10^-4 M 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX);1 μM Na₃VO₄;1 x 10^-3 M N-6,2′-ジブチリラデオシン-3′,5′環状一リン酸(dbcAMP)。

2. 従来の方法

1. 皮膚組織前処理
   1. 各成体の包皮組織を1回、10mLの75%エタノール(アルコール)を30分間リンスし、10mLの洗浄液(3%P/S)で2回洗い流し、それぞれ5分間洗い流します。
      注:血液量が多い場合は、最初に10 mLのPBSで包皮組織を洗浄してください。すべての洗い物は100のmm細胞培養皿で準備される。
   2. 100 mm細胞培養皿のカバーで皮下脂肪組織と緩い結合組織を除去するために外科用ブレードで各包皮組織を掻き取ります。
      注:薄い表皮と密真皮が残るまで、脂肪層を削り取るためにメスを使用してください。
   3. 真皮側を下にして、大人の包皮を別の100mmの培養皿に移します。
      注:各大人の包皮組織をメスの刃を使用して3〜4mm幅のストリップに切り、ディスパーゼをより効率的に動作させます。
   4. 大人の包皮組織を含む各100mm培養皿に2.5mg/mLのディスパーゼを加え、4°Cで16〜20時間インキュベートします。
      注:組織の各グラムは、10 mLのディスパゼ溶液で消化されます。
2. 成人包皮組織からの表皮の分離
   1. 16〜20時間消化した後、ピンセットを使用して真皮から表皮を分離する。1つのツイーザーと別のトゥイザーと表皮部分の対応する位置で組織の真皮端の片側をつかみ、表皮を穏やかに剥がします。
   2. 表皮3xを洗浄液(3%P/S)で洗浄し、表皮をチューブに移します。
   3. 5 mLの0.05%トリプシンをチューブに加えて表皮を水に沈め、37°Cで30分間水浴中にインキュベートします。
      注:チューブを振って、インキュベーションの前に表皮が完全に水没していることを確認します。
3. プライマリセルの収集と培養
   1. 等量の終端溶液(10%FBS、DMEMで1%P/S)を加えて、トリプシンを中和し、溶液を上下に10〜15回ピペットして表皮細胞を分離します。
   2. 100 μm メッシュフィルターを通して新しい 50 mL チューブにセル懸濁液を入れ、残骸を除去します。
   3. 200 x gで 5 分間遠心分離機。
   4. 上清を取り除き、10 mLの接種TIVA培地を加えて細胞を再懸濁します。
   5. 再懸濁した細胞を100mm培養皿に播種します。
   6. 5%CO2を有する37°Cインキュベーター₂での培養.
   7. 2日ごとにメディアを変更します。
   8. 彼らは80%合流に達するとパッセージ細胞。

3. 新しい方法

注:新しい方法での組織の調製および消化の手順は、従来の方法について上記と同じであり、唯一の違いは、単離された新鮮な細胞が10μM Y-27632を含むTIVA培地の10 mLに再懸濁されることである。

1. シード処理の2日後、Y-27632を使用せずに通常のTIVA培地に交換してください。その後、培養条件は、新しい方法と従来の方法との間で同じである。

4. 細胞の通過

1. TIVA培地を取り出し、各培養皿をPBSで2回洗いすます。
2. 100mm細胞培養皿あたり0.05%トリプシンを2 mL加えます。
   注:消化酵素と皿の底部との間に適切な接触を確保するために皿を振ります。
3. 37°Cインキュベーターで2分間消化します。
4. 顕微鏡を使用して細胞を確認し、ほとんどの細胞が細胞培養皿から解離していることを確認します。
   注:皿を軽くタップしてセルを放出し、溶液中で切り上げて浮かべます。ほとんどの細胞がタップ後に中断しなかった場合、消化時間を延長しますが、5分以下です。
5. 2 mLの終了溶液を加えてトリプシン活性を中和した後、メラノサイトを15 mLチューブに移します。200 x gで 5 分間遠心分離機。
6. 上清をゆっくり除去した後、TIVA培地の10mLで各細胞ペレットを再懸濁し、メラノサイトの数をカウントする。
7. 100mm細胞培養⁶皿あたり10mLのTIVA培地で約1x106メラノサイトをプレートする。
8. 細胞培養培地を48時間ごとに更新する。

結果

図1は、従来法と新しい方法を比較したスケマティックダイアグラムを示す。新しい方法による組織の調製および消化の手順は、従来法の手順と同じであり、唯一の違いは、単離された細胞が10μM Y-27632の存在下でTIVA培地の10mLで再懸濁されることである。シード処理の2日後、Y-27632を使用せずに通常のTIVA培地に交換してください。皮膚組織から原発性メラノサイトを単離...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、最近の出版物¹⁶に基づいていました。新しい方法で最良の結果を得るためには、次の重要な手順に注意を払う必要があります。まず、表皮と真皮の分離が成功することが重要です。メスの刃を使用して大人の包皮組織を3〜4mm幅のストリップに切り、ディスパーゼをより徹底的かつ簡単に作業させ、表皮を真皮から分離します。第二に、これら2...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA）	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation