Y-27632 성인 피부 조직에서 인간 멜라닌 세포의 수율을 강화

요약

이 논문은 TIVA 배지에 Y-27632를 첨가하면 성인 피부 조직에서 멜라닌세포의 수율을 크게 증가시킬 수 있다고 보고합니다.

초록

피부 조직에서 1 차적인 멜라닌세포의 격리 그리고 문화는 생물학 연구를 위해 아주 중요하고 임상 응용을 위해 널리 이용되고 있습니다. 종래의 방법에 의한 피부 조직으로부터 1차 멜라닌세포를 분리하는 데는 보통 충분히 통과하기까지 약 3~4주가 소요된다. 더 중요한 것은, 사용된 조직은 일반적으로 신생아 포킨스이고 성인 조직에서 1 차적인 melanocytes를 효율적으로 격리하는 도전입니다. 최근에는 Rho 키나아제 억제제인 Y-27632를 초기 배양 배지에 48h.를 추가하는 멜라닌세포에 대한 새로운 절연 방법을 개발했습니다. 우리는 지금 1 차적인 melanocytes를 능통하게 배양하기 위하여 성인 표피를 사용하여 더 자세히 이 새로운 방법을 기술합니다. 중요한 것은, 우리는 이 새로운 방법에 의해 제조된 성인 조직에서 얻은 멜라닌세포가 정상적으로 작동할 수 있다는 것을 보여줍니다. 이 새로운 프로토콜은 쉽게 접근 성인 피부 조직에서 제조된 1 차적인 흑색종을 사용하여 색소 침착 결함 및 흑색종의 연구 결과를 현저하게 유익할 것입니다.

서문

이 연구의 목표는 생물학적 연구 및 임상 응용을 위해 성인 피부표에서 멜라닌신을 분리하는 간단하고 효과적인 프로토콜을 개발하는 것이었습니다. 피부의 기저 표피와 모낭에 위치한 멜라닌 세포는 멜라닌^1을생성하여 피부와 모발의 색소 침착에 중요한 역할을 한다. 표피 멜라닌세포로부터의 피부 색소 침착은 피부^2의근본적인 세포에 DNA 손상을 줄여 방지하는 자외선 필터역할을 한다. 피부에 있는 멜라닌세포의 비정상적인 증식은 멜라닌세포가 잠재적으로 세포 노화^3에선행된 종양발생 성장으로 잠재적으로 변환되는 양성 네비(moles)의 형성과 같이 아주 일반적이다.

1957년 이래, 인간 1차 멜라닌세포의 고립및 후속 배양은^4가가능했지만, 1982년부터만 표피^5로부터인간의 멜라닌세포의 배양을 재현가능하게 확립할 수 있는 효율적인 방법이 있었다. 표피로부터 1차 멜라닌세포를 분리하는 종래의 방법은 2단계 효소 소화를 포함한다. 간단히 말해서, 피부는 처음에 진피에서 표피를 분리하기 위해 디스파스로 소화되며, 그 후 표피는 트립신으로 소화되어 멜라노세포와 각질 세포가 함유된 현탁액을 생성하며, 이는 다른 미디어에서 선택적으로 재배될 수 있다. 현재, 초기 배양은 일반적으로 멜라닌세포가 기존의 방법을 사용하여 합류에 도달하는 데 약 3~4주가 걸리며, 이는 그들의 격리효율이 낮기 때문일 가능성이 높다. 따라서 성인 피부 조직에서 멜라닌 세포의 초기 생산을 증가 실험실 연구 및 임상 응용 모두에 대 한 매우 도움이 될 것 이다.

많은 성장 인자, 대부분은 각질 세포에 의해 분비되는 것으로 나타났다 (예를 들어, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF 및 SCF)^5-8,포유류 멜라노사이클의 분화 및 확산을 조절. 피더 층이 없는 경우, 이러한 성장 인자의 부족은 멜라닌세포의 증식 감소와 세포멸 감소^9로이어집니다. 피더 세포와 멜라닌세포로 각질 세포의 공동 배양은 멜라닌세포 증식을 가속화하고 세포멸을 감소시킬 수 있다. 그러나, 공동 배양 방법은 실용적이지 않은 각질 세포를 준비하기 위해 더 많은 피부 조직을 요구할 뿐만 아니라 멜라노세포에 요구되는 배양 조건이 각질 세포 성장을 선호하지 않기 때문에 효율적으로 작동할 수 없으며, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.

이전 연구는 Y-27632의 추가, ROCK 억제제, 성장 배지에 피부 조직에서 인간의 일차 표피 세포의 수율을 향상시킬 수 있다고 보고^10-14. 따라서, 인간 1 차적인 멜라닌세포의 격리가 Y-27632의 존재에서 유익할 지 여부를 시험하는 것이 흥미로할 것입니다. 실제로, Y-27632를 접종 TIVA^{배지(15)에}첨가하여 TPA, IBMX, Na₃VO₄ 및 dbcAMP를 함유하고 있으며, 초기 배양에서 포피 조직으로부터 분리된 1차 멜라닌세포의 수율을 크게^{증가시켰다(16).} 종래의 프로토콜에 비해, 이 새로운 프로토콜은^{멜라닌세포(16)의}수율을 높이는 데 훨씬 더 효율적입니다. 따라서, 본 프로토콜은 기초및 적용된 생물학적 연구에서 적용을 촉진하기 위해 이전 연구^16을 기반으로 성인 피부 조직을 사용하여 새로운 방법을 자세히 설명합니다.

프로토콜

이 프로토콜에서 성인 포피 티슈의 사용은 인간 연구 윤리위원회 (No.2015120401, 날짜 : 2015년 5월 12일)에 의해 승인되었습니다.

참고: 세포와 배양물의 오염을 방지하기 위해 멸균 환경에서 다음 모든 절차를 수행합니다.

1. 준비

1. 10mL의 인산염 완충식염(PBS)을 포함하는 15mL 튜브에서 할례 수술로부터 신선한 성인 포피피 조직을 수집하고 4°C에 보관하십시오.
   참고: 절제 후 24시간 이내에 자세히 설명된 대로 조직을 분리합니다.
2. 시약 및 배양 매체를 준비합니다.
   1. 3% P/S(페니실린/연쇄절제술)를 세척 용액으로 준비합니다. 페니실린 (100 U/mL) 및 연쇄 상 미신 (100 mg/L) (P/S)의 1.5 mL와 PBS의 50 mL을 혼합.
   2. 효소 소화의 중화를 위해 종단 용액(중화 용액)을 준비합니다. DMEM 배지에 1% P/S, 10% 태아 소 혈청(FBS)을 보충합니다.
   3. 배양 멜라닌세포에 TIVA 배지 준비: 햄의 F12; 10% FBS; 1x P⁄S⁄글루타민; 50 ng/mL 12-O-테트레이드카노일 코르볼-13-아세테이트(TPA); 1 x 10^-4 M 3-이소부틸-1-메틸 자칸틴 (IBMX); 1 μM Na₃VO_4; 1 x 10^-3 M N-6,2′-O-dibutyryladenosine-3′,5′-순환 단인산염 (dbcAMP).

2. 종래의 방법

1. 피부 조직 전처리
   1. 각 성인 포피부 조직을 30초 동안 75%의 에탄올(알코올)으로 10mL로 한 번 헹구고, 10mL의 세탁용액(3%P/S)으로 두 번 헹구고, 각각 5분간 헹구는다.
      참고 : 혈액이 많은 경우 처음에 PBS의 10 mL로 포피 조직을 씻어. 모든 세정은 100mm 세포 배양 접시에 제조됩니다.
   2. 100mm 세포 배양 접시의 표지에 피하 지방 조직과 느슨한 결합 조직을 제거하기 위해 수술 블레이드로 각 포피 킨 조직을 긁어.
      참고: 얇은 표피와 조밀한 진피만 남을 때까지 메스를 사용하여 지방 층을 긁어냅니다.
   3. 각 성인 포피를 진피 쪽으로 100mm 배양 접시에 옮길 수 있습니다.
      참고: 각 성인 포피부 조직을 메스 블레이드를 사용하여 3-4mm 너비의 스트립으로 잘라 내어 디스파가 보다 효율적으로 작동하도록 합니다.
   4. 성인 포피 티슈와 함께 각 100mm 배양 접시에 2.5 mg/mL 디스파를 넣고 4°C에서 16~20시간 동안 배양합니다.
      참고: 각 티슈 그램은 10mL의 디스파제 용액으로 소화됩니다.
2. 성인 포피 티슈로부터 표피의 분리
   1. 16~20시간 동안 소화후 핀셋을 사용하여 진피로부터 표피를 분리한다. 하나의 트위저와 다른 트위저와 표피 부분의 해당 위치와 조직의 진피 가장자리의 한쪽을 잡고 부드럽게 표피를 벗겨.
   2. 표피를 세척 용액(3% P/S)으로 3배 세척한 다음 표피를 튜브로 옮겨 넣습니다.
   3. 튜브에 0.05% 트립신의 5mL을 추가하여 표피를 잠수하고 37 °C에서 30 분 동안 수조에 배양하십시오.
      참고: 튜브를 흔들어 배양 전에 표피가 완전히 잠겼을 수 있도록 합니다.
3. 1차 세포의 수집 및 배양
   1. 동일한 양의 종단 용액(10% FBS, DMEM의 1% P/S)을 추가하여 트립신과 파이펫을 10-15배 위아래로 중화하여 표피 세포를 분리합니다.
   2. 100 μm 메쉬 필터를 통해 새로운 50mL 튜브에 셀 서스펜션을 전달하여 이물질을 제거합니다.
   3. 원심 분리기 200 x g에서 5 분 동안.
   4. 상체를 제거하고 세포를 다시 중단하기 위해 접종 TIVA 배지10mL를 추가합니다.
   5. 다시 매달린 세포를 100mm 배양 접시에 넣습니다.
   6. 5 % CO_2와37 ° C 인큐베이터에서 배양 .
   7. 매 2일마다 배지를 변경합니다.
   8. 통로 세포는 80%의 합류에 도달할 때입니다.

3. 새로운 방법

참고: 새로운 방법에서 조직 제제 및 소화를 위한 절차는 종래의 방법에 대해 상술한 바와 동일하며, 유일한 차이점은 고립된 신선한 세포가 10μM Y-27632를 함유하는 TIVA 배지의 10mL에서 재장주된다는 것입니다.

1. 시드 후 이틀 후, Y-27632없이 일반 TIVA 매체로 미디어를 교체하십시오. 그 후, 배양 조건은 새로운 방법과 종래의 방법 사이에 동일하다.

4. 세포 패시징

1. TIVA 매체를 제거하고 PBS로 각 문화 요리를 두 번 헹구는 다.
2. 100mm 세포 배양 접시당 2mL의 0.05%의 트립신을 추가합니다.
   참고: 소화 효소와 접시 바닥 사이의 적절한 접촉을 보장하기 위해 접시를 흔들어.
3. 37°C 인큐베이터에서 2분 동안 소화합니다.
4. 현미경을 사용하여 세포를 확인하고 대부분의 세포가 세포 배양 접시에서 분리되었는지 확인하십시오.
   참고: 접시를 부드럽게 탭하여 세포를 풀어 주어 용액에 떠 있습니다. 대부분의 세포가 도청 후 중단되지 않았지만 5 분 이상 중단하지 않으면 소화 시간을 연장하십시오.
5. 멜라닌세포는 2mL의 종단용 용액을 추가하여 트립신 활성을 중화한 후 15mL 튜브로 전송한다. 원심 분리기 200 x g에서 5 분 동안.
6. 체퍼를 천천히 제거한 후 TIVA 배지의 10mL로 각 세포 펠릿을 다시 중단하고 멜라닌세포의 수를 계산합니다.
7. 100mm 세포 배양 접시당 TIVA 배지 10mL에서 약 1 x 10⁶ 멜라닌세포플레이트를 플레이트.
8. 세포 배양 배지를 매 48시간마다 갱신한다.

결과

도 1은 종래와 새 방법을 비교하는 회로도를 나타낸다. 새로운 방법을 이용한 조직 제제 및 소화 절차는 종래의 방법에 대한 절차와 동일하며, 유일한 차이점은 10 μM Y-27632의 존재시 TIVA 배지의 10mL에서 분리된 세포가 재주중단된다는 것입니다. 시드 후 이틀 후, Y-27632없이 일반 TIVA 매체로 미디어를 교체하십시오. 피부 조직에서 1 차적인 melanocytes를 격리하는 전통적인 방법은...

토론

여기에 설명된 프로토콜은 최근 간행물^16을기반으로 했습니다. 새로운 방법으로 최상의 결과를 얻으려면 다음 중요한 단계에 주의를 기울여야 합니다. 첫째, 표피와 진피의 성공적인 분리가 중요합니다. 성인 포피 조직을 메스 블레이드를 사용하여 3-4mm 너비의 스트립으로 잘라 내어 디스파가 더 철저하고 쉽게 변미에서 표피를 분리할 수 있도록 합니다. 둘째, 이 두 층을 분리할...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA)	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation