Y-27632 enrichit le rendement des mélanocytes humains à partir de tissus cutanés adultes

Résumé

Cet article rapporte que l’ajout de Y-27632 à TIVA moyen peut augmenter considérablement le rendement des mélanocytes des tissus de la peau adulte.

Résumé

L’isolement et la culture des mélanocytes primaires des tissus cutanés sont très importants pour la recherche biologique et ont été largement utilisés pour des applications cliniques. Isoler les mélanocytes primaires des tissus cutanés par la méthode conventionnelle prend habituellement environ 3 à 4 semaines pour passer suffisamment. Plus important encore, les tissus utilisés sont généralement des avant-parents nouveau-nés et il est encore un défi d’isoler efficacement les mélanocytes primaires des tissus adultes. Nous avons récemment mis au point une nouvelle méthode d’isolement pour les mélanocytes qui ajoute Y-27632, un inhibiteur de la rhénase, au milieu de culture initial pendant 48 h. Par rapport au protocole conventionnel, cette nouvelle méthode augmente considérablement le rendement des mélanocytes et raccourcit le temps nécessaire pour isoler les mélanocytes des tissus de prépuce. Nous décrivons maintenant cette nouvelle méthode plus en détail en utilisant l’épiderme adulte pour la culture efficace des mélanocytes primaires. Fait important, nous montrons que les mélanocytes obtenus à partir de tissus adultes préparés par cette nouvelle méthode peuvent fonctionner normalement. Ce nouveau protocole bénéficiera de manière significative aux études des défauts de pigmentation et des mélanomes utilisant des mélanocytes primaires préparés à partir de tissus de peau adultes facilement accessibles.

Introduction

Le but de cette étude était de développer un protocole simple et efficace pour isoler les mélanocytes de l’épiderme de la peau adulte pour la recherche biologique et les applications cliniques. Les mélanocytes, qui sont situés dans l’épiderme basal de la peau et dans les follicules pileux, jouent un rôle important dans la pigmentation de la peau et des cheveux en produisant de la mélanine¹. La pigmentation cutanée résultante des mélanocytes épidermiques agit comme un filtre de rayonnement ultraviolet qui réduit /empêche les dommages d’ADN aux cellules sous-jacentes dans la peau². La prolifération anormale des mélanocytes dans la peau est assez commune, comme dans la formation de nevi bénin (taupes) dans lequel les mélanocytes potentiellement se transformer en croissance oncogène suivie par la sénescence cellulaire³.

Depuis 1957, l’isolement et la culture subséquente des mélanocytes primaires humains est possible⁴, mais ce n’est que depuis 1982 qu’il existe une méthode efficace qui peut reproduire les cultures de mélanocytes humains à partir de l’épiderme⁵. La méthode conventionnelle pour isoler les mélanocytes primaires de l’épiderme implique une digestion enzymatique en deux étapes. En bref, la peau est d’abord digérée avec du dispase pour séparer l’épiderme du derme, après quoi l’épiderme est digéré avec de la trypsine pour produire des suspensions contenant des mélanocytes et des kératinocytes, qui peuvent ensuite être cultivées sélectivement dans différents médias. Actuellement, la culture initiale prend habituellement environ 3 à 4 semaines pour que les mélanocytes atteignent la confluence en utilisant la méthode conventionnelle, qui est probablement due à la faible efficacité de leur isolement. Par conséquent, l’augmentation de la production initiale de mélanocytes à partir de tissus de la peau adulte serait très utile pour la recherche en laboratoire et les applications cliniques.

De nombreux facteurs de croissance, dont la plupart ont été sécrétés par les kératinocytes (p. ex., α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF et SCF)^5à8, régulent la différenciation et la prolifération des mélanocytes mammifères. En l’absence de couches d’alimentation, l’absence de ces facteurs de croissance conduit à la diminution de la prolifération des mélanocytes et leur apoptose accrue⁹. La co-culture des kératinocytes comme cellules d’alimentation et de mélanocytes pourrait conduire à la prolifération accélérée des mélanocytes et à la réduction de l’apoptose. Cependant, la méthode de co-culture exige non seulement plus de tissus de peau pour préparer des kératinocytes, ce qui n’est pas pratique, mais aussi ne pourrait pas fonctionner efficacement parce que les conditions de culture exigées par les mélanocytes ne favorise pas la croissance des kératinocytes, et vice-versa.

Des études antérieures ont rapporté que l’ajout de Y-27632, un inhibiteur de ROCK, dans le milieu de croissance peut améliorer le rendement des cellules épidermiques primaires humaines des tissus de la peau^10-14. Par conséquent, il serait intéressant de vérifier si l’isolement des mélanocytes primaires humains bénéficierait de la présence de Y-27632. En effet, l’ajout de Y-27632 dans le milieu¹⁵de tiva d’inoculation , qui contient TPA, IBMX, Na₃VO₄ et dbcAMP, a considérablement augmenté le rendement des mélanocytes primaires isolés des tissus de prépuce dans les cultures initiales¹⁶. Par rapport au protocole conventionnel, ce nouveau protocole est nettement plus efficace pour augmenter le rendement des mélanocytes¹⁶. Par conséquent, ce protocole décrit la nouvelle méthode en détail à l’aide de tissus cutanés adultes basés sur une étude précédente¹⁶ afin de promouvoir son application dans la recherche biologique de base et appliquée.

Protocole

L’utilisation de tissus prépuces adultes dans ce protocole a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche humaine (no 2015120401, date : 12 mai 2015).

REMARQUE : Effectuer toutes les procédures suivantes dans un environnement stérile pour prévenir les contaminations des cellules et des cultures.

1. Préparations

1. Recueillir les tissus frais du prépuce adulte des chirurgies de circoncision dans des tubes de 15 mL contenant 10 mL de saline tampon de phosphate (PBS) et stocker dans 4 °C.
   REMARQUE : Séparez les tissus comme indiqué ci-dessous dans les 24 h suivant leur excision.
2. Préparer les réactifs et le milieu de culture.
   1. Préparer 3% de P/S (pénicilline/streptomycine) comme solution de lavage. Mélanger 50 mL de PBS avec 1,5 mL de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 mg/L) (P/S).
   2. Préparer la solution de terminaison (solution de neutralisation) pour la neutralisation de la digestion enzymatique. Supplément 1% P/S, sérum bovin foetal (FBS) en DMEM moyen.
   3. Préparer les mélanocytes de TIVA à la culture : F12 de Jambon; 10% FBS; 1x P/S/glutamine; 50 ng/mL 12-O-tétradecanoyl phorbol-13-acétate (TPA); 1 x 10^-4 M 3-isobutyl-1-méthyl xanthine (IBMX); 1 μM Na₃VO₄; 1 x 10^-3 M N-6,2′-O-dibutyryladenosine-3′,5′-monophosphate cyclique (dbcAMP).

2. La méthode conventionnelle

1. Prétraitement des tissus cutanés
   1. Rincer chaque tissu avant-carin adulte une fois avec 10 mL d’éthanol à 75 % (alcool) pendant 30 s, puis rincer deux fois avec 10 mL de solution de lavage (3 % de P/S), pendant 5 min chacun.
      NOTE: Laver les tissus prépuce avec 10 mL de PBS au début s’il ya beaucoup de sang. Tous les lavages sont préparés dans des plats de culture cellulaire de 100 mm.
   2. Gratter chaque tissu prépuce à l’aide d’une lame chirurgicale pour enlever les tissus adipeux sous-cutanés et les tissus conjonctifs lâches dans le couvercle d’un plat de culture cellulaire de 100 mm.
      REMARQUE : Utilisez un scalpel pour gratter les couches de graisse jusqu’à ce que seuls l’épiderme mince et le derme dense restent.
   3. Transférer chaque prépuce adulte dans un autre plat de culture de 100 mm avec le côté derme vers le bas.
      REMARQUE : Coupez chaque tissu avant-peau adulte en bandes de 3 à 4 mm de large à l’aide d’une lame de scalpel pour que le dispase fonctionne plus efficacement.
   4. Ajouter 2,5 mg/mL à chaque plat de culture de 100 mm avec des tissus de prépuce adultes et incuber de 16 à 20 h à 4 °C.
      REMARQUE : Chaque gramme de tissu est digéré avec 10 mL de solution dispase.
2. Séparation de l’épiderme du tissu prépuce adulte
   1. Après la digestion pendant 16 à 20 h, séparer l’épiderme du derme à l’aide de pinces à épiler. Prenez un côté du bord dermique du tissu avec une pince à épiler et la position correspondante de la partie épidermique avec une autre pince à épiler et épluchez doucement l’épiderme.
   2. Laver l’épiderme 3x avec une solution de lavage (3% P/S), puis transférer l’épiderme dans un tube.
   3. Submerger l’épiderme en ajoutant 5 ml de trypsin à 0,05% dans le tube et incuber dans un bain d’eau pendant 30 min à 37 °C.
      REMARQUE : Secouez le tube pour vous assurer que l’épiderme est complètement submergé avant l’incubation.
3. Collecte et culture des cellules primaires
   1. Ajoutez un volume égal de solution de terminaison (10% FBS, 1% P/S en DMEM) pour neutraliser la trypsine et la pipette de la solution de haut en bas 10-15 fois pour séparer les cellules épidermiques.
   2. Passer la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 50 ml à travers un filtre à mailles de 100 μm pour enlever les débris.
   3. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
   4. Retirez le supernatant et ajoutez 10 mL de milieu d’inoculation TIVA pour résuspender les cellules.
   5. Ensemencez les cellules réesspensées dans un plat de culture de 100 mm.
   6. Culture dans un incubateur à 37°C avec 5% de CO₂.
   7. Changer le support tous les 2 jours.
   8. Cellules de passage quand elles atteignent 80% confluence.

3. La nouvelle méthode

REMARQUE : La procédure de préparation et de digestion des tissus dans la nouvelle méthode est la même que celle décrite ci-dessus pour la méthode conventionnelle, la seule différence étant que les cellules fraîches isolées sont réesspensées dans 10 mL de milieu TIVA contenant 10 μM Y-27632.

1. Deux jours après l’ensemencement, remplacer le support par un support TIVA normal sans Y-27632. Après cela, les conditions culturelles sont les mêmes entre les méthodes nouvelles et conventionnelles.

4. Passage cellulaire

1. Retirer le milieu TIVA et rincer chaque plat de culture deux fois avec pbs.
2. Ajouter 2 mL de 0,05% de trypsine par plat de culture cellulaire de 100 mm.
   REMARQUE : Agitez le plat pour assurer un contact adéquat entre les enzymes digestives et le fond du plat.
3. Digèrez dans un incubateur de 37 °C pendant 2 min.
4. Utilisez un microscope pour vérifier les cellules, et assurez-vous que la plupart des cellules se sont dissociées du plat de culture cellulaire.
   REMARQUE : Appuyez doucement sur le plat pour libérer les cellules pour arrondir et flotter dans la solution. Prolongez le temps de digestion si la plupart des cellules ne sont pas suspendues après avoir tapé, mais pas plus de 5 minutes de plus.
5. Transférer les mélanocytes dans un tube de 15 mL après avoir neutralisé l’activité de trypsine en ajoutant 2 ml de solution de terminaison. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
6. Resuspendez chaque granulé de cellule avec 10 mL de milieu TIVA après avoir lentement enlevé le supernatant, puis comptez le nombre de mélanocytes.
7. Assiette d’environ 1 x^{10 6} mélanocytes dans 10 mL de TIVA moyen par plat de culture cellulaire de 100 mm.
8. Renouveler le milieu de culture cellulaire tous les 48 h.

Résultats

La figure 1 montre un diagramme schématique comparant les méthodes conventionnelles et les nouvelles. La procédure de préparation et de digestion des tissus avec la nouvelle méthode est la même que la procédure pour la méthode conventionnelle, la seule différence étant que les cellules isolées sont resuspendées dans 10 mL de TIVA moyen en présence de 10 μM Y-27632. Deux jours après l’ensemencement, remplacer le support par un support TIVA normal sans Y-27632. La méthode con...

Discussion

Le protocole décrit ici était basé sur une publication récente¹⁶. Une certaine attention devrait être accordée aux étapes critiques suivantes pour obtenir les meilleurs résultats avec la nouvelle méthode. Tout d’abord, la séparation réussie de l’épiderme et du derme est cruciale. Couper les tissus du prépuce adulte en bandes de 3 à 4 mm de large à l’aide d’une lame de scalpel pour que le dispase fonctionne plus soigneusement et plus facilement pour séparer l’épiderme du ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA)	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation