Y-27632 enriquece el rendimiento de los melanocitos humanos de los tejidos adultos de la piel

Resumen

Este documento informa que la adición de Y-27632 al medio TIVA puede aumentar significativamente el rendimiento de los melanocitos de los tejidos cutáneos adultos.

Resumen

El aislamiento y cultivo de melanocitos primarios de los tejidos de la piel es muy importante para la investigación biológica y ha sido ampliamente utilizado para aplicaciones clínicas. Aislar los melanocitos primarios de los tejidos de la piel por el método convencional generalmente toma alrededor de 3 a 4 semanas para pasar lo suficiente. Más importante aún, los tejidos utilizados son generalmente prepucios recién nacidos y sigue siendo un desafío aislar eficientemente los melanocitos primarios de los tejidos adultos. Recientemente desarrollamos un nuevo método de aislamiento para melanocitos que añade Y-27632, un inhibidor de la quinasa Rho, al medio de cultivo inicial durante 48 h. En comparación con el protocolo convencional, este nuevo método aumenta dramáticamente el rendimiento de los melanocitos y acorta el tiempo necesario para aislar los melanocitos de los tejidos de prepucio. Ahora describimos este nuevo método con más detalle utilizando la epidermis adulta para cultivar eficientemente melanocitos primarios. Es importante destacar que los melanocitos obtenidos a partir de tejidos adultos preparados por este nuevo método pueden funcionar normalmente. Este nuevo protocolo beneficiará significativamente los estudios de defectos de pigmentación y melanomas utilizando melanocitos primarios preparados a partir de tejidos de piel adultos de fácil acceso.

Introducción

El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo simple y eficaz para aislar los melanocitos de la epidermis de la piel adulta para la investigación biológica y aplicaciones clínicas. Los melanocitos, que se encuentran en la epidermis basal de la piel y en los folículos pilosos, desempeñan un papel importante en la pigmentación de la piel y el cabello produciendo melanina^1. La pigmentación cutánea resultante de los melanocitos epidérmicos actúa como un filtro de radiación ultravioleta que reduce/previene el daño del ADN a las células subyacentes en la piel^2. La proliferación anormal de melanocitos en la piel es bastante común, como en la formación de nevi benignos (moles) en los que los melanocitos potencialmente se transforman en crecimiento oncogénico seguido de la senescencia celular³.

Desde 1957, el aislamiento y posterior cultura de los melanocitos primarios humanos ha sido posible⁴, pero sólo desde 1982 ha habido un método eficiente que puede establecer reproduciblemente culturas de melanocitos humanos de la epidermis^5. El método convencional para aislar los melanocitos primarios de la epidermis implica una digestión enzimática de dos pasos. Brevemente, la piel se digiere inicialmente con dispase para separar la epidermis de la dermis, después de lo cual la epidermis se digiere con tripina para producir suspensiones que contienen melanocitos y queratinocitos, que luego pueden ser cultivados selectivamente en diferentes medios. Actualmente, el cultivo inicial suele tardar entre 3 y 4 semanas en llegar a la confluencia utilizando el método convencional, que es probable que se deba a la baja eficiencia de su aislamiento. Por lo tanto, aumentar la producción inicial de melanocitos a partir de tejidos cutáneos adultos sería muy útil tanto para la investigación de laboratorio como para aplicaciones clínicas.

Muchos factores de crecimiento, la mayoría de los cuales han demostrado ser secretados por queratinocitos (p. ej., -MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF y SCF)^5-8, regulan la diferenciación y proliferación de melanocitos de mamíferos. En ausencia de capas alimentadoras, la falta de esos factores de crecimiento conduce a la disminución de la proliferación de melanocitos y su aumento de la apoptosis⁹. El co-cultivo de queratinocitos como células alimentadas y melanocitos podría conducir a la proliferación acelerada de melanocitos y a reducir la apoptosis. Sin embargo, el método de co-cultivo no sólo exige más tejidos de la piel para preparar queratinocitos, lo que no es práctico, sino que también no podría funcionar eficientemente porque las condiciones de cultivo requeridas por los melanocitos no favorecen el crecimiento de queratinocitos, y viceversa.

Estudios previos han informado de que la adición de Y-27632, un inhibidor de ROCK, en el medio de crecimiento puede mejorar el rendimiento de las células epidérmicas primarias humanas de los tejidos de la piel^10-14. Por lo tanto, sería interesante probar si el aislamiento de los melanocitos primarios humanos se beneficiaría de la presencia de Y-27632. De hecho, la adición de Y-27632 en el medio TIVA de inoculación¹⁵, que contiene TPA, IBMX, Na₃VO₄ y dbcAMP, aumentó significativamente el rendimiento de los melanocitos primarios aislados de los tejidos de prepucio en los cultivos iniciales¹⁶. En comparación con el protocolo convencional, este nuevo protocolo es significativamente más eficiente en el aumento del rendimiento de los melanocitos¹⁶. Por lo tanto, este protocolo describe el nuevo método en detalle utilizando tejidos cutáneos adultos basados en un estudio anterior¹⁶ con el fin de promover su aplicación en la investigación biológica básica y aplicada.

Protocolo

El uso de tejidos adultos de antepuesto en este protocolo ha sido aprobado por el Comité de ética de la investigación humana (No.2015120401, fecha: 12 de mayo de 2015).

NOTA: Realice todos los procedimientos siguientes en un entorno estéril para evitar contaminaciones de células y cultivos.

1. Preparativos

1. Reunir los tejidos adultos frescos del prepucio de las cirugías de circuncisión en tubos de 15 ml que contengan 10 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS) y almacenar en 4 oC.
   NOTA: Separe los tejidos como se detalla a continuación dentro de las 24 horas después de su escisión.
2. Preparar reactivos y medios de cultivo.
   1. Preparar 3% P/S (penicilina/estreptomicina) como solución de lavado. Mezclar 50 ml de PBS con 1,5 ml de penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 mg/L) (P/S).
   2. Preparar la solución de terminación (solución de neutralización) para la neutralización de la digestión enzimática. Suplemento 1% P/S, 10% suero bovino fetal (FBS) en medio DMEM.
   3. Preparar TIVA melanocitos medios a la cultura: F12 de Jamón; 10% FBS; 1x P-S-glutamina; 50 ng/mL 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA); 1 x 10^-4 M 3-isobutilo-1-metil xantina (IBMX); 1 m Na₃VO₄; 1 x 10^-3 M N-6,2o-O-dibutyriladenosina-3o,5o-monofosfato cíclico (dbcAMP).

2. El método convencional

1. Pretratamiento de tejido cutáneo
   1. Enjuagar cada tejido de prepucio adulto una vez con 10 ml de etanol al 75% (alcohol) durante 30 s, y luego enjuagar dos veces con 10 ml de solución de lavado (3% P/S), durante 5 minutos cada uno.
      NOTA: Lave los tejidos del prepucio con 10 ml de PBS al principio si hay mucha sangre. Todos los lavados se preparan en platos de cultivo celular de 100 mm.
   2. Raspa cada tejido de prepucio con una cuchilla quirúrgica para eliminar los tejidos adiposos subcutáneos y los tejidos conectivos sueltos en la cubierta de un plato de cultivo celular de 100 mm.
      NOTA: Utilice un bisturí para raspar las capas de grasa hasta que sólo queden la epidermis delgada y la dermis densa.
   3. Transfiera cada prepucio adulto a otro plato de cultivo de 100 mm con el lado de la dermis hacia abajo.
      NOTA: Corte cada tejido de prepucio adulto en tiras de 3-4 mm de ancho usando una cuchilla de bisturí para hacer que el dispase funcione de manera más eficiente.
   4. Añadir 2,5 mg/ml descaperdio a cada plato de cultivo de 100 mm con tejidos de prepucio adultos e incubar durante 16 a 20 h a 4 oC.
      NOTA: Cada gramo de tejido se digiere con 10 ml de solución dispase.
2. Separación de la epidermis del tejido del prepucio adulto
   1. Después de la digestión durante 16 a 20 h, separe la epidermis de la dermis con pinzas. Agarre un lado del borde dérmico del tejido con una pinza y la posición correspondiente de la parte epidérmica con otra pinza y despegue suavemente la epidermis.
   2. Lave la epidermis 3x con solución de lavado (3% P/S) y luego transfiera la epidermis a un tubo.
   3. Sumergir la epidermis añadiendo 5 ml de 0.05% de trippsina en el tubo e incubar en un baño de agua durante 30 min a 37 oC.
      NOTA: Agitar el tubo para asegurarse de que la epidermis está completamente sumergida antes de la incubación.
3. Recolección y cultivo de células primarias
   1. Añadir un volumen igual de solución de terminación (10% FBS, 1% P/S en DMEM) para neutralizar la tripina y pipetear la solución arriba y abajo 10-15 veces para separar las células epidérmicas.
   2. Pase la suspensión celular a un nuevo tubo de 50 ml a través de un filtro de malla de 100 m para eliminar los residuos.
   3. Centrífuga a 200 x g durante 5 min.
   4. Retire el sobrenadante y agregue 10 ml de inoculación TIVA medio para resuspender las células.
   5. Siembra las células resuspendidas en un plato de cultivo de 100 mm.
   6. Cultivo en una incubadora de 37oC con 5% de CO₂.
   7. Cambie el medio cada 2 días.
   8. Células de paso cuando alcanzan el 80% de confluencia.

3. El nuevo método

NOTA: El procedimiento para la preparación y digestión de tejidos en el nuevo método es el mismo que se describió anteriormente para el método convencional, la única diferencia es que las células frescas aisladas se resuspenden en 10 ml de medio TIVA que contiene 10 M Y-27632.

1. Dos días después de la siembra, sustituya el soporte por un medio TIVA normal sin Y-27632. Después de eso, las condiciones de cultivo son las mismas entre los métodos nuevos y los convencionales.

4. Passaging celular

1. Retire el medio TIVA y enjuague cada plato de cultivo dos veces con PBS.
2. Añadir 2 ml de 0,05% de trippsina por plato de cultivo celular de 100 mm.
   NOTA: Agitar el plato para asegurar un contacto adecuado entre las enzimas digestivas y la parte inferior del plato.
3. Digerir en una incubadora de 37oC durante 2 min.
4. Usa un microscopio para revisar las células y asegúrate de que la mayoría de las células se hayan disociado del plato de cultivo celular.
   NOTA: Toque suavemente el plato para liberar las celdas para redondear hacia arriba y flotar en la solución. Prolongar el tiempo de digestión si la mayoría de las células no se suspendieron después de tocar, pero no más de 5 minutos más.
5. Transfiera los melanocitos a un tubo de 15 ml después de neutralizar la actividad de la trippsina añadiendo 2 ml de solución de terminación. Centrífuga a 200 x g durante 5 min.
6. Resuspender cada pellet celular con 10 ml de medio TIVA después de eliminar lentamente el sobrenadante, y luego contar el número de melanocitos.
7. Placa de aproximadamente 1 x 10⁶ melanocitos en 10 ml de medio TIVA por plato de cultivo celular de 100 mm.
8. Renovar el medio de cultivo celular cada 48 h.

Resultados

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático que compara los métodos convencionales y los nuevos. El procedimiento para la preparación y digestión de tejidos con el nuevo método es el mismo que el procedimiento para el método convencional, la única diferencia es que las células aisladas se resuspenden en 10 ml de medio TIVA en presencia de 10 M Y-27632. Dos días después de la siembra, sustituya el soporte por un medio TIVA normal sin Y-27632. El método convencional de aislar los me...

Discusión

El protocolo descrito aquí se basó en una publicación reciente¹⁶. Se debe prestar cierta atención a los siguientes pasos críticos para lograr los mejores resultados con el nuevo método. En primer lugar, la separación exitosa de la epidermis y la dermis es crucial. Corte los tejidos adultos del prepucio en tiras de 3-4 mm de ancho usando una cuchilla de bisturí para hacer que el dispase funcione más a fondo y fácilmente para separar la epidermis de la dermis. En segundo lugar, al separar ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA)	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation