Y-27632 מעשיר את התשואה של מלנוציטים אנושיים מרקמות עור למבוגרים

Summary

נייר זה מדווח כי התוספת של Y-27632 כדי בינונית הגוף יכול להגדיל באופן משמעותי את התשואה של מלנוציטים מרקמות העור למבוגרים.

Abstract

הבידוד והתרבות של מלנוציטים הראשי מרקמות העור הוא מאוד חשוב עבור מחקר ביולוגי השתמשו באופן נרחב עבור יישומים קליניים. בידוד מלנוציטים הראשי מרקמות העור על ידי השיטה המקובלת בדרך כלל לוקח כ 3 עד 4 שבועות למעבר מספיק. חשוב יותר, הרקמות המשמשות בדרך כלל היילוד עורלות וזה עדיין אתגר כדי לבודד ביעילות מלנוציטים הראשי מרקמות למבוגרים. פיתחנו לאחרונה שיטת בידוד חדשה עבור מלנוציטים המוסיפה Y-27632, מעכבי Rho קינאז, למדיום התרבות הראשונית עבור 48 h. לעומת הפרוטוקול המקובל, זו שיטה חדשה מגדילה באופן דרמטי את התשואה של מלנוציטים ומקצרת את הזמן הנדרש כדי לבודד מלנוציטים מרקמות העורלה. עכשיו אנחנו מתארים את השיטה החדשה הזאת בפירוט רב יותר באמצעות אפידרמיס למבוגרים לתרבות ביעילות מלנוציטים הראשי. חשוב מכך, אנו מראים כי מלנוציטים שהתקבלו מרקמות למבוגרים שהוכנו על ידי שיטה חדשה זו יכולה לתפקד כרגיל. פרוטוקול חדש זה יועיל באופן משמעותי למחקרים של פגמים פיגמנטציה ומלנומה באמצעות מלנוציטים הראשי מוכן בקלות לגשת רקמות עור למבוגרים.

Introduction

המטרה של מחקר זה היה לפתח פרוטוקול פשוט ואפקטיבי כדי לבודד מלנוציטים מן האפידרמיס של העור המבוגר למחקר ביולוגי ויישומים קליניים. מלנוציטים, אשר ממוקמים באפידרמיס הבזליים של העור ובזקיקי השיער, לשחק תפקיד חשוב בפיגמנטציה של העור והשיער על ידי הפקת מלנין¹. העור שנוצר פיגמנטציה מתוך מלנומה באפידרמיס מעשים כמו מסנן קרינה אולטרה סגולה המפחית/מונע נזק DNA לתאים הבסיסיים בעור². התפשטות חריגה של מלנוציטים בעור הוא די נפוץ, כמו בהיווצרות nevi שפיר (שומות) שבו מלנוציטים בפוטנציאל להפוך לצמיחה אונגניים ואחריו הזדקנות הסלולר³.

מאז 1957, הבידוד והתרבות הבאה של מלנוציטים הראשי האנושי היה אפשרי⁴, אבל רק מאז 1982 יש כבר שיטה יעילה שיכולה ליצור תרבויות של מלנוציטים אנושיים^מתוךהאפידרמיס 5. השיטה המקובלת לבודד מלנוציטים הראשי מתוך האפידרמיס כרוכה בעיכול שני שלבים אנזימטיות. בקצרה, העור מתעכל בתחילה עם בעיות כדי להפריד את האפידרמיס מן dermis, לאחר שאפידרמיס מתעכל עם טריפסין לייצר השעיות המכילות מלנוציטים ו keratinocytes, אשר יכול להיות באופן סלקטיבי גדל במדיה שונים. כיום, התרבות הראשונית אורכת בדרך כלל 3 עד 4 שבועות עבור מלנוציטים כדי להגיע לשטף באמצעות השיטה המקובלת, אשר צפוי בשל היעילות הנמוכה של הבידוד שלהם. לכן, הגדלת הייצור הראשוני של מלנוציטים מרקמות העור למבוגרים יהיה מועיל למדי עבור שני מחקר מעבדה ויישומים קליניים.

גורמי גדילה רבים, שרובם הוכחו להיות מופרש על ידי keratinocytes (למשל, α-msh, acth, bfgf, ngf, ET-1, GM-שדרתי, hgf, אבל scf)^5-8, להסדיר את הבידול והתפשטות של מלנוציטים היונקים. בהיעדר שכבות ממזין, חוסר גורמי גדילה אלה מוביל את התפשטות ירידה של מלנוציטים ואפופטוזיס מוגברת שלהם⁹. שיתוף התרבות של keratinocytes כמו תאים מאכיל ומלנוציטים עלול להוביל להאצת מלנוציט התפשטות ואפופטוזיס מופחת. עם זאת, שיטת שיתוף התרבות לא רק דורש רקמות העור יותר כדי להכין keratinocytes, אשר אינו מעשי, אבל גם לא יכול לעבוד ביעילות כי תנאי התרבות הנדרשים על ידי מלנוציטים אינו מעדיף צמיחה keratinocytes, ולהיפך.

מחקרים קודמים דיווחו כי תוספת של Y-27632, מעכב סלע, לתוך המדיום צמיחה יכול לשפר את התשואה של התאים האנושיים באפידרמיס העיקרי מרקמות העור^10-14. לכן, זה יהיה מעניין לבדוק אם הבידוד של המלנוציטים הראשי האנושי יועיל מנוכחותם של Y-27632. אכן, תוספת של Y-27632 לתוך בינונית החיסון¹⁵, אשר מכיל הסברתי, Ibmx, Na₃VO₄ ו dbcamp, הגדילה באופן משמעותי את התשואה של מלנוציטים הראשי מבודד רקמות העורלה בתרבויות הראשוניות¹⁶. בהשוואה לפרוטוקול המקובל, פרוטוקול חדש זה הוא יעיל יותר באופן משמעותי בהגדלת התשואה של מלנוציטים¹⁶. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר את השיטה החדשה בפירוט באמצעות רקמות עור למבוגרים המבוססות על מחקר קודם¹⁶ על מנת לקדם את יישומו במחקר ביולוגי בסיסי ומיושם.

Protocol

השימוש ברקמות העורלה הבוגרת בפרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי (No 2015120401, תאריך: 12 במאי 2015).

הערה: בצע את כל ההליכים הבאים בסביבה סטרילית כדי למנוע זהום של תאים ותרבויות.

1. ההכנות

1. לאסוף רקמות מבוגרים טריים העורלה מתוך ניתוחים מילה ב 15 צינורות mL המכיל 10 מ ל של מלח מאגר פוספט (PBS) ולאחסן 4 ° c.
   הערה: הפרד בין הרקמות כמפורט להלן בתוך 24 שעות לאחר כריתה.
2. הכינו ריאגנטים ומדיום לתרבות.
   1. הכינו 3% P/S (פניצילין/סטרפטומיצין) כפתרון כביסה. לערבב 50 mL של PBS עם 1.5 מ ל של פניצילין (100 U/mL) ו סטרפטומיצין (100 mg/L) (P/S).
   2. הכן את פתרון הסיום (פתרון ניטרול) לנטרול העיכול האנזימטי. תוספת 1% P/S, 10% סרום של שור עוברי (FBS) לתוך מדיום Dמאמ.
   3. הכנת בינונית-מית לתרבות מלנוציטים: האם F12; 10% FBS; 1x P ⁄ S ⁄ גלוטמין; 50 ng/mL 12-O-טטרדאנואיל פורבול-13-אצטט (הסברתי); 1 x 10^-4 M 3-איזובוטיל-1-מתיל קסנלך (ibmx); 1 μM Na₃VO₄; 1 x 10^-3 M N-6, 2 ′-O-dibutyryladenosine-3 ′, 5 ′ מחזורית Monophosphate (dbcamp).

2. השיטה המקובלת

1. טיפול מקדים ברקמת עור
   1. לשטוף כל רקמת עורלה למבוגרים פעם עם 10 מ ל של 75% אתנול (אלכוהול) עבור 30 s, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 10 מ ל של פתרון כביסה (3% P/S), עבור 5 דקות כל אחד.
      הערה: לשטוף את רקמות העורלה עם 10 מ ל של PBS בהתחלה אם יש הרבה דם. כל שוטף מוכנים בשנת 100 מ"מ מנות תרבות התא.
   2. מגרדים כל רקמת עורלה עם להב כירורגי כדי להסיר רקמות השומן התת עורית ורקמות חיבור רופף בשער של 100 מ"מ צלחת תרבות התא.
      הערה: השתמשו באזמל כדי לגרד את שכבות השומן משם עד שרק האפידרמיס הדק והדאמיס הצפופים יישארו.
   3. להעביר כל עורלה למבוגרים לתוך מאכל אחר 100 mm התרבות עם הקצה למטה.
      הערה: חותכים כל רקמת עורלה מבוגרת לתוך 3-4 מילימטר רחב רצועות באמצעות להב אזמל כדי להפוך את dispase לעבוד ביעילות רבה יותר.
   4. הוסף 2.5 mg/mL dispase כדי כל מאכל 100 mm התרבות עם רקמות עורלה למבוגרים ו דגירה עבור 16 עד 20 h ב 4 ° c.
      הערה: כל גרם של רקמה מתעכל עם 10 מ ל של פתרון dispase.
2. הפרדת האפידרמיס מרקמת העורלה הבוגרת
   1. לאחר העיכול עבור 16 כדי 20 h, להפריד את האפידרמיס מן דרמיס באמצעות מלקחיים. תפוס צד אחד של הקצה העורי של הרקמה עם פינצטה אחד ואת המיקום המקביל של החלק באפידרמיס עם פינצטה אחר ולקלף בעדינות את האפידרמיס.
   2. לשטוף את האפידרמיס 3x עם פתרון כביסה (3% P/S), ולאחר מכן להעביר את האפידרמיס לתוך צינור.
   3. לטבול את האפידרמיס על ידי הוספת 5 מ ל של 0.05% טריפסין לתוך הצינור ומכבית באמבט מים 30 דקות ב 37 ° c.
      הערה: לנער את הצינור כדי להבטיח את האפידרמיס הוא שקוע לחלוטין לפני הדגירה.
3. איסוף ותרבות של תאים ראשוניים
   1. הוסף נפח שווה של פתרון הפסקת (10% FBS, 1% P/S ב-DMEM) כדי לנטרל את טריפסין ופיפטה את הפתרון למעלה ולמטה 10-15 פעמים כדי להפריד את התאים באפידרמיס.
   2. להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור חדש 50 mL באמצעות מסנן שינוי 100 יקרומטר להסיר פסולת.
   3. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות.
   4. הסר את הסופרנטאנט והוסף 10 mL של אמצעי החיסון כדי להשעות מחדש את התאים.
   5. הזרע את התאים מחדש לתוך צלחת התרבות 100 מ"מ.
   6. תרבות בחממה 37 ° C עם 5% CO₂.
   7. . להחליף את המדיום כל יומיים
   8. מעבר תאים כאשר הם מגיעים 80% המפגש.

3. השיטה החדשה

הערה: ההליך להכנת רקמות ועיכול בשיטה החדשה זהה כמתואר לעיל עבור השיטה המקובלת, ההבדל היחיד להיות כי תאים טריים מבודדים מושעה ב 10 מ ל של מדיום ממוצע המכיל 10 μM Y-27632.

1. יומיים לאחר זריעת, להחליף את המדיה עם בינוני המצב נורמלי ללא Y-27632. לאחר מכן, תנאי התרבות זהים בין השיטה החדשה לבין השיטות המקובלות.

4. הפסד תא

1. הסר את המדיום של החטיבה ושטוף כל מנה תרבותית פעמיים עם PBS.
2. הוסף 2 מ ל של 0.05% טריפסין לצלחת תרבות התא 100 מ"מ.
   הערה: לנער את הצלחת כדי להבטיח קשר הולם בין אנזימי העיכול והחלק התחתון של המנה.
3. לעכל בחממה 37 ° c עבור 2 דקות.
4. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק את התאים, וודא כי רוב התאים התעברו מתוך הצלחת תרבות התא.
   הערה: הקש בעדינות על הצלחת כדי לשחרר את התאים כדי לעגל ולצוף בפתרון. הארך את זמן העיכול אם רוב התאים לא הושהה לאחר הקשה, אך לא יותר מ -5 דקות נוספות.
5. העבירו את המלנוציטים לצינור של 15 מ ל לאחר נטרול פעילות טריפסין באמצעות הוספת 2 מ ל של פתרון סיום. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות.
6. השהה מחדש כל גלולה תא עם 10 מ ל של מדיום של החטיבה לאחר לאט הסרת supernatant, ולאחר מכן לספור את מספר מלנוציטים.
7. צלחת על 1 x 10⁶ מלנוציטים ב 10 מ ל של מדיום בינונית לכל 100 מ"מ צלחת תרבות התא.
8. חדש את המדיום תרבות התא כל 48 h.

תוצאות

איור 1 מציג דיאגרמה סכמטית המשווה את השיטות הקונבנציונליות והחדשות. ההליך להכנת רקמות ועיכול עם השיטה החדשה הוא זהה ההליך עבור השיטה המקובלת, ההבדל היחיד להיות כי התאים המבודדים מושעה מחדש 10 מ ל של מדיום של החטיבה בנוכחות של 10 μM Y-27632. יומיים לאחר זריעת, להחליף את המדיה עם בי?...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן התבסס על פרסום¹⁶שנערך לאחרונה. יש לשלם תשומת לב מסוימת לשלבים הקריטיים הבאים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר בשיטה החדשה. ראשית, הפרדה מוצלחת של האפידרמיס והדרמיס היא חיונית. חותכים את הרקמות העורלה למבוגרים לתוך 3-4 mm רצועות רחב באמצעות להב אזמל כדי להפו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA)	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation