عزل البكتيريا على شكل حرف L عن البول باستخدام طريقة الترشيح

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل البكتيريا على شكل حرف L عن البول ، باستخدام طريقة الترشيح. كما تم وصف الطرق التكميلية لإعداد وسط الشكل L ، ومراقبة الأشكال L عن طريق المجهر المجهري الطور وتحريض الأشكال L في ظل ظروف المختبر.

Abstract

يعتقد أن انتقال البكتيريا إلى حالة الشكل L يلعب دورا محتملا في التهرب المناعي واستمرار البكتيريا أثناء العلاج بالمضادات الحيوية التي تستهدف جدار الخلية. ومع ذلك ، فإن عزل البكتيريا على شكل حرف L والتعامل معها يمثل تحديا ، ويرجع ذلك أساسا إلى حساسيتها العالية للتغيرات في الأسمولية. هنا ، نصف بروتوكولات مفصلة لإعداد وسط الشكل L ، وعزل الأشكال L عن البول باستخدام طريقة الترشيح ، والكشف عن الأشكال L في عينات البول عن طريق الفحص المجهري للتباين الطوري وتحريض الأشكال L في المختبر. قد تختلف المتطلبات الدقيقة للبقاء على قيد الحياة ونمو أشكال L من سلالة إلى أخرى. لذلك ، تهدف الطرق المعروضة هنا إلى العمل كمبادئ توجيهية أساسية لإنشاء بروتوكولات L-form داخل المختبرات الفردية ، بدلا من كونها تعليمات دقيقة. يمكن أن تؤدي طريقة الترشيح إلى تقليل عدد أشكال L في العينة ولا ينبغي استخدامها للقياس الكمي. ومع ذلك ، فهي الطريقة الوحيدة المستخدمة حتى الآن للفصل الفعال للمتغيرات التي تعاني من نقص جدار الخلية عن نظيراتها المسورة ولتحديد السلالات البكتيرية القادرة على تبديل شكل L في المرضى الذين يعانون من التهابات المسالك البولية. يمكن تكييف طريقة الترشيح لعزل أشكال L عن المرضى الذين يعانون من فئات أخرى من الالتهابات البكتيرية ومن العينات البيئية.

Introduction

تقريبا جميع البكتيريا محاطة بهيكل يسمى جدار الخلية. الجدار مهم للحماية من الضغوط البيئية ، ويساعد في الانقسام المنتظم ويعطي البكتيريا شكلها¹. ومع ذلك ، فإن الجدار هو أيضا هدف لأجزاء من الجهاز المناعي وبعض أفضل المضادات الحيوية وأكثرها استخداما ، بما في ذلك البنسلين ^2،3. على الرغم من أهميتها ، يمكن لكل من البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام البقاء على قيد الحياة أحيانا بدون الجدار^{4،5،6،7،8}. إذا كانت الظروف المحيطة توفر حماية تناضحية كافية لمنعها من الانفجار وكانت عوامل استهداف جدار الخلية موجودة أيضا ، يمكن أن تنتقل البكتيريا إلى حالة خالية من الجدار ، يشار إليها باسم L-form^{4،5،6،7،8}.

تشير العديد من التقارير إلى أن التحول إلى حالة الشكل L والعودة إلى حالة الجدران قد يكون مهما في الجسم الحي كآلية للبكتيريا للبقاء على قيد الحياة من الهجوم من الجهاز المناعي المضيف والعلاج بالمضادات الحيوية التي تستهدف جدار^{الخلية 9،10،11،12،13،14،15}. من المحتمل أن يوفر مثل هذا الانتقال استراتيجية قوية لتكرار العدوى البكتيرية^{9،10،11،12،13،14،15}. يعد فهم البيولوجيا الأساسية للبكتيريا على شكل حرف L وتفاعلاتها مع المضيف أمرا بالغ الأهمية لفك تشفير دورها في التسبب في المرض. ومع ذلك ، فإن التعامل مع البكتيريا على شكل حرف L يمثل تحديا.

أولا ، بسبب عدم وجود جدار الخلية ، تكون البكتيريا على شكل حرف L عرضة للانفجار استجابة للتغيرات في الأسمولية. بالإضافة إلى ذلك ، تنقسم الأشكال L بطريقة غير منتظمة للغاية ، ولها أنماط نمو لا يمكن التنبؤ بها (عادة ما تكون أبطأ بكثير من نظيراتها المسورة) ، واعتمادا على السلالة ، قد تنتشر بشكل أفضل على الوسائط شبه السائلة ، بدلا من الوسائط الصلبة أو السائلة. جميع الاعتبارات المذكورة أعلاه تجعل من الصعب تحديد معدلات النمو ومقارنتها. الأنواع البكتيرية المختلفة (أو حتى السلالات) لها متطلبات استقلابية متنوعة لتبديل شكل L ونموه. على سبيل المثال ، تكون الأشكال L لبعض البكتيريا موجبة الجرام ، والتي تعتمد على التنفس الهوائي ، أكثر حساسية لأنواع الأكسجين التفاعلية من نظيراتها المسورة¹⁶.

عادة ما يكون تحريض أشكال L في ظل ظروف المختبر وفي المضيف مدفوعا بعوامل استهداف جدار الخلية ، مثل المضادات الحيوية والليزوزيم⁹. قد يؤدي مثل هذا العلاج إلى فقدان جزئي لجدار الخلية فقط ، وبالتالي يمكن أن تكون بعض البكتيريا المسورة (أو ذات الجدران الجزئية) موجودة في العينات ، مما يجعل من الصعب التمييز بين ما إذا كانت أي نتائج تجريبية ملحوظة ناتجة عن وجود أشكال L أو أشكال مسورة من البكتيريا. تميل تواتر أشكال L المستحثة في الجسم الحي إلى أن تكون منخفضة ، مما يعني أنه قد يكون من الصعب العثور عليها وعزلها. أخيرا ، نظرا لمورفولوجيتها متعددة الأشكال ، يمكن الخلط بسهولة بين أشكال L في الموقع وبين الهياكل ذات الأصل حقيقيات النواة ، مثل الأجسام موت الخلايا المبرمج أو الحبيبات المختلفة.

منذ اكتشافها في عام 1935¹⁷ ، تم تطوير عدة طرق للتعامل مع أشكال L في المختبر. يعتمد معظم هذه على إضافة عامل وقائي التناضح إلى وسط النمو. عادة ما يكون سكر أو ملح^{9،10،11،12،13،14،15،16،17،18}. كما ذكرنا أعلاه ، غالبا ما تحدث أشكال L جنبا إلى جنب مع البكتيريا المسورة في عينات المرضى وقد يكون الفصل بين المجموعتين أمرا صعبا. ومع ذلك ، فقد ثبت أنه على عكس البكتيريا المسورة ، يمكن أن تمر أشكال L عبر مرشح 0.45 ميكرومتر بسبب مرونتها وأحجامها المتغيرة. تم استخدام طريقة تستخدم مثل هذا المرشح لعزل أشكال L من البول^{10،19،20،21}.

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل البكتيريا على شكل حرف L عن البول ، باستخدام طريقة الترشيح (الشكل 1). كما تم وصف البروتوكولات التكميلية لإعداد وسيط الشكل L والمراقبة المجهرية لأشكال L وتحريض أشكال L في المختبر.

Protocol

1. تحضير وسط الشكل L (LM)

1. قم بوزن السكروز (الكمية المعدلة لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 0.58 م) و MgSO₄ (التركيز النهائي 8 مليمتر) وتسريب قلب الدماغ (BHI) (الكمية الموصى بها من قبل المورد) في زجاجة زجاجية ضعف حجم الحجم المطلوب من المتوسط. لتحضير 0.5 لتر من الوسط ، قم بوزن 100 غرام من السكروز و 1 غرام من MgSO₄ و 18.5 جم من BHI وضعها في زجاجة زجاجية سعة 1 لتر. سيسمح ذلك بإعادة تعليق أسهل للمكونات قبل التعقيم.
2. إذا كانت هناك حاجة إلى وسائط صلبة أو شبه صلبة ، أضف الكمية المطلوبة من الأجار. بالنسبة للوسائط الصلبة ، أضف 5 جم من الأجار لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 1٪ في 0.5 لتر من الوسط. بالنسبة للوسائط شبه الصلبة ، أضف 1 جم من الأجار لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 0.2٪ في 0.5 لتر من المتوسط.
3. قم بتعبئة الماء منزوع الأيونات (DI) إلى الحجم النهائي المطلوب.
4. أغلق الزجاجة واخلط جيدا عن طريق الرج. ليست هناك حاجة لإعادة تعليق المكونات تماما ، فقط تأكد من عدم تكتلها معا في قاع الزجاجة. قم بفك الغطاء والأوتوكلاف في دورة وسائط حساسة (115 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة). يوصى بخلط المكونات قبل التعقيم واستخدام دورة وسائط حساسة لمنع تكتل المكونات والسكروز بالكراميل.
5. افحص الوسيط بصريا بعد التعقيم. يجب ألا تكون هناك كتل ويجب أن يكون الوسط كهرمانيا اللون (الشكل 2 أ).
6. بعد التعقيم ، اترك الوسط يبرد إلى درجة حرارة تسمح بإمساك الزجاجة يدويا بشكل مريح.
7. إذا كان الوسيط مطلوبا لتحريض أشكال L ، فأضف مضادا حيويا و / أو عاملا محللا في هذه المرحلة (على سبيل المثال ، فوسفومايسين بتركيز نهائي قدره 400 ميكروغرام / مل ، البنسلين G عند 200 ميكروغرام / مل ، D-cycloserine عند 400 ميكروغرام / مل ، أمبيسلين عند 100 ميكروغرام / مل ، مونومايسين عند 50 ميكروغرام / مل ، ليزوزيم عند 100 ميكروغرام / مل أو الليزوستافين عند 5 ميكروغرام / مل). حدد تجريبيا نوع عامل تحفيز الشكل L (أو العوامل إذا كان هناك حاجة إلى أكثر من واحد) وتركيزه لكل نوع من الأنواع البكتيرية التي تم اختبارها.
8. لتحضير الحصص الفردية ، ارتد القفازات واعمل في خزانة أمان ميكروبيولوجية أو استخدم موقد بنسن. قد تتطلب وسائل الإعلام حضانة لفترات طويلة من الزمن والعقم له أهمية قصوى.
   1. لتحضير كميات من الوسط الصلب ، انقل 25 مل إلى أطباق بتري فردية مقاس 92/16 مم واتركها تتماسك. يوصى باستخدام ماصة بدلا من صب الألواح مباشرة لتقليل مخاطر التلوث. لا تفرط في تجفيف الأطباق.
   2. لتحضير كميات شبه سائلة، انقل 5 مل من الوسط إلى حاويات عالمية متعددة من البوليسترين سعة 30 مل باستخدام ماصة واتركها تتماسك.
9. استخدم الوسائط على الفور أو خزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل الاستخدام. تحقق من توصيات الشركة المصنعة قبل تخزين المضادات الحيوية التي تحتوي على المضادات الحيوية حيث قد ينخفض التركيز ، بسبب تدهور المركب بمرور الوقت.

2. عزل أشكال L من البول

ملاحظة: ارتد قفازات ومعطف مختبر أثناء الإجراءات المختبرية. اعمل في خزانة أمان ميكروبيولوجية أو استخدم موقد بنسن. ارتد جوجل السلامة أثناء الترشيح.

1. قبل ساعة واحدة على الأقل من الوصول المتوقع لعينات البول ، امسح منطقة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول وحدد العدد المطلوب من الكميات المتوسطة LM شبه السائلة.
   ملاحظة: سيتم استخدام تعليق الإشريكية القولونية ST144¹⁰ أشكال L المستحثة في المختبر في وسط LM السائل ، بدلا من عينات البول البشرية ، لإثبات البروتوكول.
2. امسح منطقة العمل مرة أخرى بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل معالجة العينات. على جانب واحد من المقعد ، ضع العدد المطلوب من مرشحات القطع 0.45 ميكرولتر ، و 20 مل من المحاقن والعديد من حاويات البوليسترين العالمية المعقمة 30 مل الفارغة التي تساوي عدد العينات. أضف العديد من المرشحات الاحتياطية بالإضافة إلى عدد عينات البول المتوقعة ، فقط في حالة الحاجة إلى أكثر من مرشح واحد لمعالجة بعض العينات. ضع الكميات المتوسطة LM وحاويات البوليسترين العالمية المعقمة سعة 30 مل في رف ثابت في منتصف المقعد. إذا كان سيتم إجراء الفحص المجهري بالتوازي ، فقم أيضا بإعداد شرائح مجهر زجاجي ، وأغطية 22 × 22 مم ، وماصات 2 ميكرولتر و 1 مل ، وأطراف معقمة 10 ميكرولتر و 1 مل ، وأنابيب معقمة 1.5 مل وتأكد من توفر جهاز طرد مركزي دقيق على مقاعد البدلاء.
3. نقل عينات البول من المتبرع إلى المختبر في أقرب وقت ممكن بعد التبرع ، لمنع التدهور المحتمل للبكتيريا على شكل حرف L في العينة.
4. ارتد القفازات والنظارات الواقية ، وأخرج عينات البول من كيس الأمان ، ورشها بالإيثانول ، وامسحها وضعها في الرف ، بالقرب من الكميات المتوسطة LM وحاويات البوليسترين الاحتياطية المعقمة سعة 30 مل. من هذه النقطة، قم بمعالجة عينة واحدة في كل مرة.
5. قم بفك الأغطية الموجودة على أنبوب يحتوي على وسيط LM وحاوية عالمية احتياطية من البوليسترين وأنبوب يحتوي على بول.
6. أخرج المحقنة من العبوة ، وقم بإزالة المكبس وضعها على يمينك.
7. اسحب ورق الأمان من الجزء الخلفي من عبوة الفلتر وقم بتوصيل المحقنة بإحكام بالفلتر (احتفظ بالفلتر متجها لأسفل في حامل البلاستيك الفردي للشركة المصنعة للتأكد من بقائه معقما).
8. العمل بسرعة ولكن بعناية ، قم بإزالة الغطاء والتخلص منه من أنبوب وسيط LM وضع الفلتر مع المحقنة أعلى الأنبوب.
9. قم بإزالة الغطاء من عينة البول واسكب برفق ~ 10 مل في المحقنة (سيتم ترشيح 2 مل فقط ولكن الحجم الزائد يمنع تناثره) ، مع التأكد من ترك أكثر من 1 مل للفحص المجهري. سيتم استخدام 0.5 مل فقط ، ولكن من غير العملي قياس مثل هذا الحجم بدقة أثناء الترشيح المسبق ، وبالتالي يتم الاحتفاظ بحجم فائض تقريبي.
10. ضع المكبس بعناية فائقة في الجزء الخلفي من المحقنة. يمكن الشعور بقدر صغير من المقاومة قبل وضع المكبس في وضع التشغيل الكامل ومن السهل انسكاب العينة بعد هذه النقطة. تدرب على استخدام الماء عدة مرات قبل معالجة عينات البول.
11. اضغط برفق على المكبس ومرر 2 مل من البول عبر الفلتر حتى تشعر بمقاومة متزايدة. احرص على عدم الضغط الشديد لمنع العينة من الانسكاب والفلتر من الانكسار. إذا كانت العينة كثيفة بشكل خاص وتولد الكثير من المقاومة ، فقم بتمرير العينة عبر مرشحات متعددة ، بدلا من إجبارها على المرور عبر مرشح واحد.
12. اضغط برفق على الفلتر على الأنبوب الذي يحتوي على وسائط LM لإخراج أي عينة مفلترة متبقية ، وارفع الفلتر والحقنة وضع الغطاء بسرعة من حاوية البوليسترين العالمية الاحتياطية سعة 30 مل على الأنبوب الذي يحتوي على وسط LM والبول المصفى ، مع التأكد من عدم لمس الجزء الداخلي من الأنبوب بحافة الغطاء. تخلص من الفلتر والحقنة وحاوية البوليسترين الاحتياطية بأمان.
13. احتضان العينات في وضع ثابت عند 30 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. سيسمح ذلك للأشكال L التي مرت عبر المرشح بتجديد جدرانها والبدء في النمو كبكتيريا محاطة بالجدران.
14. راقب العينات كل يوم بحثا عن دليل على النمو ، مع تثبيت الأنابيب التي تحتوي على عينات مفلترة مقابل مصدر ضوء. بالنسبة للعينات الإيجابية ، يظهر النمو عادة في غضون 3 إلى 7 أيام.
15. بمجرد اكتشاف النمو ، انقل العينة إلى خزانة أمان ميكروبيولوجية أو على مقربة من موقد بنسن. افتح العينة واغمسها بعناية في حلقة بلاستيكية سعة 5 ميكرولتر ، بهدف منطقة النمو ، ثم قم بربط العينات على وسط BHI الصلب القياسي بدون حماية بالتناضح ، بهدف الحصول على مستعمرات^{مفردة 22}.
16. في الوقت نفسه ، افحص كمية صغيرة من العينة ، جنبا إلى جنب مع جزء من الوسط شبه السائل (~ 5 ميكرولتر) ، مجهريا كما هو موضح في الخطوة 3. سيضمن نقل العينة إلى شريحة مجهرية مع الوسيط عدم انفجار أي أشكال L قد لا تزال موجودة في العينة ويمكن اكتشافها. ومع ذلك ، من المتوقع أن تكون غالبية البكتيريا في هذه المرحلة قد عادت إلى الأشكال المسورة وتظهر على شكل قضبان عادية أو المكورات.
17. احتضان العينات المخططة على ألواح BHI في وضع ثابت عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
18. افحص بحثا عن دليل على النمو ، واختر مستعمرة واحدة من كل لوحة باستخدام حلقة 5 ميكرولتر وقم بتلقيحها في 5 مل من BHI السائل. احتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع الرج.
19. استخدم المزارع الليلية لتحضير مخزون الجلسرين أو لعزل الحمض النووي لتحديد الأنواع باستخدام طريقة مفضلة (على سبيل المثال ، Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit).

3. فحص عينات البول لوجود أشكال L عن طريق الفحص المجهري الطور

1. ضع 0.5 مل المتبقية من عينة البول في أنبوب طرد مركزي دقيق وقم بالدوران عند 8,000 × جم لمدة دقيقة واحدة في جهاز طرد مركزي دقيق.
2. قم بإزالة المادة الطافية برفق ، تاركة وراءها ما يقرب من 20 ميكرولتر وأعد تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينة برفق 3 مرات لأعلى ولأسفل.
3. ضع 1 ميكرولتر على شريحة مجهر زجاجي وقم بتغطيتها بغطاء مقاس 22 × 22 مم (لفحص عينة 5 ميكرولتر (انظر الخطوة 2.16) استخدم غطاء مقاس 22 × 50 مم للتأكد من أن الغطاء سيلتصق جيدا بالشريحة). اضغط لأسفل على الغطاء برفق باستخدام وسادة من الصوف القطني المعقم لإنشاء ختم وللتحقق من أن زلة الغطاء غير قادرة على الحركة. تخلص من وسادة الصوف القطني.
4. افحص الشريحة باستخدام مجهر مجهز بهدف تباين طور 100x لوجود هياكل تشبه الشكل L (الشكل 3).
   ملاحظة: لتأكيد الأصل البكتيري للهياكل الشبيهة بالشكل L في عينات المرضى ، يوصى بفحص العينات عن طريق التهجين الفلوري في الموقع (FISH) باستخدام مجسات قليل النوكليوتيدات الخاصة بالتسلسلات البكتيرية^10،23.

4. تحريض أشكال L في المختبر

1. البكتيريا ذات الجدران الخطية المفضلة للمستعمرات المفردة²² على صفيحة تحتوي على وسط غير واقي من التناضح (على سبيل المثال BHI) وتحتضن ثابتة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
2. في اليوم التالي ، قم بإعداد وسيط LM واقي من التناضح ، يحتوي على عامل / عوامل محفزة للاختيار على شكل حرف L كما هو موضح في الخطوة 1. تحضير العدد المطلوب من اللوحات ذات الوسط الصلب.
3. باستخدام حلقة بلاستيكية معقمة سعة 5 ميكرولتر أو عود أسنان ، اختر كمية كبيرة (~ 4-5 مستعمرات بقيمة ) من لوحة BHI غير الواقية من التناضح المحتضنة في الليلة السابقة.
4. البكتيريا الخطية على لوحة LM باستخدام السطح المسطح للحلقة (بدلا من الحافة). قم بربط البكتيريا بحركة واحدة مستمرة على حافة اللوحة ، ثم أدر اللوحة 90 درجة. المس الحلقة على حافة الخط الأول وبحركة مستمرة ، انشر الخط على ربع من اللوحة ، وقم بتخفيف البكتيريا تدريجيا بخطوط متعددة متداخلة (يمكن استخدام اللوحة بأكملها إذا رغبت في ذلك. في حالة استخدام ربع فقط من اللوحة ، يمكن استخدام أرباع أخرى لتحريض متعددة).
   ملاحظة: يوضح الشكل 4 أ بشكل تخطيطي اتجاه الخطوط. الهدف هنا هو الحصول على منطقة نمو تحتوي على أكبر عدد ممكن من أشكال L النقية ، بدلا من مستعمرات مفردة. لهذا السبب ، ليست هناك حاجة لتغيير الحلقات بين الخطوط. قد يكون من الصعب جدا الحصول على مستعمرات مفردة من الأشكال L واستخدام عدد صغير جدا من البكتيريا يمكن أن يؤدي إلى عدم نمو شكل L على الإطلاق. من ناحية أخرى ، إذا تم استخدام عدد كبير جدا من البكتيريا المسورة للحث ، فلن تخضع جميع البكتيريا للتبديل وقد لا يزال بعضها يحتفظ بالجدار. يمكن عادة اكتشاف أفضل منطقة نمو على شكل حرف L في منتصف الخط.
5. ضع اللوحة في كيس بلاستيكي أو وعاء آخر لمنعها من الجفاف واحتضانها عند 30 درجة مئوية (قد تنمو الأشكال L لبعض الأنواع البكتيرية بشكل أفضل في الظروف اللاهوائية ، لذلك يمكن اختبار الغرفة اللاهوائية لنمو أكثر كفاءة على شكل حرف L). افحص اللوحة بحثا عن دليل على النمو كل يوم. يظهر هذا عادة في غضون 3 إلى 7 أيام. مقدار النمو خاص بالسلالة. يظهر مثال على نمو الشكل L في الشكل 4 ب.
6. تأكد من وجود أشكال L باستخدام المجهر. ضع قطرة 2 ميكرولتر من الوسط المحور المحور وراثيا على شريحة مجهرية ، وباستخدام طرف الماصة ، اختر كمية صغيرة من الخلايا من منتصف الخط وأعد تعليقها في القطرة.
   1. قم بتغطيتها بغطاء مقاس 22 × 22 مم وافحص وجود أشكال L باستخدام مجهر مع هدف تباين طور 100x. يمكن العثور على مثال تمثيلي في الشكل 4 ج.

النتائج

يمكن أن تخضع الوسائط على شكل حرف L التي تحتوي على السكروز لدرجات متفاوتة من الكراميل بعد التعقيم ، والتي ترتبط بتغير في اللون. يوضح الشكل 2 النتائج التمثيلية لوسائط التعقيم المحتوية على السكروز. يوضح الشكل 2 أ مثالا نموذجيا لوسط LM ، الذي تحول إلى اللون الكهرماني بعد التعقيم. يوضح الشكل 2 ب مثالا نموذجيا لمحلول السكروز 1.16 M (2 × التركيز المطلوب لصنع وسط LM) بعد التعقيم. في بعض الأحيان ، قد يخضع الوسط المحور وراثيا أو السكروز لكراميل واسع النطاق أثناء التعقيم ، ولا ينصح باستخدام الوسيط إذا حدث ذلك. يوضح الشكل 2 ج مثالا على وسط السكروز المفرط بالكراميل.

يمكن أن تكون البكتيريا على شكل حرف L غير متجانسة للغاية ، ويوضح الشكل 3 أمثلة على الهياكل الشبيهة بالشكل L التي يمكن ملاحظتها في عينات بول المريض. لتأكيد الأصل البكتيري للهياكل الشبيهة بالشكل L الموجودة في عينات البول ، يوصى باستخدام مجسات الفلورسنت التي تستهدف التسلسلات البكتيرية^10،23.

مستويات نمو أشكال L المستحثة في ظل ظروف المختبر هي سلالة محددة. يوضح الشكل 4 ب مثالا على نمو Bacillus subtilis L-form ويوضح الشكل 4 ج المظهر المجهري للأشكال L المستحثة في الشكل 4 ب.

الشكل 1: عزل الأشكال L باستخدام طريقة الترشيح - التمثيل التخطيطي. يتم تمرير عينة البول من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر إلى حاوية عالمية من البوليسترين ، تحتوي على وسط LM واقي من التناضح مكمل ب 0.2٪ أجار. ثم يتم تحضين العينة في وضع ثابت عند 30 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر ويتم فحصها بصريا يوميا بحثا عن دليل على النمو. تسمح فترة الحضانة هذه لأي أشكال L موجودة في العينة بتجديد جدرانها الخلوية. بمجرد اكتشاف النمو ، يمكن إعادة ربط البكتيريا على صفيحة تحتوي على وسط منتظم وصلب وغير وقائي للتناضح (مثل أجار المغذيات أو تسريب الدماغ والقلب) لعزل مستعمرات مفردة ، والتي يمكن بعد ذلك إخضاعها لاستخراج الحمض النووي وتسلسله لتحديد الأنواع البكتيرية المعزولة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: وسائط الشكل L. (أ) وسيط LM بعد التعقيم. (ب) 1.16 م من السكروز (تركيز 2 ×) بعد التعقيم. (ج) وسط LM بالكراميل على نطاق واسع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: أمثلة على الهياكل الشبيهة بالشكل L التي يمكن ملاحظتها في بول المرضى الذين يعانون من التهاب المسالك البولية المتكرر عن طريق الفحص المجهري المرحلي. (أ ، ب) الهياكل النموذجية لتقسيم أشكال L البكتيرية المعلقة في البول. (ج، د) الهياكل النموذجية لتقسيم الأشكال البكتيرية L المرتبطة بالخلايا حقيقية النواة. (ه، و) هيكل على شكل هلال مميز لأشكال L سالبة الجرام (السهم الأحمر). (إف ، ز) الهياكل النموذجية للمراحل الوسيطة من الانتقال بين الخلايا المسورة والأشكال L (السهم الأحمر في G). (ح) الحويصلات داخل الخلايا النموذجية للأشكال L الكبيرة. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من¹⁰. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تقنية لوحة الخط لتحريض الأشكال L على الوسائط الصلبة. (أ) التمثيل التخطيطي للبكتيريا المخططة باستخدام ربع صفيحة لتحريض الأشكال L. يشير السهم إلى اتجاه خط البكتيريا. (ب) مثال على نمو Bacillus subtilis على شكل L بعد الخطوط ، كما هو موضح في (A) ، بعد 3 أيام من الحضانة عند 30 درجة مئوية. (ج) أشكال L المستحثة في (B) يتم تصورها بواسطة الفحص المجهري للتباين الطوري. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. تم تعديل اللوحتين B و C من¹⁶ الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

تم استخدام البروتوكولات الموصوفة في هذه المخطوطة لعزل والتعامل مع أشكال L من أنواع بكتيرية مختلفة من بول الإنسان ، بما في ذلك الإشريكية القولونية ، والمكورات العقدية ، والمكورات العنقودية ، والكلابسيلا ، والسودوموناس ، والمكورات المعوية ، والمعويات ، وكلها ترتبط عادة بعدوى المسالك البولية^10،24. ومع ذلك ، فإن طرق التعامل مع الأشكال L ، التي تم إنشاؤها في مختبر واحد قد لا تعمل على الفور في مختبر آخر وما يصلح لسلالة بكتيرية قد لا تعمل مع سلالة بكتيرية أخرى. لذلك، من المحتمل أن تتطلب البروتوكولات الموضحة هنا محاولات متعددة وتحسينات إضافية. على وجه الخصوص ، قد يلزم اختبار متطلبات المغذيات وتوافر الأكسجين وتركيز الحماية من التناضح وسيولة الوسط. يمكن أن تختلف الظروف المثلى للانتقال والنمو على شكل حرف L عن الظروف المثلى لنمو الأشكال المسورة من نفس النوع. علاوة على ذلك ، يمكن مواجهة العديد من المشكلات الفنية عند محاولة البروتوكولات.

من المشاكل الشائعة المرتبطة بإعداد وسائط الشكل L كراميل السكروز بعد التعقيم. إذا تحول لون الوسط إلى اللون البني الداكن ، فيجب التخلص منه وإعداد دفعة جديدة. قد يكون من الضروري تحضير السكروز في الماء في زجاجة واحدة والمكونات المتبقية في زجاجة أخرى ، كلاهما بتركيز 2x. يمكن بعد ذلك الجمع بين المحاليل المركزة 2x بنسبة 1: 1 بعد التعقيم ، لتحقيق التركيزات النهائية المطلوبة. قد يتحول لون السكروز المعقم بشكل منفصل إلى اللون الأصفر قليلا (الشكل 2 ب) ، وهو أمر مقبول ، ولكن إذا تحول إلى اللون البني الداكن (الشكل 2 ج) ، فلا ينبغي استخدامه للتجارب. قد يكون ضبط طول ودرجة حرارة دورة التعقيم ضروريا للتخفيف من كراميل السكروز. يوصى باختبار عقم الوسائط المحضرة باستخدام دورة الأوتوكلاف المعدلة ، عن طريق احتضان حصة من كل وسائط لمدة 3 أيام على الأقل عند 37 درجة مئوية. أخيرا ، قد يكون من الضروري اختبار عامل وقائي بديل للتناضح ، مثل الملح ، إذا استمرت مشكلة الكراميل¹⁸.

قد تواجه أيضا العديد من المشكلات أثناء عزل أشكال L من عينات المرضى. كما هو مذكور في البروتوكول ، قد تتدهور أشكال L الموجودة في العينات. لذلك ، من المهم نقل العينات إلى المختبر في أسرع وقت ممكن بعد التبرع. للسبب نفسه ، لا ينصح بشدة بتخزين العينات في درجات حرارة منخفضة أو تعديل تكوين العينة (على سبيل المثال عن طريق إضافة PBS).

طريقة الترشيح نفسها لها حدودها. قد يتم تمزيق بعض أشكال L بسبب قوى القص الناتجة عن تدفق الوسائط عبر المرشح. في الدراسة التي أجراها Mickiewicz et al. ، مرت 41٪ فقط من أشكال L في عينات التحكم ، والتي تحتوي على أشكال الإشريكية القولونية المستحثة في المختبر ، عبر المرشح¹⁰. هذا يدل على أن طريقة الترشيح يمكن أن تؤدي إلى التقليل من عدد العينات الإيجابية ولا يوصى بها للدراسات الكمية.

في حالات نادرة جدا ، بعد الترشيح ، قد يكون من الممكن ملاحظة نمو كبير في اليوم التالي في حصص الوسائط شبه السائلة المستخدمة لعزل الشكل L. قد يكون هذا مؤشرا على أن المرشح قد انكسر أثناء البروتوكول ، مما سمح بمرور البكتيريا المحاطة بجدران ، أو أن العينة كانت ملوثة. من الممارسات الجيدة التخلص من هذه العينات أو على الأقل التعامل معها بحذر. يعد الفحص البصري اليومي للعينات أمرا بالغ الأهمية لمنع الإيجابيات الكاذبة. قبل معالجة عينات البول عن طريق الترشيح ، يوصى بتمرير عدة عينات من الأشكال L المستحثة في المختبر والبكتيريا المسورة والوسط المعقم من خلال المرشح المفضل ، للتحكم في كفاءة فصل الشكل L ، والمرور المحتمل للبكتيريا المسورة بسبب كسر المرشح وللتأكد من أن التقنية المعقمة المستخدمة تعمل بشكل جيد.

في حالات نادرة ، يمكن عزل الأشكال L المستقرة عن طريق الترشيح ، مع عدم وجود أشكال مسورة يمكن اكتشافها بواسطة الفحص المجهري. للحفاظ على البكتيريا القابلة للحياة على شكل حرف L ، يوصى بنقل العديد من "الحلقات الكاملة" من العينة إلى أنبوب يحتوي على وسط LM شبه سائل طازج أو إعادة الخطوط على وسط واقي من التناضح الصلب كل 3-7 أيام ، اعتمادا على كفاءة النمو. إذا لم تظهر أي أشكال مسورة بعد عدة ممرات ، فيمكن محاولة تجميد العينات في 40٪ من الجلسرين عند -80 درجة مئوية للحفاظ على العزلة ؛ ومع ذلك ، قد لا تتسامح بعض أشكال L مع مثل هذا الإجراء جيدا.

على الرغم من قيودها ، فإن طريقة الترشيح هي الطريقة الوحيدة المستخدمة حتى الآن لفصل الأشكال L عن الأشكال المسورة في عينات المرضى. يسمح بتحديد السلالات البكتيرية القادرة على تبديل الشكل L في الجسم الحي. هناك إمكانية لتطوير طريقة الترشيح وتكييفها لعزل أشكال L عن أنواع أخرى من العينات البشرية أو البيئية (على سبيل المثال الدم أو النباتات).

مع الأخذ في الاعتبار جميع الاعتبارات المذكورة أعلاه ، نوصي بالبروتوكولات الموضحة في هذه المخطوطة كنقطة انطلاق جيدة لتطوير بروتوكولات L-form مصممة خصيصا في المختبرات الفردية ، بدلا من كتعليمات صارمة. يتطلب العمل مع نماذج L عناية كبيرة وتفانيا وصبرا ولكن مع الممارسة ، يمكن أن يكون مجزيا للغاية. نأمل أن تصبح الإرشادات الموضحة في هذه المخطوطة معيارا لتطوير بروتوكولات L-form وستشجع المزيد من مجموعات البحث الأساسية والسريرية على التحقيق في هذه الأشكال البكتيرية الرائعة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µL cut off filters	Sarstedt	83.1826
20 mL syringes	Fisher	17955460
30 mL polystyrene universal tubes	Starlab	E1412-3010
92 x 16 mm Petri Dishes	Starstedt	82.1473
Agar	Oxoid	LP0011
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135
Cover slips (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)	VWR	631-0137/-0125
D-cycloserine	Sigma-Aldrich	C6880
Glass microscope slides	VWR	631-1550P
Lysostaphin	Sigma-Aldrich	L7386
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L4919
MgSO4	VWR	25165.26
Moenomycin	Sigma-Aldrich	32404
Penicillin G	Sigma-Aldrich	13752
Phosphomycin	Sigma-Aldrich	P5396
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100