Aislamiento de bacterias en forma L de la orina mediante el método de filtración

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para el aislamiento de bacterias en forma L de la orina, utilizando un método de filtración. También se describen métodos complementarios para la preparación del medio en forma de L, la observación de las formas en L mediante microscopía de contraste de fase y la inducción de formas en L en condiciones de laboratorio.

Resumen

Se cree que la transición de las bacterias al estado de forma L desempeña un posible papel en la evasión inmunitaria y la persistencia bacteriana durante el tratamiento con antibióticos dirigidos a la pared celular. Sin embargo, el aislamiento y la manipulación de las bacterias en forma de L es un desafío, principalmente debido a su alta sensibilidad a los cambios en la osmolaridad. Aquí, describimos protocolos detallados para la preparación del medio en forma de L, el aislamiento de las formas L de la orina mediante un método de filtración, la detección de formas L en muestras de orina mediante microscopía de contraste de fase y la inducción de formas L in vitro. Los requisitos exactos para la supervivencia y el crecimiento de las formas L pueden variar de una cepa a otra. Por lo tanto, los métodos presentados aquí están destinados a actuar como pautas básicas para establecer protocolos de forma L dentro de laboratorios individuales, en lugar de como instrucciones precisas. El método de filtración puede conducir a una reducción en el número de formas L en una muestra y no debe usarse para la cuantificación. Sin embargo, es el único método utilizado hasta ahora para la separación efectiva de las variantes deficientes en la pared celular de sus contrapartes con pared y para la identificación de cepas bacterianas, que son capaces de cambiar de forma L en pacientes con infecciones del tracto urinario. El método de filtración tiene el potencial de adaptarse para el aislamiento de formas L de pacientes con otras categorías de infecciones bacterianas y de muestras ambientales.

Introducción

Prácticamente todas las bacterias están rodeadas por una estructura llamada pared celular. La pared es importante para la protección contra el estrés ambiental, ayuda a la división regular y le^{da forma a} las bacterias. Sin embargo, la pared también es un objetivo para partes del sistema inmunológico y algunos de los mejores y más utilizados antibióticos, incluida la penicilina ^2,3. A pesar de su importancia, tanto las bacterias Gram-positivas como las Gram-negativas pueden sobrevivir ocasionalmente sin la pared 4,5,6,7,8. Si las condiciones circundantes proporcionan suficiente osmorprotección para evitar que exploten y también están presentes agentes dirigidos a la pared celular, las bacterias pueden pasar a un estado sin pared, conocido como forma de L 4,5,6,7,8.

Numerosos informes indican que el cambio a un estado de forma L y de vuelta a un estado amurallado puede ser importante in vivo como mecanismo para que las bacterias sobrevivan tanto al ataque del sistema inmunitario del huésped como al tratamiento con antibióticos dirigidos a la pared celular 9,10,11,12,13,14,15. Tal transición potencialmente proporciona una estrategia poderosa para la recurrencia de la infección bacteriana 9,10,11,12,13,14,15. Comprender la biología básica de las bacterias en forma de L y sus interacciones con el huésped es fundamental para descifrar su papel en la patogénesis. Sin embargo, el manejo de bacterias en forma de L es un desafío.

En primer lugar, debido a la falta de pared celular, las bacterias en forma de L son propensas a estallar en respuesta a cambios en la osmolaridad. Además, las formas L se dividen de manera muy irregular, tienen patrones de crecimiento impredecibles (generalmente mucho más lentos que sus contrapartes con paredes) y, dependiendo de la cepa, pueden propagarse mejor en medios semilíquidos, en lugar de sólidos o líquidos. Todas las consideraciones anteriores dificultan la cuantificación y las comparaciones de las tasas de crecimiento. Diferentes especies bacterianas (o incluso cepas) tienen diversos requisitos metabólicos para el cambio y crecimiento de la forma L. Por ejemplo, las formas L de ciertas bacterias Gram-positivas, que dependen de la respiración aeróbica, son más sensibles a las especies^{reactivas de} oxígeno que sus contrapartes amuralladas.

La inducción de formas L en condiciones de laboratorio y en el huésped suele estar impulsada por agentes dirigidos a la pared celular, como los antibióticos y la lisozima⁹. Un tratamiento de este tipo podría resultar en una pérdida parcial de la pared celular y, por lo tanto, algunas bacterias con paredes (o parcialmente paredes) podrían estar presentes en las muestras, lo que dificulta distinguir si los resultados experimentales observados se deben a la presencia de formas L o formas de bacterias con paredes. La frecuencia de formas L inducidas in vivo tiende a ser baja, lo que significa que pueden ser difíciles de encontrar y aislar. Finalmente, debido a su morfología polimórfica, las formas L pueden confundirse fácilmente in situ con estructuras de origen eucariota, como cuerpos apoptóticos o diversos gránulos.

Desde su descubrimiento en 1935¹⁷, se han desarrollado varios métodos para manejar las formas L en el laboratorio. La mayoría de estos se basan en la adición de un agente osmoprotector al medio de crecimiento; generalmente un azúcar o una sal 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Como se mencionó anteriormente, las formas L a menudo ocurren al lado de las bacterias con paredes en las muestras de pacientes y separar las dos poblaciones puede ser difícil. Sin embargo, se ha demostrado que, a diferencia de las bacterias amuralladas, las formas L pueden pasar a través de un filtro de 0,45 μm debido a su flexibilidad y tamaños variables. Se ha empleado un método que utiliza un filtro de este tipo para aislar las formas L de la orina 10,19,20,21.

En este trabajo se presenta un protocolo para el aislamiento de bacterias en forma L de la orina, utilizando un método de filtración (Figura 1). También se describen protocolos complementarios para la preparación de medio en forma L, la observación microscópica de formas L y la inducción de formas L in vitro.

Protocolo

1. Preparación del medio en forma de L (LM)

1. Pesar sacarosa (cantidad ajustada para lograr una concentración final de 0,58 M), MgSO₄ (concentración final 8 mM) e Infusión Cerebro-Corazón (BHI) (cantidad recomendada por el proveedor) en una botella de vidrio dos veces el tamaño del volumen deseado de medio. Para preparar 0,5 L del medio, pese 100 g de sacarosa, 1 g de_MgSO4 y 18,5 g de BHI y colóquelo en una botella de vidrio de 1 L. Esto permitirá una resuspensión más fácil de los ingredientes antes de esterilizarlos en autoclave.
2. Si se requieren medios sólidos o semisólidos, agregue la cantidad deseada de agar. Para medios sólidos, agregue 5 g de agar para lograr una concentración final del 1% en 0,5 L de medio. Para medios semisólidos, agregue 1 g de agar para lograr una concentración final de 0,2% en 0,5 L de medio.
3. Rellene con agua desionizada (DI) hasta el volumen final deseado.
4. Cierre la botella y mezcle bien agitando. No es necesario volver a suspender los ingredientes por completo, solo asegúrese de que no estén agrupados en el fondo de la botella. Afloje la tapa y el autoclave en un ciclo de medios sensibles (115 °C durante 15 min). Se recomienda mezclar los ingredientes antes de esterilizar en autoclave y utilizar un ciclo de medios sensibles para evitar la aglomeración de los ingredientes y la caramelización de la sacarosa.
5. Examine visualmente el medio después del autoclave. No debe haber grumos y el medio debe ser de color ámbar (Figura 2A).
6. Después del autoclave, deje que el medio se enfríe a una temperatura que permita sostener cómodamente la botella con la mano.
7. Si el medio es necesario para la inducción de formas L, añadir un antibiótico y/o un agente lítico en este punto (por ejemplo, fosfomicina a una concentración final de 400 μg/mL, penicilina G a 200 μg/mL, D-cicloserina a 400 μg/mL, ampicilina a 100 μg/mL, moenomicina a 50 μg/mL, lisozima a 100 μg/mL o lisostafina a 5 μg/mL). Establecer empíricamente el tipo de agente inductor de la forma L (o agentes si se requiere más de uno) y su concentración para cada una de las especies bacterianas ensayadas.
8. Para preparar alícuotas individuales, use guantes y trabaje en un gabinete de seguridad microbiológica o use un mechero Bunsen. Los medios pueden requerir incubación durante períodos prolongados de tiempo y la esterilidad es de suma importancia.
   1. Para preparar alícuotas de medio sólido, transfiera 25 mL a placas de Petri individuales de 92/16 mm y déjelas reposar. Se recomienda utilizar una pipeta en lugar de verter placas directamente para reducir el riesgo de contaminación. No seque demasiado las placas.
   2. Para preparar alícuotas semilíquidas, transfiera 5 mL de medio a varios recipientes universales de poliestireno de 30 mL con una pipeta y déjelos reposar.
9. Utilice el medio inmediatamente o guárdelo a 4 °C hasta una semana antes de usarlo. Consulte las recomendaciones del fabricante antes de almacenar un medio que contenga antibióticos, ya que la concentración podría disminuir debido a que el compuesto se degrada con el tiempo.

2. Aislamiento de las formas L de la orina

NOTA: Use guantes y una bata de laboratorio durante los procedimientos de laboratorio. Trabaje en un gabinete de seguridad microbiológica o use un mechero Bunsen. Use gafas de seguridad durante la filtración.

1. Al menos 1 h antes de la llegada prevista de las muestras de orina, limpie el área de trabajo con etanol al 70% y establezca el número requerido de alícuotas de medio LM semilíquido.
   NOTA: Se utilizará una suspensión de E. coli ST144¹⁰ formas L inducida en el laboratorio en medio LM líquido, en lugar de muestras de orina humana, para demostrar el protocolo.
2. Limpie nuevamente el área de trabajo con etanol al 70% antes de procesar las muestras. A un lado del banco, coloque el número deseado de filtros de corte de 0,45 μL, jeringas de 20 ml y varios recipientes universales de poliestireno estériles de 30 ml vacíos igual al número de muestras. Agregue varios filtros de repuesto además del número de muestras de orina esperadas, en caso de que se necesite más de un filtro para procesar algunas de las muestras. Coloque las alícuotas del medio LM y los envases universales estériles vacíos de poliestireno de 30 ml en una rejilla estable en el centro del banco. Si el examen microscópico se va a realizar en paralelo, prepare también portaobjetos de microscopio de vidrio, cubreobjetos de 22 x 22 mm, pipetas de 2 μL y 1 mL, puntas estériles de 10 μL y 1 mL, tubos estériles de 1,5 mL y asegúrese de que se dispone de una microcentrífuga de banco.
3. Transportar las muestras de orina del donante al laboratorio tan pronto como sea posible después de la donación, para evitar el posible deterioro de las bacterias en forma L en la muestra.
4. Póngase guantes y gafas, saque las muestras de orina de la bolsa de seguridad, rocíelas con etanol, limpie y colóquelas en el estante, cerca de las alícuotas del medio LM y de los recipientes estériles de poliestireno de repuesto de 30 mL. A partir de este punto, procese una muestra a la vez.
5. Afloje las tapas de un tubo que contenga medio LM, un recipiente universal de poliestireno de repuesto y un tubo que contenga orina.
6. Retire la jeringa del paquete, retire el émbolo y colóquelo a su derecha.
7. Tire del papel de seguridad de la parte posterior del paquete del filtro y fije la jeringa firmemente al filtro (mantenga el filtro boca abajo en el soporte de plástico del fabricante individual para asegurarse de que permanezca estéril).
8. Trabajando rápido pero con cuidado, retire y deseche la tapa del tubo de medio LM y coloque el filtro con la jeringa en la parte superior del tubo.
9. Retire la tapa de la muestra de orina y vierta suavemente ~ 10 ml en la jeringa (solo se filtrarán 2 ml, pero el exceso de volumen evita salpicaduras), asegurándose de que quede más de 1 ml para un examen microscópico. Solo se utilizarán 0,5 mL, pero no es práctico medir con precisión dicho volumen mientras se realiza la filtración, por lo que se retiene un volumen excesivo aproximado.
10. Coloque con mucho cuidado el émbolo en la parte posterior de la jeringa. Se puede sentir una pequeña cantidad de resistencia antes de que el émbolo se coloque en una posición completamente operativa y es fácil derramar la muestra más allá de este punto. Practique varias veces el uso de agua antes de procesar muestras de orina.
11. Presione suavemente el émbolo y pase 2 mL de orina a través del filtro hasta que se sienta una resistencia creciente. Tenga cuidado de no aplicar demasiada presión para evitar que la muestra se derrame y el filtro se rompa. Si la muestra es particularmente densa y genera demasiada resistencia, pase la muestra a través de varios filtros, en lugar de forzarla a través de uno.
12. Golpee suavemente el filtro contra el tubo que contiene el medio LM para desalojar cualquier muestra filtrada restante, levante el filtro y la jeringa y coloque rápidamente la tapa del recipiente universal de poliestireno de repuesto de 30 ml en el tubo que contiene el medio LM y la orina filtrada, asegurándose de no tocar el interior del tubo con el borde de la tapa. Deseche de forma segura el filtro, la jeringa y el recipiente de poliestireno de repuesto.
13. Incubar las muestras en posición estacionaria a 30 °C durante un máximo de 1 mes. Esto permitirá que las formas L que pasaron a través del filtro regeneren sus paredes y comiencen a crecer como bacterias amuralladas.
14. Observe las muestras todos los días en busca de evidencia de crecimiento, sosteniendo los tubos que contienen muestras filtradas contra una fuente de luz. En el caso de las muestras positivas, el crecimiento suele aparecer en un plazo de 3 a 7 días.
15. Una vez que se haya detectado el crecimiento, transfiera la muestra a una cabina de seguridad microbiológica o cerca de un mechero Bunsen. Abra la muestra y sumérjala cuidadosamente en un circuito de plástico de 5 μL, apuntando al área de crecimiento, y luego raye las muestras en un medio BHI sólido estándar sin osmoprotección, con el objetivo de obtener colonias individuales²².
16. Al mismo tiempo, examine una pequeña cantidad de la muestra, junto con una fracción de medio semilíquido (~5 μL), microscópicamente como se describe en el paso 3. La transferencia de la muestra a un portaobjetos microscópico junto con el medio asegurará que las formas L que aún puedan estar presentes en la muestra no reventen y puedan ser detectadas. Sin embargo, se espera que la mayoría de las bacterias en este punto hayan vuelto a formas amuralladas y aparezcan como bastones o cocos regulares.
17. Incubar las muestras rayadas en las placas BHI en posición estacionaria a 37 °C durante la noche.
18. Examine en busca de evidencia de crecimiento, elija una sola colonia de cada placa con un asa de 5 μL e inocule en 5 mL de IHI líquido. Incubar a 37 °C durante la noche, agitando.
19. Utilice los cultivos nocturnos para preparar reservas de glicerol o para aislar el ADN para la identificación de especies utilizando un método preferido (por ejemplo, Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit).

3. Examen de muestras de orina para detectar la presencia de formas L mediante microscopía de contraste de fase

1. Coloque los 0,5 ml restantes de muestra de orina en un tubo de microcentrífuga y centrifuga a 8.000 x g durante 1 min en una microcentrífuga de banco.
2. Retire suavemente el sobrenadante, dejando aproximadamente 20 μL y vuelva a suspender el pellet pipeteando suavemente 3 veces hacia arriba y hacia abajo.
3. Coloque 1 μL en un portaobjetos de microscopio de vidrio y cúbralo con un cubreobjetos de 22 x 22 mm (para examinar una muestra de 5 μL (consulte el paso 2.16) use un cubreobjetos de 22 x 50 mm para asegurarse de que el cubreobjetos se adhiera bien al portaobjetos). Presione suavemente el cubreobjetos con un algodón estéril para crear un sello y comprobar que el cubreobjetos no puede moverse. Deseche la almohadilla de algodón.
4. Examine el portaobjetos utilizando un microscopio equipado con un objetivo de contraste de fase de 100x para detectar la presencia de estructuras similares a la forma de L (Figura 3).
   NOTA: Para confirmar el origen bacteriano de las estructuras similares a la forma L en las muestras de los pacientes, se recomienda examinar las muestras mediante hibridación fluorescente in situ (FISH) utilizando sondas de oligonucleótidos específicas para secuencias bacterianas^10,23.

4. Inducción de formas L in vitro

1. Las bacterias de paredes estriadas de elección para colonias individuales²² en una placa que contenga medio no osmoprotector (por ejemplo, BHI) e incuben inmóviles a 37 °C durante la noche.
2. Al día siguiente, prepare un medio osmoprotector LM, que contenga agente/s inductor en forma L de elección como se describe en el paso 1. Prepare el número deseado de platos con medio sólido.
3. Usando un asa de plástico estéril de 5 μL o un palillo de dientes, elija una cantidad generosa (~ 4-5 colonias) de la placa BHI no osmoprotectora incubada la noche anterior.
4. Raye las bacterias en la placa LM usando la superficie plana del bucle (en lugar del borde). Raye las bacterias con un movimiento continuo en el borde de la placa, luego gire la placa 90°. Toque el bucle hasta el borde de la primera raya y, con un movimiento continuo, extienda la raya sobre un cuadrante de la placa, diluyendo gradualmente las bacterias con múltiples rayas superpuestas (se puede usar toda la placa si se desea. Si se usa solo un cuadrante de la placa, se pueden usar otros cuadrantes para múltiples inducciones).
   NOTA: La Figura 4A muestra esquemáticamente la dirección de las rayas. El objetivo aquí es obtener un área de crecimiento que contenga tantas formas L puras como sea posible, en lugar de colonias individuales. Por esa razón, no es necesario cambiar los bucles entre rayas. Las colonias individuales de formas L pueden ser muy difíciles de obtener y el uso de un número demasiado pequeño de bacterias podría resultar en ningún crecimiento de la forma L. Por otro lado, si se han utilizado demasiadas bacterias con paredes para la inducción, no todas las bacterias se someterán al cambio y algunas aún pueden retener la pared. La mejor área de crecimiento en forma de L generalmente se puede detectar en el medio de la raya.
5. Coloque la placa en una bolsa de plástico u otro recipiente para evitar que se seque e incube a 30 °C (las formas L de algunas especies bacterianas pueden crecer mejor en condiciones anaeróbicas, por lo que se puede probar una cámara anaeróbica para un crecimiento más eficiente de las formas L). Examine la placa en busca de evidencia de crecimiento todos los días. Esto suele aparecer en un plazo de 3 a 7 días. La cantidad de crecimiento es específica de la cepa. En la Figura 4B se muestra un ejemplo de crecimiento en forma de L.
6. Confirme la presencia de formas L con un microscopio. Coloque una gota de 2 μL de medio LM en un portaobjetos microscópico y, con la punta de una pipeta, recoja una pequeña cantidad de células del centro de la raya y vuelva a suspenderlas en la gota.
   1. Cubra con un cubreobjetos de 22 x 22 mm y examine la presencia de formas L con un microscopio con un objetivo de contraste de fase de 100x. Un ejemplo representativo se puede encontrar en la Figura 4C.

Resultados

Los medios en forma de L que contienen sacarosa pueden sufrir diversos grados de caramelización después del autoclave, que se asocian con un cambio de color. La Figura 2 muestra los resultados representativos de los medios de autoclave que contienen sacarosa. La Figura 2A muestra un ejemplo típico de medio LM, que se ha vuelto de color ámbar después del autoclave. La Figura 2B muestra un ejemplo típico de solución de sacarosa 1,16 M (2 veces la concentración requerida para hacer el medio LM) después del autoclave. Ocasionalmente, el medio LM o la sacarosa pueden sufrir una caramelización extensa durante el autoclave, y no se recomienda usar el medio si esto sucede. La Figura 2C muestra un ejemplo de medio de sacarosa sobre-caramelizado.

Las bacterias en forma de L pueden ser muy heterogéneas y en la Figura 3 se muestran ejemplos de estructuras similares a las de forma L observables en muestras de orina de pacientes. Para confirmar el origen bacteriano de las estructuras en forma de L que se encuentran en las muestras de orina, se recomienda la FISH con sondas fluorescentes dirigidas a las secuencias bacterianas^10,23.

Los niveles de crecimiento de las formas L inducidos en condiciones de laboratorio son específicos de la cepa. La Figura 4B muestra un ejemplo de crecimiento de la forma L de Bacillus subtilis y la Figura 4C muestra la apariencia microscópica de las formas L inducidas en la Figura 4B.

Figura 1: Aislamiento de formas L mediante el método de filtración: representación esquemática. La muestra de orina se pasa a través de un filtro de 0,45 μm a un recipiente universal de poliestireno, que contiene medio LM osmoprotector suplementado con agar al 0,2%. A continuación, la muestra se incuba en una posición estacionaria a 30 °C durante un máximo de un mes y se comprueba visualmente diariamente para detectar signos de crecimiento. Este período de incubación permite que las formas L que estén presentes en la muestra regeneren sus paredes celulares. Una vez que se detecta el crecimiento, las bacterias se pueden volver a colocar en una placa que contenga un medio regular, sólido y no osmoprotector (como agar nutriente o infusión cerebro-corazón) para aislar colonias individuales, que luego se pueden someter a extracción y secuenciación de ADN para identificar las especies bacterianas aisladas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Medios en forma de L. (A) Medio LM después del autoclave. (B) 1,16 M de sacarosa (2 x concentración) después de la esterilización en autoclave. (C) Medio LM ampliamente caramelizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ejemplos de estructuras similares a la forma L observables en la orina de pacientes con ITU recurrente mediante microscopía de contraste de fase. (A,B) Estructuras típicas de las formas L bacterianas en división suspendidas en la orina. (C,D) Estructuras típicas de las formas L bacterianas en división asociadas a las células eucariotas. (E,F) Estructura en forma de media luna característica de las formas L gramnegativas (flecha roja). (F,G) Estructuras típicas de las etapas intermedias de transición entre las células amuralladas y las formas L (flecha roja en G). (H) Vesículas intracelulares típicas de las formas L grandes. Barra de escala = 5 μm. Esta cifra ha sido modificada de¹⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Técnica de placa estriada para la inducción de formas L en medios sólidos. (A) Representación esquemática de bacterias rayadas utilizando un cuarto de placa para la inducción de formas L. La flecha indica la dirección en la que se deben rayar las bacterias. (B) Un ejemplo de crecimiento de la forma L de Bacillus subtilis después de la formación de estrías, como se muestra en (A), después de 3 días de incubación a 30 °C. (C) Las formas L inducidas en (B) se visualizan mediante microscopía de contraste de fase. Barra de escala = 5 μm. Los paneles B y C han sido modificados de¹⁶ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los protocolos descritos en este manuscrito se han utilizado para aislar y manipular formas L de varias especies bacterianas de la orina humana, incluyendo E. coli, Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterococcus y Enterobacter spp, todas ellas típicamente asociadas a las infecciones urinarias^10,24. Sin embargo, los métodos para manejar las formas L, establecidos en un laboratorio, pueden no funcionar inmediatamente en otro y lo que funciona para una cepa bacteriana puede no funcionar para otra. Por lo tanto, es probable que los protocolos descritos aquí requieran varios intentos y optimización adicional. En particular, puede ser necesario analizar los requisitos de nutrientes, la disponibilidad de oxígeno, la concentración de osmoprotectores y la fluidez del medio. Las condiciones óptimas para la transición y el crecimiento de la forma L podrían ser diferentes de las condiciones óptimas para el crecimiento de las formas amuralladas de la misma especie. Además, se pueden encontrar varios problemas técnicos al intentar los protocolos.

Un problema común asociado con la preparación de medios en forma de L es la caramelización de la sacarosa después del autoclave. Si el medio se vuelve de color marrón oscuro, debe desecharse y se debe preparar un lote nuevo. Puede ser necesario preparar la sacarosa en agua en una botella y el resto de los ingredientes en otra, ambos a una concentración 2x. A continuación, se pueden combinar soluciones concentradas 2x en una proporción de 1:1 después del autoclave, para lograr las concentraciones finales deseadas. La sacarosa esterilizada en autoclave por separado puede volverse de color ligeramente amarillo (Figura 2B), lo cual es aceptable, pero si se vuelve marrón oscuro (Figura 2C), no debe usarse para experimentos. Puede ser necesario ajustar la longitud y la temperatura del ciclo de esterilización en autoclave para aliviar la caramelización de la sacarosa. Se recomienda probar la esterilidad de los medios preparados mediante un ciclo de autoclave ajustado, incubando una alícuota de cada uno de los medios durante al menos 3 días a 37 °C. Por último, podría ser necesario probar un agente osmoprotector alternativo, como la sal, si el problema de la caramelización persiste¹⁸.

También se pueden encontrar varios problemas durante el aislamiento de las formas L de las muestras de los pacientes. Como se menciona en el protocolo, las formas L presentes en las muestras podrían deteriorarse; Por lo tanto, es importante transportar las muestras al laboratorio lo antes posible después de la donación. Por la misma razón, se desaconseja encarecidamente el almacenamiento de muestras a bajas temperaturas o la modificación de la composición de la muestra (por ejemplo, mediante la adición de PBS).

El método de filtración en sí tiene sus limitaciones. Algunas formas en L pueden romperse debido a las fuerzas de cizallamiento generadas por el flujo de medios a través del filtro. En el estudio de Mickiewicz et al., solo el 41% de las formas L en las muestras de control, que contenían formas L de E. coli inducidas en laboratorio, pasaron a través del filtro¹⁰. Esto demuestra que el método de filtración puede llevar a una subestimación del número de muestras positivas y no se recomienda para estudios cuantitativos.

En muy raras ocasiones, después de la filtración, puede observarse un crecimiento significativo al día siguiente en las alícuotas de medios semilíquidos utilizados para el aislamiento en forma de L. Esto podría ser una indicación de que el filtro se rompió durante el protocolo, permitiendo el paso de bacterias amuralladas, o que la muestra estaba contaminada. Es una buena práctica desechar dichas muestras o al menos tratarlas con precaución. El examen visual diario de las muestras es fundamental para evitar falsos positivos. Antes de procesar muestras de orina por filtración, se recomienda pasar varias muestras de formas L inducidas en laboratorio, bacterias con paredes y medio estéril a través del filtro de elección, para controlar la eficiencia de la separación de formas L, el posible paso de bacterias con paredes debido a la rotura del filtro y para asegurarse de que la técnica estéril utilizada esté funcionando bien.

En casos raros, las formas L estables pueden aislarse por filtración, sin formas de pared detectables por microscopía. Para mantener las bacterias viables en forma L, se recomienda transferir varios "bucles llenos" de la muestra a un tubo que contenga medio LM semilíquido fresco o volver a rayar en medio osmoprotector sólido cada 3-7 días, dependiendo de la eficiencia del crecimiento. Si no aparecen formas amuralladas después de varios pasos, se puede intentar congelar muestras en glicerol al 40% a –80 °C para preservar el aislado; sin embargo, es posible que algunas formas L no toleren bien este procedimiento.

A pesar de sus limitaciones, el método de filtración es el único utilizado hasta ahora para la separación de las formas L de las formas murales en muestras de pacientes. Permite la identificación de cepas bacterianas capaces de cambiar de forma L in vivo. Existe el potencial de desarrollar y adaptar el método de filtración para el aislamiento de formas L de otros tipos de muestras humanas o ambientales (por ejemplo, sangre o plantas).

Teniendo en cuenta todas las consideraciones anteriores, recomendamos los protocolos descritos en este manuscrito como un buen punto de partida para desarrollar protocolos personalizados en forma de L en laboratorios individuales, en lugar de como instrucciones rígidas. Trabajar con formas L requiere mucho cuidado, dedicación y paciencia, pero con práctica, puede ser extremadamente gratificante. Esperamos que las directrices descritas en este manuscrito se conviertan en un punto de referencia para el desarrollo de protocolos de formas L y animen a más grupos de investigación básica y clínica a investigar estas fascinantes formas bacterianas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µL cut off filters	Sarstedt	83.1826
20 mL syringes	Fisher	17955460
30 mL polystyrene universal tubes	Starlab	E1412-3010
92 x 16 mm Petri Dishes	Starstedt	82.1473
Agar	Oxoid	LP0011
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135
Cover slips (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)	VWR	631-0137/-0125
D-cycloserine	Sigma-Aldrich	C6880
Glass microscope slides	VWR	631-1550P
Lysostaphin	Sigma-Aldrich	L7386
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L4919
MgSO4	VWR	25165.26
Moenomycin	Sigma-Aldrich	32404
Penicillin G	Sigma-Aldrich	13752
Phosphomycin	Sigma-Aldrich	P5396
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100