Isolamento dei batteri a forma di L dalle urine utilizzando il metodo di filtrazione

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento dei batteri in forma L dalle urine, utilizzando un metodo di filtrazione. Vengono inoltre descritti metodi complementari per la preparazione di terreni a forma di L, l'osservazione di forme a L mediante microscopia a contrasto di fase e l'induzione di forme a L in condizioni di laboratorio.

Abstract

Si ritiene che la transizione dei batteri allo stato di forma L svolga un possibile ruolo nell'evasione immunitaria e nella persistenza batterica durante il trattamento con antibiotici mirati alla parete cellulare. Tuttavia, l'isolamento e la manipolazione dei batteri in forma L sono impegnativi, principalmente a causa della loro elevata sensibilità ai cambiamenti di osmolarità. Qui descriviamo protocolli dettagliati per la preparazione del terreno di coltura a forma di L, l'isolamento delle forme L dalle urine utilizzando un metodo di filtrazione, il rilevamento delle forme L nei campioni di urina mediante microscopia a contrasto di fase e l'induzione di forme L in vitro. I requisiti esatti per la sopravvivenza e la crescita delle forme L possono variare da ceppo a ceppo. Pertanto, i metodi qui presentati sono intesi come linee guida di base per stabilire protocolli di forma a L all'interno dei singoli laboratori, piuttosto che come istruzioni precise. Il metodo di filtrazione può portare a una riduzione del numero di forme L in un campione e non deve essere utilizzato per la quantificazione. Tuttavia, è l'unico metodo utilizzato finora per separare efficacemente le varianti carenti di parete cellulare dalle loro controparti murate e per l'identificazione di ceppi batterici, che sono in grado di cambiare la forma L nei pazienti con infezioni del tratto urinario. Il metodo di filtrazione ha il potenziale per essere adattato per l'isolamento di forme L da pazienti con altre categorie di infezioni batteriche e da campioni ambientali.

Introduzione

Praticamente tutti i batteri sono circondati da una struttura chiamata parete cellulare. La parete è importante per la protezione contro le sollecitazioni ambientali, aiuta la divisione regolare e dà ai batteri la loro forma¹. Tuttavia, il muro è anche un bersaglio per parti del sistema immunitario e alcuni degli antibiotici migliori e più utilizzati, tra cui la penicillina ^2,3. Nonostante la sua importanza, sia i batteri Gram-positivi che quelli Gram-negativi possono occasionalmente sopravvivere senza la parete 4,5,6,7,8. Se le condizioni circostanti forniscono un'osmoprotezione sufficiente per impedirne lo scoppio e sono presenti anche agenti mirati alla parete cellulare, i batteri possono passare a uno stato senza parete, indicato come forma L 4,5,6,7,8.

Numerosi rapporti indicano che il passaggio a uno stato di forma L e di nuovo a uno stato murato può essere importante in vivo come meccanismo per i batteri di sopravvivere sia all'attacco del sistema immunitario dell'ospite che al trattamento con antibiotici mirati alla parete cellulare 9,10,11,12,13,14,15. Tale transizione fornisce potenzialmente una potente strategia per la ricorrenza dell'infezione batterica 9,10,11,12,13,14,15. Comprendere la biologia di base dei batteri a forma di L e le loro interazioni con l'ospite è fondamentale per decifrare il loro ruolo nella patogenesi. Tuttavia, la gestione dei batteri a forma di L è impegnativa.

In primo luogo, a causa della mancanza della parete cellulare, i batteri a forma di L sono inclini a scoppiare in risposta ai cambiamenti nell'osmolarità. Inoltre, le forme a L si dividono in modo altamente irregolare, hanno modelli di crescita imprevedibili (di solito molto più lenti rispetto alle loro controparti murate) e, a seconda del ceppo, possono propagarsi meglio su mezzi semiliquidi, piuttosto che solidi o liquidi. Tutte le considerazioni di cui sopra rendono difficile la quantificazione e il confronto dei tassi di crescita. Diverse specie batteriche (o anche ceppi) hanno requisiti metabolici diversi per il cambio e la crescita della forma L. Ad esempio, le forme L di alcuni batteri Gram-positivi, che si basano sulla respirazione aerobica, sono più sensibili alle specie reattive dell'ossigeno rispetto alle loro controparti murate¹⁶.

L'induzione di forme L in condizioni di laboratorio e nell'ospite è solitamente guidata da agenti mirati alla parete cellulare, come gli antibiotici e il lisozima⁹. Un tale trattamento potrebbe comportare solo una perdita parziale della parete cellulare e quindi alcuni batteri walled (o parzialmente walled) potrebbero essere presenti nei campioni, rendendo difficile distinguere se i risultati sperimentali osservati sono dovuti alla presenza di forme L o forme di batteri walled. La frequenza delle forme L indotte in vivo tende ad essere bassa, il che significa che possono essere difficili da trovare e isolare. Infine, a causa della loro morfologia polimorfica, le forme L possono essere facilmente confuse in situ con strutture di origine eucariotica, come corpi apoptotici o granuli vari.

Dalla loro scoperta nel 1935¹⁷, sono stati sviluppati diversi metodi per gestire le forme L in laboratorio. La maggior parte di questi si basa sull'aggiunta di un agente osmoprotettivo al terreno di coltura; di solito uno zucchero o un sale 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Come accennato in precedenza, le forme a L si verificano spesso fianco a fianco con batteri murati nei campioni dei pazienti e separare le due popolazioni può essere difficile. Tuttavia, è stato dimostrato che, a differenza dei batteri walled, le forme L possono passare attraverso un filtro da 0,45 μm grazie alla loro flessibilità e alle dimensioni variabili. Un metodo che utilizza un tale filtro è stato impiegato per isolare le forme L dalle urine 10,19,20,21.

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento dei batteri in forma L dalle urine, utilizzando un metodo di filtrazione (Figura 1). Vengono inoltre descritti protocolli complementari per la preparazione di terreni a forma di L, l'osservazione microscopica di forme a L e l'induzione di forme a L in vitro.

Protocollo

1. Preparazione del terreno a forma di L (LM)

1. Pesare il saccarosio (quantità regolata per raggiungere una concentrazione finale di 0,58 M), MgSO₄ (concentrazione finale 8 mM) e Brain Heart Infusion (BHI) (quantità consigliata dal fornitore) in un flacone di vetro di dimensioni doppie rispetto al volume di terreno desiderato. Per preparare 0,5 L di terreno, pesare 100 g di saccarosio, 1 g di MgSO₄ e 18,5 g di BHI e metterli in una bottiglia di vetro da 1 L. Ciò consentirà una più facile risospensione degli ingredienti prima della sterilizzazione in autoclave.
2. Se sono necessari terreni solidi o semisolidi, aggiungere la quantità desiderata di agar. Per i terreni solidi, aggiungere 5 g di agar per ottenere una concentrazione finale dell'1% in 0,5 L di terreno. Per i terreni semisolidi, aggiungere 1 g di agar per ottenere una concentrazione finale dello 0,2% in 0,5 L di terreno.
3. Rabboccare con acqua deionizzata (DI) fino al volume finale desiderato.
4. Chiudere la bottiglia e mescolare bene agitando. Non è necessario risospendere completamente gli ingredienti, basta assicurarsi che non siano ammassati sul fondo della bottiglia. Allentare il tappo e sterilizzare in autoclave un ciclo di fluidi sensibili (115 °C per 15 min). Si consiglia di mescolare gli ingredienti prima della sterilizzazione in autoclave e di utilizzare un ciclo di terreni sensibili per evitare la formazione di grumi e la caramellizzazione del saccarosio.
5. Esaminare visivamente il terreno dopo la sterilizzazione in autoclave. Non devono essere presenti grumi e il terreno deve essere di colore ambrato (Figura 2A).
6. Dopo la sterilizzazione in autoclave, lasciare raffreddare il mezzo a una temperatura che consenta di tenere comodamente la bottiglia a mano.
7. Se il terreno è necessario per l'induzione delle forme L, aggiungere a questo punto un antibiotico e/o un agente litico (ad esempio, fosfomicina a una concentrazione finale di 400 μg/mL, penicillina G a 200 μg/mL, D-cicloserina a 400 μg/mL, ampicillina a 100 μg/mL, moenomicina a 50 μg/mL, lisozima a 100 μg/mL o lisostafina a 5 μg/mL). Stabilire empiricamente il tipo di agente induttore della forma L (o gli agenti se ne è richiesto più di uno) e la sua concentrazione per ciascuna delle specie batteriche testate.
8. Per preparare le aliquote individuali, indossare i guanti e lavorare in una cabina di sicurezza microbiologica o utilizzare un bruciatore Bunsen. Il terreno potrebbe richiedere l'incubazione per periodi di tempo prolungati e la sterilità è di fondamentale importanza.
   1. Per preparare aliquote di terreno solido, trasferire 25 mL in singole piastre di Petri da 92/16 mm e lasciarle solidificare. Si consiglia di utilizzare un pipettatore piuttosto che versare direttamente le piastre per ridurre il rischio di contaminazione. Non asciugare eccessivamente le piastre.
   2. Per preparare aliquote semiliquide, trasferire 5 mL di terreno in più contenitori universali di polistirene da 30 mL utilizzando un pipettatore e lasciarli solidificare.
9. Utilizzare il supporto immediatamente o conservare a 4 °C fino a una settimana prima dell'uso. Controllare le raccomandazioni del produttore prima di conservare il terreno contenente antibiotici, poiché la concentrazione potrebbe diminuire a causa della degradazione del composto nel tempo.

2. Isolamento delle forme L dalle urine

NOTA: Indossare guanti e camice da laboratorio durante le procedure di laboratorio. Lavorare in una cabina di sicurezza microbiologica o utilizzare un bruciatore Bunsen. Indossare occhiali di sicurezza durante la filtrazione.

1. Almeno 1 ora prima dell'arrivo previsto dei campioni di urina, pulire l'area di lavoro con etanolo al 70% e stabilire il numero richiesto di aliquote semiliquide del mezzo LM.
   NOTA: Per dimostrare il protocollo verrà utilizzata una sospensione di E. coli ST144¹⁰ L-forms indotta in laboratorio in terreno LM liquido, piuttosto che campioni di urina umana.
2. Pulire nuovamente l'area di lavoro con etanolo al 70% prima di elaborare i campioni. Su un lato del banco, disporre il numero desiderato di filtri cut-off da 0,45 μL, siringhe da 20 mL e diversi contenitori universali sterili in polistirene da 30 mL vuoti pari al numero di campioni. Aggiungi diversi filtri di riserva al numero di campioni di urina previsti, nel caso in cui sia necessario più di un filtro per elaborare alcuni dei campioni. Posizionare le aliquote del terreno LM e svuotare i contenitori universali sterili in polistirene da 30 ml in un rack stabile al centro del banco. Se l'esame microscopico deve essere eseguito in parallelo, preparare anche vetrini da microscopio in vetro, vetrini coprioggetti da 22 x 22 mm, pipette da 2 μl e 1 mL, puntali sterili da 10 μl e 1 mL, provette sterili da 1,5 mL e assicurarsi che sia disponibile una microcentrifuga da banco.
3. Trasportare i campioni di urina dal donatore al laboratorio il prima possibile dopo la donazione, per prevenire il potenziale deterioramento dei batteri di forma L nel campione.
4. Indossare guanti e occhiali, rimuovere i campioni di urina dalla sacca di sicurezza, spruzzarli con etanolo, strofinare e posizionare nel rack, vicino alle aliquote del terreno LM e ai contenitori sterili di polistirene di ricambio da 30 ml. Da questo punto, elaborare un campione alla volta.
5. Allentare i tappi di una provetta contenente il terreno LM, il contenitore universale in polistirene di ricambio e la provetta contenente urina.
6. Estrarre la siringa dalla confezione, rimuovere lo stantuffo e posizionarlo alla sua destra.
7. Estrarre la carta di sicurezza dal retro della confezione del filtro e fissare saldamente la siringa al filtro (tenere il filtro rivolto verso il basso nel supporto di plastica del singolo produttore per assicurarsi che rimanga sterile).
8. Lavorando rapidamente ma con attenzione, rimuovere e gettare il tappo dal tubo del terreno LM e posizionare il filtro con la siringa sopra il tubo.
9. Rimuovere il tappo dal campione di urina e versare delicatamente ~10 ml nella siringa (solo 2 ml verranno filtrati ma il volume in eccesso impedisce la formazione di schizzi), assicurandosi che rimanga più di 1 ml per un esame microscopico. Verranno utilizzati solo 0,5 ml, ma non è pratico misurare con precisione un tale volume durante la prefazione della filtrazione, quindi viene mantenuto un volume in eccesso approssimativo.
10. Posizionare con molta attenzione lo stantuffo nella parte posteriore della siringa. Si avverte una piccola resistenza prima che lo stantuffo sia posizionato in una posizione completamente operativa ed è facile versare il campione oltre questo punto. Esercitarsi più volte con l'acqua prima di elaborare i campioni di urina.
11. Premere delicatamente lo stantuffo e far passare 2 ml di urina attraverso il filtro fino a quando non si avverte una resistenza crescente. Fare attenzione a non applicare troppa pressione per evitare che il campione fuoriesca e che il filtro si rompa. Se il campione è particolarmente denso e genera troppa resistenza, passare il campione attraverso più filtri, piuttosto che forzarlo attraverso uno.
12. Picchiettare delicatamente il filtro contro la provetta contenente il terreno LM per rimuovere il campione filtrato rimanente, sollevare il filtro e la siringa e posizionare rapidamente il tappo del contenitore universale in polistirene da 30 mL di riserva sulla provetta contenente il terreno LM e l'urina filtrata, facendo attenzione a non toccare l'interno della provetta con il bordo del tappo. Smaltire in modo sicuro il filtro, la siringa e il contenitore di polistirolo di ricambio.
13. Incubare i campioni in posizione stazionaria a 30 °C per un massimo di 1 mese. Ciò consentirà alle forme a L che sono passate attraverso il filtro di rigenerare le loro pareti e iniziare a crescere come batteri murati.
14. Osservare i campioni ogni giorno per trovare prove di crescita, tenendo le provette contenenti i campioni filtrati contro una fonte di luce. Per i campioni positivi, la crescita di solito appare entro 3-7 giorni.
15. Una volta rilevata la crescita, trasferire il campione in una cabina di sicurezza microbiologica o in prossimità di un bruciatore Bunsen. Aprire il campione e immergerlo con cura in un anello di plastica da 5 μL, mirando all'area di crescita, quindi striare i campioni su un terreno solido standard BHI senza osmoprotezione, con l'obiettivo di ottenere singole colonie²².
16. Allo stesso tempo, esaminare una piccola quantità di campione, insieme a una frazione di terreno semiliquido (~5 μL), al microscopio come descritto nella fase 3. Il trasferimento del campione su un vetrino microscopico insieme al mezzo garantisce che eventuali forme L che potrebbero essere ancora presenti nel campione non scoppino e possano essere rilevate. Tuttavia, a questo punto ci si aspetta che la maggior parte dei batteri sia tornata a forme murate e appaia come bastoncelli o cocchi regolari.
17. Incubare i campioni striati sulle piastre BHI in posizione stazionaria a 37 °C per una notte.
18. Esaminare la ricerca di prove di crescita, prelevare una singola colonia da ciascuna piastra utilizzando un ansa da 5 μL e inoculare in 5 ml di BHI liquido. Incubare a 37 °C per una notte, agitando.
19. Utilizzare le colture notturne per preparare scorte di glicerolo o per isolare il DNA per l'identificazione delle specie utilizzando un metodo preferito (ad esempio, Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit).

3. Esame di campioni di urina per la presenza di forme L mediante microscopia a contrasto di fase

1. Mettere i restanti 0,5 mL di campione di urina in una provetta da microcentrifuga e centrifugare a 8.000 x g per 1 minuto in una microcentrifuga da banco.
2. Rimuovere delicatamente il surnatante, lasciando circa 20 μl e risospendere il pellet pipettandolo delicatamente 3 volte su e giù.
3. Posizionare 1 μl su un vetrino da microscopio in vetro e coprire con un vetrino coprioggetti da 22 x 22 mm (per esaminare un campione da 5 μl (vedere il passaggio 2.16) utilizzare un vetrino coprioggetti da 22 x 50 mm per assicurarsi che il vetrino coprioggetti aderisca bene al vetrino). Premere delicatamente sul vetrino coprioggetti con un batuffolo di cotone sterile per creare una tenuta e per verificare che il vetrino coprioggetti non sia in grado di muoversi. Gettare il batuffolo di cotone.
4. Esaminare il vetrino utilizzando un microscopio dotato di un obiettivo a contrasto di fase 100x per la presenza di strutture a forma di L (Figura 3).
   NOTA: Per confermare l'origine batterica delle strutture a forma di L nei campioni dei pazienti, si raccomanda di esaminare i campioni mediante ibridazione fluorescente in situ (FISH) utilizzando sonde oligonucleotidiche specifiche per sequenze batteriche ^10,23.

4. Induzione di forme L in vitro

1. Striare i batteri con pareti di scelta per singole colonie²² su una piastra contenente un mezzo non osmoprotettivo (ad esempio BHI) e incubare stazionario a 37 °C durante la notte.
2. Il giorno successivo, preparare il terreno osmoprotettivo LM, contenente l'agente/i induttore/i della forma L di scelta come descritto nel passaggio 1. Preparare il numero desiderato di piastre con un terreno solido.
3. Utilizzando un ansa di plastica sterile da 5 μl o uno stuzzicadenti, prelevare una quantità generosa (~4-5 colonie) dalla piastra BHI non osmoprotettiva incubata la sera prima.
4. Striare i batteri sulla piastra LM utilizzando la superficie piana dell'anello (piuttosto che il bordo). Striare i batteri con un movimento continuo sul bordo della piastra, quindi ruotare la piastra di 90°. Toccare l'asola fino al bordo della prima striscia e con un movimento continuo, stendere la striscia su un quadrante della piastra, diluendo gradualmente i batteri con più striature sovrapposte (l'intera piastra può essere utilizzata se lo si desidera. Se si utilizza solo un quadrante della piastra, è possibile utilizzare altri quadranti per più induzioni).
   NOTA: La Figura 4A mostra schematicamente la direzione delle striature. L'obiettivo è quello di ottenere un'area di crescita che contenga il maggior numero possibile di forme L pure, piuttosto che singole colonie. Per questo motivo, non è necessario modificare i loop tra le strisce. Singole colonie di forme L possono essere molto difficili da ottenere e l'utilizzo di un numero troppo piccolo di batteri potrebbe comportare l'assenza di crescita della forma L. D'altra parte, se sono stati utilizzati troppi batteri murati per l'induzione, non tutti i batteri subiranno l'interruttore e alcuni potrebbero ancora trattenere il muro. La migliore area di crescita della forma a L di solito può essere rilevata nel mezzo della striscia.
5. Posizionare la piastra in un sacchetto di plastica o in un altro contenitore per evitare che si secchi e incubare a 30 °C (le forme L di alcune specie batteriche potrebbero crescere meglio in condizioni anaerobiche, quindi una camera anaerobica può essere testata per una crescita più efficiente della forma L). Esamina la piastra per prove di crescita ogni giorno. Questo di solito compare entro 3-7 giorni. La quantità di crescita è specifica del ceppo. Un esempio di crescita della forma L è mostrato nella Figura 4B.
6. Confermare la presenza di forme a L utilizzando un microscopio. Posizionare una goccia da 2 μL di terreno LM su un vetrino microscopico e, utilizzando la punta di una pipetta, prelevare una piccola quantità di cellule dal centro della striscia e risospendere nella gocciolina.
   1. Coprire con un vetrino coprioggetti 22 x 22 mm ed esaminare la presenza di forme a L utilizzando un microscopio con un obiettivo a contrasto di fase 100x. Un esempio rappresentativo può essere trovato nella Figura 4C.

Risultati

I terreni a forma di L contenenti saccarosio possono subire vari gradi di caramellizzazione dopo la sterilizzazione in autoclave, che sono associati a un cambiamento di colore. La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi dei terreni di sterilizzazione in autoclave contenenti saccarosio. La Figura 2A mostra un tipico esempio di terreno LM, che è diventato di colore ambrato in seguito alla sterilizzazione in autoclave. La Figura 2B mostra un esempio tipico di soluzione di saccarosio 1,16 M (2 volte la concentrazione richiesta per la produzione del terreno LM) dopo la sterilizzazione in autoclave. Occasionalmente, il terreno LM o il saccarosio possono subire un'ampia caramellizzazione durante la sterilizzazione in autoclave e non è consigliabile utilizzare il terreno se ciò accade. La Figura 2C mostra un esempio di saccarosio eccessivamente caramellato.

I batteri a forma di L possono essere altamente eterogenei e la Figura 3 mostra esempi di strutture simili a L osservabili nei campioni di urina dei pazienti. Per confermare l'origine batterica delle strutture a forma di L presenti nei campioni di urina, si raccomanda la FISH con sonde fluorescenti mirate alle sequenze batteriche^10,23.

I livelli di crescita delle forme L indotte in condizioni di laboratorio sono specifici del ceppo. La Figura 4B mostra un esempio di crescita della forma L del Bacillus subtilis e la Figura 4C mostra l'aspetto microscopico delle forme L indotte nella Figura 4B.

Figura 1: Isolamento di forme L utilizzando il metodo di filtrazione – rappresentazione schematica. Il campione di urina viene fatto passare attraverso un filtro da 0,45 μm in un contenitore universale di polistirene, contenente terreno LM osmoprotettivo integrato con agar allo 0,2%. Il campione viene quindi incubato in posizione stazionaria a 30 °C per un massimo di un mese e controllato visivamente quotidianamente per verificare la presenza di prove di crescita. Questo periodo di incubazione consente a tutte le forme L presenti nel campione di rigenerare le loro pareti cellulari. Una volta rilevata la crescita, i batteri possono essere nuovamente striati su una piastra contenente un mezzo regolare, solido e non osmoprotettivo (come l'agar nutriente o l'infusione cervello-cuore) per isolare singole colonie, che possono quindi essere sottoposte a estrazione e sequenziamento del DNA per identificare le specie batteriche isolate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Supporti a forma di L. (A) Terreno LM dopo autoclave. (B) 1,16 M di saccarosio (2 volte la concentrazione) dopo sterilizzazione in autoclave. (C) Terreno LM ampiamente caramellato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esempi di strutture simili a L osservabili nelle urine di pazienti con infezioni delle vie urinarie ricorrenti mediante microscopia a contrasto di fase. (A,B) Strutture tipiche della divisione delle forme L batteriche sospese nelle urine. (C, D) Strutture tipiche delle forme L batteriche in divisione associate alle cellule eucariotiche. (E,F) Struttura a forma di mezzaluna caratteristica per le forme a L Gram-negative (freccia rossa). (F,G) Strutture tipiche degli stadi intermedi di transizione tra le cellule murate e le forme a L (freccia rossa in G). (H) Vescicole intracellulari tipiche delle grandi forme a L. Barra di scala = 5 μm. Questa cifra è stata modificata da¹⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Tecnica a striature per l'induzione di forme a L su supporti solidi. (A) Rappresentazione schematica dei batteri striati utilizzando un quarto di piastra per l'induzione di forme L. La freccia indica la direzione in cui striare i batteri. (B) Un esempio di crescita in forma L di Bacillus subtilis in seguito a striature, come mostrato in (A), dopo 3 giorni di incubazione a 30 °C. (C) Forme L indotte in (B) visualizzate mediante microscopia a contrasto di fase. Barra di scala = 5 μm. I pannelli B e C sono stati modificati da¹⁶ Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

I protocolli descritti in questo manoscritto sono stati utilizzati per isolare e gestire le forme L di varie specie batteriche dall'urina umana, tra cui E. coli, Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterococcus ed Enterobacter spp, tutti tipicamente associati alle infezioni delle vie urinarie^10,24. Tuttavia, i metodi per la manipolazione delle forme L, stabiliti in un laboratorio, potrebbero non funzionare immediatamente in un altro e ciò che funziona per un ceppo batterico potrebbe non funzionare per un altro. Pertanto, è probabile che i protocolli descritti in questo articolo richiedano più tentativi e un'ottimizzazione aggiuntiva. In particolare, potrebbe essere necessario testare il fabbisogno di nutrienti, la disponibilità di ossigeno, la concentrazione di osmoprotettore e la fluidità del mezzo. Le condizioni ottimali per la transizione e la crescita della forma L potrebbero essere diverse dalle condizioni ottimali per la crescita delle forme murate della stessa specie. Inoltre, è possibile che si verifichino diversi problemi tecnici durante il tentativo di utilizzare i protocolli.

Un problema comune associato alla preparazione di terreni a forma di L è la caramellizzazione del saccarosio dopo la sterilizzazione in autoclave. Se il mezzo diventa di colore marrone scuro, dovrebbe essere scartato e dovrebbe essere preparato un lotto fresco. Potrebbe essere necessario preparare il saccarosio in acqua in una bottiglia e gli altri ingredienti in un'altra, entrambi a concentrazione 2x. Le soluzioni concentrate 2x possono quindi essere combinate in un rapporto 1:1 dopo la sterilizzazione in autoclave, per ottenere le concentrazioni finali desiderate. Il saccarosio autoclavato separatamente può diventare leggermente giallo (Figura 2B), il che è accettabile, ma se diventa marrone scuro (Figura 2C), non dovrebbe essere utilizzato per esperimenti. Potrebbe essere necessario regolare la lunghezza e la temperatura del ciclo di sterilizzazione in autoclave per alleviare la caramellizzazione del saccarosio. Si raccomanda di verificare la sterilità del terreno preparato utilizzando un ciclo di autoclave regolato, incubando un'aliquota di ciascun terreno per almeno 3 giorni a 37 °C. Infine, potrebbe essere necessario testare un agente osmoprotettivo alternativo, come il sale, se il problema con la caramellizzazione persiste¹⁸.

Diversi problemi potrebbero verificarsi anche durante l'isolamento delle forme L dai campioni dei pazienti. Come menzionato nel protocollo, le forme L presenti nei campioni potrebbero potenzialmente deteriorarsi; Pertanto, è importante trasportare i campioni in laboratorio il prima possibile dopo la donazione. Per lo stesso motivo, è fortemente sconsigliata la conservazione dei campioni a basse temperature o la modifica della composizione del campione (ad esempio mediante l'aggiunta di PBS).

Il metodo di filtrazione stesso ha i suoi limiti. Alcune forme a L possono essere strappate a causa delle forze di taglio generate dal flusso del fluido attraverso il filtro. Nello studio di Mickiewicz et al., solo il 41% delle forme L nei campioni di controllo, che contenevano forme L di E. coli indotte in laboratorio, sono passate attraverso il filtro¹⁰. Ciò dimostra che il metodo di filtrazione può portare a una sottostima del numero di campioni positivi e non è raccomandato per gli studi quantitativi.

In occasioni molto rare, dopo la filtrazione, il giorno successivo potrebbe essere osservabile una crescita significativa nelle aliquote semiliquide utilizzate per l'isolamento a forma di L. Questo potrebbe essere un'indicazione che il filtro si è rotto durante il protocollo, consentendo il passaggio di batteri murati, o che il campione è stato contaminato. È buona norma scartare tali campioni o almeno trattarli con cautela. L'esame visivo quotidiano dei campioni è fondamentale per prevenire falsi positivi. Prima di elaborare campioni di urina mediante filtrazione, si raccomanda di far passare diversi campioni di forme L indotte in laboratorio, batteri walled e terreno sterile attraverso il filtro di scelta, per controllare l'efficienza della separazione a forma di L, il potenziale passaggio di batteri walled a causa della rottura del filtro e per assicurarsi che la tecnica sterile utilizzata funzioni bene.

In rari casi, le forme L stabili potrebbero essere isolate mediante filtrazione, senza che le forme murate siano rilevabili al microscopio. Per mantenere vitali i batteri a forma di L, si consiglia di trasferire diversi "loop-full" del campione in una provetta contenente terreno LM semiliquido fresco o di ri-striare su terreno solido osmoprotettivo ogni 3-7 giorni, a seconda dell'efficienza della crescita. Se dopo diversi passaggi non compaiono forme murate, si potrebbe tentare di congelare campioni in glicerolo al 40% a -80 °C per preservare l'isolato; tuttavia, alcune forme L potrebbero non tollerare bene tale procedura.

Nonostante i suoi limiti, il metodo di filtrazione è l'unico utilizzato finora per la separazione delle forme L dalle forme murate nei campioni dei pazienti. Consente l'identificazione di ceppi batterici in grado di cambiare la forma L in vivo. Esiste il potenziale per sviluppare e adattare il metodo di filtrazione per l'isolamento delle forme L da altri tipi di campioni umani o ambientali (ad esempio sangue o piante).

Tenendo conto di tutte le considerazioni di cui sopra, raccomandiamo i protocolli delineati in questo manoscritto come un buon punto di partenza per lo sviluppo di protocolli di forma a L su misura nei singoli laboratori, piuttosto che come rigide istruzioni. Lavorare con le forme a L richiede grande cura, dedizione e pazienza, ma con la pratica può essere estremamente gratificante. Ci auguriamo che le linee guida delineate in questo manoscritto diventino un punto di riferimento per lo sviluppo di protocolli di forma L e incoraggino gruppi di ricerca più basici e clinici a studiare queste affascinanti forme batteriche.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µL cut off filters	Sarstedt	83.1826
20 mL syringes	Fisher	17955460
30 mL polystyrene universal tubes	Starlab	E1412-3010
92 x 16 mm Petri Dishes	Starstedt	82.1473
Agar	Oxoid	LP0011
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135
Cover slips (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)	VWR	631-0137/-0125
D-cycloserine	Sigma-Aldrich	C6880
Glass microscope slides	VWR	631-1550P
Lysostaphin	Sigma-Aldrich	L7386
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L4919
MgSO4	VWR	25165.26
Moenomycin	Sigma-Aldrich	32404
Penicillin G	Sigma-Aldrich	13752
Phosphomycin	Sigma-Aldrich	P5396
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100