Isolamento de bactérias em forma de L da urina usando o método de filtração

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de bactérias em forma de L da urina, usando um método de filtração. Métodos complementares para a preparação de meios em forma de L, observação de formas L por microscopia de contraste de fase e indução de formas em L em condições de laboratório também são descritos.

Resumo

Acredita-se que a transição das bactérias para o estado de forma L desempenhe um possível papel na evasão imunológica e na persistência bacteriana durante o tratamento com antibióticos direcionados à parede celular. No entanto, o isolamento e o manuseio de bactérias em forma de L são desafiadores, principalmente devido à sua alta sensibilidade a alterações na osmolaridade. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para a preparação do meio em forma L, isolamento de formas L da urina usando um método de filtração, detecção de formas L em amostras de urina por microscopia de contraste de fase e indução de formas L in vitro. Os requisitos exatos para sobrevivência e crescimento das formas L podem variar de cepa para cepa. Portanto, os métodos apresentados aqui destinam-se a atuar como diretrizes básicas para o estabelecimento de protocolos de forma L em laboratórios individuais, em vez de instruções precisas. O método de filtração pode levar a uma redução no número de formas L em uma amostra e não deve ser usado para quantificação. No entanto, é o único método usado até agora para a separação eficaz de variantes deficientes em parede celular de suas contrapartes muradas e para a identificação de cepas bacterianas, que são capazes de mudar a forma L em pacientes com infecções do trato urinário. O método de filtração tem o potencial de ser adaptado para o isolamento de formas L de pacientes com outras categorias de infecções bacterianas e de amostras ambientais.

Introdução

Praticamente todas as bactérias são cercadas por uma estrutura chamada parede celular. A parede é importante para proteção contra estresses ambientais, ajuda na divisão regular e dá forma às bactérias¹. No entanto, a parede também é um alvo para partes do sistema imunológico e alguns dos melhores e mais usados antibióticos, incluindo a penicilina ^2,3. Apesar de sua importância, bactérias Gram-positivas e Gram-negativas podem ocasionalmente sobreviver sem a parede 4,5,6,7,8. Se as condições circundantes fornecerem osmoproteção suficiente para evitar que estourem e os agentes direcionados à parede celular também estiverem presentes, as bactérias podem fazer a transição para um estado sem parede, conhecido como forma L 4,5,6,7,8.

Numerosos relatórios indicam que mudar para um estado de forma L e voltar para um estado de parede pode ser importante in vivo como um mecanismo para as bactérias sobreviverem tanto ao ataque do sistema imunológico do hospedeiro quanto ao tratamento com antibióticos direcionados à parede celular 9,10,11,12,13,14,15. Essa transição potencialmente fornece uma estratégia poderosa para a recorrência da infecção bacteriana 9,10,11,12,13,14,15. Compreender a biologia básica das bactérias em forma de L e suas interações com o hospedeiro são fundamentais para decifrar seu papel na patogênese. No entanto, lidar com bactérias em forma de L é um desafio.

Em primeiro lugar, devido à falta da parede celular, as bactérias em forma de L são propensas a estourar em resposta a mudanças na osmolaridade. Além disso, as formas L se dividem de maneira altamente irregular, têm padrões imprevisíveis de crescimento (geralmente muito mais lentos do que suas contrapartes muradas) e, dependendo da cepa, podem se propagar melhor em meios semilíquidos, em vez de sólidos ou líquidos. Todas as considerações acima dificultam a quantificação e a comparação das taxas de crescimento. Diferentes espécies bacterianas (ou mesmo cepas) têm diversos requisitos metabólicos para a troca e crescimento da forma L. Por exemplo, as formas L de certas bactérias Gram-positivas, que dependem da respiração aeróbica, são mais sensíveis a espécies reativas de oxigênio do que suas contrapartes muradas¹⁶.

A indução de formas L em condições de laboratório e no hospedeiro é geralmente impulsionada por agentes direcionados à parede celular, como antibióticos e lisozima⁹. Tal tratamento pode resultar em apenas uma perda parcial da parede celular e, portanto, algumas bactérias muradas (ou parcialmente muradas) podem estar presentes nas amostras, tornando difícil distinguir se quaisquer resultados experimentais observados são devidos à presença de formas L ou formas muradas de bactérias. A frequência das formas L induzidas in vivo tende a ser baixa, o que significa que podem ser difíceis de encontrar e isolar. Finalmente, devido à sua morfologia polimórfica, as formas L podem ser facilmente confundidas in situ com estruturas de origem eucariótica, como corpos apoptóticos ou vários grânulos.

Desde sua descoberta em 1935¹⁷, vários métodos foram desenvolvidos para lidar com formas L em laboratório. A maioria deles depende da adição de um agente osmoprotetor ao meio de crescimento; geralmente um açúcar ou um sal 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Como mencionado acima, as formas L geralmente ocorrem lado a lado com bactérias muradas em amostras de pacientes e separar as duas populações pode ser difícil. No entanto, foi demonstrado que, ao contrário das bactérias muradas, as formas L podem passar por um filtro de 0,45 μm devido à sua flexibilidade e tamanhos variáveis. Um método usando esse filtro foi empregado para isolar as formas L da urina 10,19,20,21.

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de bactérias em forma de L da urina, usando um método de filtração (Figura 1). Protocolos complementares para a preparação do meio em forma de L, observação microscópica de formas L e indução de formas L in vitro também são descritos.

Protocolo

1. Preparação do meio em forma de L (LM)

1. Pese sacarose (quantidade ajustada para atingir uma concentração final de 0,58 M), MgSO₄ (concentração final 8 mM) e Infusão Cérebro Coração (BHI) (quantidade recomendada pelo fornecedor) em um frasco de vidro com o dobro do tamanho do volume desejado do meio. Para preparar 0,5 L do meio, pesar 100 g de sacarose, 1 g de MgSO₄ e 18,5 g de BHI e colocar em um frasco de vidro de 1 L. Isso permitirá uma ressuspensão mais fácil dos ingredientes antes da autoclavagem.
2. Se forem necessários meios sólidos ou semi-sólidos, adicione a quantidade desejada de ágar. Para meios sólidos, adicione 5 g de ágar para atingir uma concentração final de 1% em 0,5 L de meio. Para meios semi-sólidos, adicione 1 g de ágar para atingir uma concentração final de 0,2% em 0,5 L de meio.
3. Complete com água deionizada (DI) até o volume final desejado.
4. Feche a garrafa e misture bem agitando. Não há necessidade de ressuspender completamente os ingredientes, apenas certifique-se de que eles não estejam grudados no fundo da garrafa. Afrouxe a tampa e a autoclave em um ciclo de mídia sensível (115 °C por 15 min). Recomenda-se misturar os ingredientes antes da autoclavagem e usar um ciclo de mídia sensível para evitar a aglomeração dos ingredientes e a caramelização da sacarose.
5. Examine visualmente o meio após a autoclavagem. Não devem estar presentes aglomerados e o meio deve ser de cor âmbar (Figura 2A).
6. Após a autoclavagem, deixe o meio esfriar a uma temperatura que permita que a garrafa seja segurada confortavelmente com a mão.
7. Se o meio for necessário para a indução de formas L, adicione um antibiótico e/ou um agente lítico neste ponto (por exemplo, fosfomicina a uma concentração final de 400 μg/mL, penicilina G a 200 μg/mL, D-cicloserina a 400 μg/mL, ampicilina a 100 μg/mL, moenomicina a 50 μg/mL, lisozima a 100 μg/mL ou lisosafina a 5 μg/mL). Estabelecer empiricamente o tipo de agente indutor da forma L (ou agentes, se for necessário mais de um) e sua concentração para cada uma das espécies bacterianas testadas.
8. Para preparar alíquotas individuais, use luvas e trabalhe em uma cabine de segurança microbiológica ou use um bico de Bunsen. O meio pode exigir incubação por períodos prolongados de tempo e a esterilidade é de suma importância.
   1. Para preparar alíquotas de meio sólido, transferir 25 ml para placas de Petri individuais de 92/16 mm e deixá-las endurecer. Recomenda-se usar um pipetador em vez de despejar as placas diretamente para reduzir o risco de contaminação. Não seque demais as placas.
   2. Para preparar alíquotas semilíquidas, transfira 5 mL de meio para vários recipientes universais de poliestireno de 30 mL usando um pipetador e deixe-os endurecer.
9. Use a mídia imediatamente ou armazene a 4 °C por até uma semana antes de usar. Verifique as recomendações do fabricante antes de armazenar o meio contendo antibióticos, pois a concentração pode diminuir, devido à degradação do composto ao longo do tempo.

2. Isolamento das formas L da urina

NOTA: Use luvas e jaleco durante os procedimentos laboratoriais. Trabalhe em um gabinete de segurança microbiológica ou use um bico de Bunsen. Use óculos de segurança durante a filtragem.

1. Pelo menos 1 h antes da chegada prevista das amostras de urina, limpe a área de trabalho com etanol a 70% e defina o número necessário de alíquotas de meio LM semilíquido.
   NOTA: Uma suspensão de E. coli ST144¹⁰ formas L induzidas em laboratório em meio LM líquido, em vez de amostras de urina humana, será usada para demonstrar o protocolo.
2. Limpe a área de trabalho novamente com etanol a 70% antes de processar as amostras. De um lado da bancada, coloque o número desejado de filtros de corte de 0,45 μL, seringas de 20 mL e vários recipientes universais de poliestireno estéreis vazios de 30 mL igual ao número de amostras. Adicione vários filtros sobressalentes além do número de amostras de urina esperadas, caso seja necessário mais de um filtro para processar algumas das amostras. Coloque as alíquotas médias LM e esvazie os recipientes universais estéreis de poliestireno de 30 mL em um rack estável no meio da bancada. Se o exame microscópico for realizado em paralelo, prepare também lâminas de microscópio de vidro, lamínulas de 22 x 22 mm, pipetas de 2 μL e 1 mL, pontas estéreis de 10 μL e 1 mL, tubos estéreis de 1,5 mL e certifique-se de que uma microcentrífuga de bancada esteja disponível.
3. Transportar amostras de urina do dador para o laboratório o mais rapidamente possível após a dádiva, para evitar a potencial deterioração das bactérias em forma de L na amostra.
4. Coloque luvas e óculos de proteção, retire as amostras de urina da bolsa de segurança, borrife-as com etanol, limpe e coloque no rack, próximo às alíquotas médias LM e recipientes estéreis de poliestireno de 30 mL. A partir deste ponto, processe uma amostra de cada vez.
5. Afrouxe as tampas de um tubo contendo meio LM, recipiente universal de poliestireno sobressalente e tubo contendo urina.
6. Retire a seringa da embalagem, retire o êmbolo e coloque-a à sua direita.
7. Puxe o papel de segurança da parte de trás da embalagem do filtro e prenda a seringa firmemente ao filtro (mantenha o filtro voltado para baixo no suporte de plástico do fabricante individual para garantir que permaneça estéril).
8. Trabalhando rapidamente, mas com cuidado, remova e descarte a tampa do tubo de meio LM e coloque o filtro com a seringa em cima do tubo.
9. Remova a tampa da amostra de urina e despeje suavemente ~ 10 mL na seringa (apenas 2 mL serão filtrados, mas o excesso de volume evita respingos), certificando-se de que mais de 1 mL seja deixado para um exame microscópico. Apenas 0,5 mL será usado, mas é impraticável medir com precisão esse volume durante a filtração de pré-execução, portanto, um volume excedente aproximado é retido.
10. Coloque o êmbolo com muito cuidado na parte de trás da seringa. Uma pequena quantidade de resistência pode ser sentida antes que o êmbolo seja colocado em uma posição totalmente operacional e é fácil derramar a amostra além desse ponto. Pratique várias vezes usando água antes de processar amostras de urina.
11. Pressione suavemente o êmbolo e passe 2 mL de urina pelo filtro até sentir uma resistência crescente. Tenha cuidado para não aplicar muita pressão para evitar que a amostra transborde e o filtro se quebre. Se a amostra for particularmente densa e gerar muita resistência, passe a amostra por vários filtros, em vez de forçá-la a passar por um.
12. Bata suavemente o filtro contra o tubo contendo meio LM para desalojar qualquer amostra filtrada restante, levante o filtro e a seringa e coloque rapidamente a tampa do recipiente universal de poliestireno sobressalente de 30 mL no tubo contendo meio LM e urina filtrada, certificando-se de não tocar no interior do tubo com a borda da tampa. Descarte com segurança o filtro, a seringa e o recipiente de poliestireno sobressalente.
13. Incubar as amostras numa posição estacionária a 30 °C durante um período máximo de 1 mês. Isso permitirá que as formas L que passaram pelo filtro regenerem suas paredes e comecem a crescer como bactérias muradas.
14. Observe as amostras todos os dias em busca de evidências de crescimento, segurando os tubos contendo amostras filtradas contra uma fonte de luz. Para amostras positivas, o crescimento geralmente aparece dentro de 3 a 7 dias.
15. Assim que o crescimento for detectado, transfira a amostra para um gabinete de segurança microbiológica ou próximo a um bico de Bunsen. Abra a amostra e mergulhe cuidadosamente em uma alça de plástico de 5 μL, visando a área de crescimento, e então listre as amostras em meio BHI sólido padrão sem osmoproteção, visando obter colônias únicas²².
16. Ao mesmo tempo, examinar microscopicamente uma pequena quantidade da amostra, juntamente com uma fração de meio semilíquido (~5 μL), conforme descrito no passo 3. A transferência da amostra para uma lâmina microscópica juntamente com o meio garantirá que quaisquer formas L que ainda possam estar presentes na amostra não explodam e possam ser detectadas. No entanto, espera-se que a maioria das bactérias neste momento tenha revertido para formas muradas e apareça como bastonetes ou cocos regulares.
17. Incubar as amostras riscadas nas placas BHI numa posição estacionária a 37 °C durante a noite.
18. Examine se há evidências de crescimento, pegue uma única colônia de cada placa usando uma alça de 5 μL e inocule em 5 mL de BHI líquido. Incubar a 37 °C durante a noite, com agitação.
19. Use as culturas noturnas para preparar estoques de glicerol ou para isolar DNA para identificação de espécies usando um método preferido (por exemplo, Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit).

3. Exame de amostras de urina para a presença de formas L por microscopia de contraste de fase

1. Coloque os 0,5 mL restantes da amostra de urina em um tubo de microcentrífuga e gire a 8.000 x g por 1 min em uma microcentrífuga de bancada.
2. Remova suavemente o sobrenadante, deixando para trás aproximadamente 20 μL e ressuspenda o pellet pipetando suavemente 3 vezes para cima e para baixo.
3. Coloque 1 μL em uma lâmina de microscópio de vidro e cubra com uma lamínula de 22 x 22 mm (para examinar uma amostra de 5 μL (consulte a etapa 2.16), use uma lamínula de 22 x 50 mm para certificar-se de que a lamínula aderirá bem à lâmina). Pressione suavemente a lamínula usando uma almofada de algodão estéril para criar uma vedação e verificar se a lamínula não consegue se mover. Descarte a almofada de algodão.
4. Examine a lâmina usando um microscópio equipado com uma objetiva de contraste de fase de 100x para a presença de estruturas semelhantes à forma de L (Figura 3).
   NOTA: Para confirmar a origem bacteriana de estruturas semelhantes à forma de L em amostras de pacientes, recomenda-se examinar as amostras por hibridização fluorescente in situ (FISH) usando sondas de oligonucleotídeos específicas para sequências bacterianas^10,23.

4. Indução de formas L in vitro

1. Bactérias com paredes estriadas de escolha para colônias únicas²² em uma placa contendo meio não osmoprotetor (por exemplo, BHI) e incubar estacionário a 37 ° C durante a noite.
2. No dia seguinte, prepare o meio LM osmoprotetor, contendo agente (s) indutor (es) em forma de L de sua escolha, conforme descrito na etapa 1. Prepare o número desejado de placas com meio sólido.
3. Usando um laço de plástico estéril de 5 μL ou um palito de dente, pegue uma quantidade generosa (~ 4-5 colônias) da placa BHI não osmoprotetora incubada na noite anterior.
4. Listre as bactérias na placa LM usando a superfície plana do laço (em vez da borda). Risque as bactérias com um movimento contínuo na borda da placa e, em seguida, gire a placa 90°. Toque o laço até a borda da primeira faixa e, com um movimento contínuo, espalhe a faixa sobre um quadrante da placa, diluindo gradualmente as bactérias com várias faixas sobrepostas (a placa inteira pode ser usada, se desejado. Se estiver usando apenas um quadrante da placa, outros quadrantes podem ser usados para múltiplas induções).
   NOTA: A Figura 4A mostra esquematicamente a direção das listras. O objetivo aqui é obter uma área de crescimento contendo o maior número possível de formas L puras, em vez de colônias únicas. Por esse motivo, não há necessidade de alterar os loops entre as sequências. Colônias únicas de formas L podem ser muito difíceis de obter e o uso de um número muito pequeno de bactérias pode resultar em nenhum crescimento da forma L. Por outro lado, se muitas bactérias muradas foram usadas para a indução, nem todas as bactérias sofrerão a troca e algumas ainda podem reter a parede. A melhor área de crescimento em forma de L geralmente pode ser detectada no meio da sequência.
5. Coloque a placa em um saco plástico ou outro recipiente para evitar que seque e incube a 30 ° C (as formas L de algumas espécies bacterianas podem crescer melhor em condições anaeróbicas, portanto, uma câmara anaeróbica pode ser testada para um crescimento mais eficiente da forma L). Examine a placa em busca de evidências de crescimento todos os dias. Isso geralmente aparece dentro de 3 a 7 dias. A quantidade de crescimento é específica da cepa. Um exemplo de crescimento em forma de L é mostrado na Figura 4B.
6. Confirme a presença de formas L usando um microscópio. Coloque uma gota de 2 μL de meio LM em uma lâmina microscópica e, usando uma ponta de pipeta, pegue uma pequena quantidade de células do meio da faixa e ressuspenda na gota.
   1. Cubra com uma lamínula de 22 x 22 mm e examine a presença de formas em L usando um microscópio com uma objetiva de contraste de fase de 100x. Um exemplo representativo pode ser encontrado na Figura 4C.

Resultados

Os meios em forma de L contendo sacarose podem sofrer vários graus de caramelização após a autoclavagem, que estão associados a uma mudança na cor. A Figura 2 mostra os resultados representativos dos meios de autoclavagem contendo sacarose. A Figura 2A mostra um exemplo típico de meio LM, que ficou âmbar após a autoclavagem. A Figura 2B mostra um exemplo típico de solução de sacarose 1,16 M (concentração de 2 x necessária para fazer o meio LM) após a autoclavagem. Ocasionalmente, o meio LM ou a sacarose podem sofrer caramelização extensa durante a autoclavagem, e não é recomendado o uso do meio se isso acontecer. A Figura 2C mostra um exemplo de meio de sacarose supercaramelizado.

As bactérias em forma de L podem ser altamente heterogêneas e a Figura 3 mostra exemplos de estruturas semelhantes à forma em L observáveis em amostras de urina de pacientes. Para confirmar a origem bacteriana das estruturas em forma de L encontradas em amostras de urina, recomenda-se FISH com sondas fluorescentes direcionadas a sequências bacterianas^10,23.

Os níveis de crescimento das formas L induzidas em condições de laboratório são específicos da cepa. A Figura 4B mostra um exemplo de crescimento da forma L de Bacillus subtilis e a Figura 4C mostra a aparência microscópica das formas L induzidas na Figura 4B.

Figura 1: Isolamento de formas L usando método de filtração – representação esquemática. A amostra de urina é passada através de um filtro de 0,45 μm para um recipiente universal de poliestireno, contendo meio LM osmoprotetor suplementado com ágar 0,2%. A amostra é então incubada numa posição estacionária a 30 °C durante um mês e verificada visualmente diariamente para detecção de sinais de crescimento. Este período de incubação permite que quaisquer formas L presentes na amostra regenerem suas paredes celulares. Uma vez detectado o crescimento, as bactérias podem ser recolocadas em uma placa contendo meio regular, sólido e não osmoprotetor (como ágar nutriente ou infusão cérebro-coração) para isolar colônias únicas, que podem então ser submetidas à extração e sequenciamento de DNA para identificar as espécies bacterianas isoladas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Mídia em forma de L. (A) Meio LM após autoclavagem. (B) 1,16 M de sacarose (concentração 2 x) após autoclavagem. (C) Meio LM extensivamente caramelizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Exemplos de estruturas semelhantes à forma L observáveis na urina de pacientes com ITU recorrente por microscopia de contraste de fase. (A, B) Estruturas típicas da divisão de formas L bacterianas suspensas na urina. (C, D) Estruturas típicas da divisão de formas L bacterianas associadas a células eucarióticas. (E, F) Estrutura em forma de meia-lua característica para formas L Gram-negativas (seta vermelha). (F, G) Estruturas típicas para estágios intermediários de transição entre as células muradas e as formas L (seta vermelha em G). (H) Vesículas intracelulares típicas de grandes formas L. Barra de escala = 5 μm. Este número foi modificado de¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Técnica de placa de listras para indução de formas L em meio sólido. (A) Representação esquemática de bactérias estriadas usando um quarto de uma placa para indução de formas L. A seta indica a direção para listrar a bactéria. (B) Um exemplo de crescimento da forma L de Bacillus subtilis após estrias, conforme mostrado em (A), após 3 dias de incubação a 30 ° C. (C) Formas L induzidas em (B) visualizadas por microscopia de contraste de fase. Barra de escala = 5 μm. Os painéis B e C foram modificados de¹⁶ Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os protocolos descritos neste manuscrito têm sido usados para isolar e manipular formas L de várias espécies bacterianas da urina humana, incluindo E. coli, Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterococcus e Enterobacter spp, todos tipicamente associados a ITUs^10,24. No entanto, os métodos para lidar com formas L, estabelecidos em um laboratório, podem não funcionar imediatamente em outro e o que funciona para uma cepa bacteriana pode não funcionar para outra. Portanto, os protocolos descritos aqui provavelmente exigirão várias tentativas e otimização adicional. Em particular, as necessidades de nutrientes, a disponibilidade de oxigênio, a concentração de osmoprotetor e a fluidez do meio podem precisar ser testadas. As condições ideais para a transição e crescimento da forma L podem ser diferentes das condições ideais para o crescimento de formas muradas da mesma espécie. Além disso, vários problemas técnicos podem ser encontrados ao tentar os protocolos.

Um problema comum associado à preparação de meios em forma de L é a caramelização da sacarose após a autoclavagem. Se o meio ficar marrom escuro, ele deve ser descartado e um novo lote deve ser preparado. Pode ser necessário preparar a sacarose em água em uma garrafa e os demais ingredientes em outra, ambos na concentração 2x. 2x soluções concentradas podem então ser combinadas na proporção de 1:1 após a autoclavagem, para atingir as concentrações finais desejadas. A sacarose autoclavada separadamente pode ficar ligeiramente amarelada ( Figura 2B ), o que é aceitável, mas se ficar marrom escuro ( Figura 2C ), não deve ser usada para experimentos. Ajustar a duração e a temperatura do ciclo de autoclavagem pode ser necessário para aliviar a caramelização da sacarose. Recomenda-se o teste da esterilidade dos meios preparados utilizando um ciclo de autoclave ajustado, incubando uma alíquota de cada um dos meios durante, pelo menos, 3 dias a 37 °C. Finalmente, pode ser necessário testar um agente osmoprotetor alternativo, como o sal, se o problema com a caramelização persistir¹⁸.

Vários problemas também podem ser encontrados durante o isolamento de formas L de amostras de pacientes. Conforme mencionado no protocolo, as formas L presentes nas amostras podem potencialmente se deteriorar; Portanto, é importante transportar as amostras para o laboratório o mais rápido possível após a doação. Pela mesma razão, o armazenamento de amostras em baixas temperaturas ou a modificação da composição da amostra (por exemplo, pela adição de PBS) é fortemente desencorajado.

O próprio método de filtragem tem suas limitações. Algumas formas L podem ser rasgadas devido a forças de cisalhamento geradas pelo fluxo de mídia através do filtro. No estudo de Mickiewicz et al., apenas 41% das formas L em amostras controle, que continham formas L de E. coli induzidas em laboratório, passaram pelo filtro¹⁰. Isso demonstra que o método de filtração pode levar a uma subestimação do número de amostras positivas e não é recomendado para estudos quantitativos.

Em ocasiões muito raras, após a filtração, um crescimento significativo pode ser observado no dia seguinte nas alíquotas de meios semilíquidos usados para isolamento em forma de L. Isso pode ser uma indicação de que o filtro quebrou durante o protocolo, permitindo a passagem de bactérias muradas, ou a amostra foi contaminada. É uma boa prática descartar essas amostras ou, pelo menos, tratá-las com cautela. O exame visual diário das amostras é fundamental para evitar falsos positivos. Antes de processar amostras de urina por filtração, recomenda-se passar várias amostras de formas em L induzidas em laboratório, bactérias com paredes e meio estéril através do filtro de escolha, para controlar a eficiência da separação da forma em L, a passagem potencial de bactérias com paredes devido à quebra do filtro e para garantir que a técnica estéril usada esteja funcionando bem.

Em casos raros, as formas L estáveis podem ser isoladas por filtração, sem formas muradas detectáveis por microscopia. Para manter as bactérias viáveis em forma de L, recomenda-se transferir vários "loop-fulls" da amostra para um tubo contendo meio LM semilíquido fresco ou refazer a raia em meio osmoprotetor sólido a cada 3-7 dias, dependendo da eficiência do crescimento. Se nenhuma forma murada aparecer após várias passagens, congelar amostras em glicerol a 40% a –80 °C pode ser tentado para preservar o isolado; no entanto, algumas formas L podem não tolerar bem esse procedimento.

Apesar de suas limitações, o método de filtração é o único usado até o momento para a separação de formas L de formas muradas em amostras de pacientes. Permite a identificação de cepas bacterianas capazes de mudar a forma L in vivo. Existe o potencial de desenvolver e adaptar o método de filtração para isolamento de formas L de outros tipos de amostras humanas ou ambientais (por exemplo, sangue ou plantas).

Levando em consideração todas as considerações acima, recomendamos os protocolos descritos neste manuscrito como um bom ponto de partida para o desenvolvimento de protocolos personalizados em forma L em laboratórios individuais, em vez de instruções rígidas. Trabalhar com formas L requer muito cuidado, dedicação e paciência, mas com a prática, pode ser extremamente gratificante. Esperamos que as diretrizes descritas neste manuscrito se tornem uma referência para o desenvolvimento de protocolos de forma L e encorajem mais grupos de pesquisa básica e clínica a investigar essas formas bacterianas fascinantes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µL cut off filters	Sarstedt	83.1826
20 mL syringes	Fisher	17955460
30 mL polystyrene universal tubes	Starlab	E1412-3010
92 x 16 mm Petri Dishes	Starstedt	82.1473
Agar	Oxoid	LP0011
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135
Cover slips (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)	VWR	631-0137/-0125
D-cycloserine	Sigma-Aldrich	C6880
Glass microscope slides	VWR	631-1550P
Lysostaphin	Sigma-Aldrich	L7386
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L4919
MgSO4	VWR	25165.26
Moenomycin	Sigma-Aldrich	32404
Penicillin G	Sigma-Aldrich	13752
Phosphomycin	Sigma-Aldrich	P5396
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100