ろ過法による尿中からのL型細菌の単離

要約

ここでは、ろ過法を使用して尿からL型細菌を分離するためのプロトコルを紹介します。L型培地の調製のための補完的な方法、位相差顕微鏡によるL型観察、および実験室条件下でのL型の導入についても説明します。

要約

細菌のL型状態への移行は、細胞壁を標的とする抗生物質による治療中の免疫回避と細菌の持続性に役割を果たす可能性があると考えられています。しかし、L型細菌の単離と取り扱いは、主に浸透圧の変化に対する感度が高いため、困難です。ここでは、L型培地の調製、ろ過法を使用した尿からのL型の単離、位相差顕微鏡による尿サンプル中のL型の検出、およびin vitroでのL型の導入に関する詳細なプロトコルについて説明します。L型が生存し、成長するための正確な要件は、系統ごとに異なる場合があります。したがって、ここで紹介する方法は、正確な指示としてではなく、個々のラボ内でL型プロトコルを確立するための基本的なガイドラインとして機能することを意図しています。ろ過法は、サンプル中のL型の数を減らす可能性があるため、定量には使用しないでください。しかし、これは、細胞壁欠損バリアントを壁型バリアントから効果的に分離し、尿路感染症患者でL型スイッチングが可能な細菌株を同定するためにこれまでに使用された唯一の方法です。このろ過法は、他のカテゴリーの細菌感染症患者や環境サンプルからのL型分離に適応できる可能性があります。

概要

事実上、すべての細菌は細胞壁と呼ばれる構造に囲まれています。壁は環境ストレスから保護するために重要であり、定期的な分裂を助け、バクテリアに形状^{を与えます1}。しかし、この壁は、免疫系の一部や、ペニシリン^2,3など、最も優れて最も使用されている抗生物質の標的でもあります。その重要性にもかかわらず、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方が壁^4,5,6,7,8なしで生き残ることができることがあります。周囲の条件が破裂を防ぐのに十分な浸透圧保護を提供し、細胞壁標的剤も存在する場合、細菌はL型4,5,6,7,8と呼ばれる壁のない状態に移行することができます。

多数の報告は、細菌が宿主免疫系からの攻撃と細胞壁を標的とする抗生物質による治療の両方を生き残るためのメカニズムとして、L型状態への切り替えと壁状態への復帰がin vivoで重要である可能性があることを示しています9,10,11,12,13,14,15。このような移行は、細菌感染の再発に対する強力な戦略を提供する可能性があります9,10,11,12,13,14,15。L型細菌の基本的な生物学と、それらの宿主との相互作用を理解することは、病因におけるそれらの役割を解読するために重要です。しかし、L型細菌の取り扱いは困難です。

まず、細胞壁がないため、L型細菌は浸透圧の変化に反応して破裂する傾向があります。さらに、L型は非常に不規則に分裂し、成長の予測不可能なパターン(通常は壁のあるものよりもはるかに遅い)を持ち、ひずみによっては、固体や液体の媒体ではなく、半液体でよりよく伝播する可能性があります。上記のすべての考慮事項により、成長率の定量化と比較が困難になります。異なる細菌種(または株)は、L型スイッチングと成長のための多様な代謝要件を持っています。例えば、好気性呼吸に依存する特定のグラム陽性菌のL型は、壁に囲まれた細菌よりも活性酸素種に対してより敏感である¹⁶。

実験室条件下でのL型および宿主内でのL型の導入は、通常、抗生物質やリゾチーム⁹などの細胞壁標的薬によって駆動されます。このような処理では、細胞壁が部分的に失われるだけであり、したがって、サンプル中に一部の壁型(または部分的に壁型)の細菌が存在する可能性があり、観察された実験結果がL型または壁型細菌の存在によるものかどうかを区別するのが難しくなります。in vivoで誘導されるL型は頻度が低い傾向があり、見つけて分離するのが難しい場合があります。最後に、L型は多型形態であるため、アポトーシス体やさまざまな顆粒などの真核生物起源の構造とその場で簡単に混同できます。

1935年に発見^{されて以来、}実験室でL型を処理するためのいくつかの方法が開発されてきました。これらのほとんどは、成長培地への浸透圧保護剤の添加に依存しています。通常、砂糖または塩9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。前述のように、L型は患者サンプル中に壁のある細菌と並んで発生することが多く、2つの集団を分離することは困難な場合があります。しかし、壁状細菌とは異なり、L型は柔軟性と可変サイズにより、0.45μmのフィルターを通過できることが実証されています。このようなフィルターを使用する方法が、尿10,19,20,21からL型を単離するために採用されている。

ここでは、ろ過法を使用して尿からL型細菌を単離するためのプロトコルを示します(図1)。L型培地の調製、L型の顕微鏡観察、およびin vitroでのL型の導入のための補完的なプロトコルも記載されています。

プロトコル

1. L型培地(LM)の調製

1. ショ糖(最終濃度0.58 Mになるように調整された量)、MgSO₄ (最終濃度8 mM)、およびBrain Heart Infusion(BHI)(サプライヤーが推奨する量)を、希望の培地容量の2倍の大きさのガラス瓶に入れて計量します。0.5Lの培地を調製するには、スクロース100g、_MgSO41g 、BHI18.5gを秤量し、1Lのガラス瓶に入れます。これにより、オートクレーブ前の成分の再懸濁が容易になります。
2. 固体または半固体の媒体が必要な場合は、必要な量の寒天を追加します。固体培地の場合は、5 gの寒天を添加して、0.5 Lの培地に最終濃度1%を達成します。半固体培地の場合は、1 gの寒天を添加して、0.5 Lの培地に0.2%の最終濃度を達成します。
3. 脱イオン(DI)水で最終的な希望の量まで補充します。
4. ボトルを閉じ、振ってよく混ぜます。材料を完全に再懸濁する必要はありませんが、ボトルの底で一緒に固まっていないことを確認してください。キャップを緩め、敏感な培地サイクル(115°Cで15分間)でオートクレーブします。オートクレーブ前に成分を混合し、敏感な培地サイクルを使用することは、成分の凝集とショ糖のカラメル化を防ぐために推奨されます。
5. オートクレーブ後の培地を目視で調べます。塊が存在せず、媒体の色は琥珀色である必要があります(図2A)。
6. オートクレーブ後、培地を冷まして、ボトルを手で快適に保持できる温度にします。
7. L型の導入に培地が必要な場合は、この時点で抗生物質および/または溶解剤を添加します(例えば、最終濃度400 μg/mLのホスホマイシン、200 μg/mLのペニシリンG、400 μg/mLのD-サイクロセリン、100 μg/mLのアンピシリン、50 μg/mLのモエノマイシン、100 μg/mLのリゾチーム、または5 μg/mLのリソスタフィン)。.L型誘導剤の種類(または複数の薬剤が必要な場合は薬剤)と、試験した細菌種ごとにその濃度を経験的に確立します。
8. 個々のアリコートを準備するには、手袋を着用し、微生物学的な安全キャビネットで作業するか、ブンゼンバーナーを使用してください。培地は長期間のインキュベーションを必要とする場合があり、無菌性が最も重要です。
   1. 固体培地のアリコートを調製するには、25 mLを個々の92/16 mmシャーレに移し、固めます。.汚染のリスクを減らすために、プレートを直接注ぐのではなく、ピペッターを使用することをお勧めします。プレートを過度に乾燥させないでください。
   2. 半液体アリコートを調製するには、ピペッターを使用して5 mLの培地を複数の30 mLポリスチレンユニバーサル容器に移し、それらをセットします。
9. メディアはすぐに使用するか、使用前に最大1週間4°Cで保存してください。抗生物質を含む培地を保管する前に、化合物が時間の経過とともに分解されるため、濃度が低下する可能性があるため、メーカーの推奨事項を確認してください。

2. 尿中のL型単離

注:実験室の手順では、手袋と白衣を着用してください。微生物安全キャビネットで作業するか、ブンゼンバーナーを使用してください。ろ過中は安全グーグルを着用してください。

1. 尿サンプルの到着が予測される少なくとも1時間前に、70%エタノールで作業領域を拭き、必要な数の半液体LM培地アリコートを設定します。
   注: 実験室で誘導された 大腸菌 ST144¹⁰ L 型の懸濁液を、ヒトの尿サンプルではなく、液体 LM 培地で使用して、プロトコルを実証します。
2. サンプルを処理する前に、作業領域を70%エタノールで再度拭いてください。ベンチの片側に、必要な数の0.45 μLカットオフフィルター、20 mLシリンジ、およびサンプル数に等しい空の滅菌30 mLポリスチレンユニバーサル容器をレイアウトします。一部のサンプルを処理するために複数のフィルターが必要になる場合に備えて、予想される尿サンプルの数に加えて、いくつかの予備フィルターを追加します。LM培地アリコートと空の滅菌30 mLポリスチレンユニバーサル容器をベンチの中央にある安定したラックに置きます。顕微鏡検査を並行して実施する場合は、ガラス顕微鏡スライド、22 x 22 mmカバーガラス、2 μLおよび1 mLピペット、滅菌10 μLおよび1 mLチップ、滅菌1.5 mLチューブも準備し、ベンチマイクロ遠心分離機が利用可能であることを確認してください。
3. 尿サンプルは、サンプル中のL型細菌の劣化を防ぐために、提供後できるだけ早くドナーから検査室に輸送してください。
4. 手袋とゴーグルを着用し、尿サンプルを安全バッグから取り出し、エタノールをスプレーし、拭いてラックのLM培地アリコートと滅菌予備の30mLポリスチレン容器の近くに置きます。この時点から、一度に1つのサンプルを処理します。
5. LMミディアム、予備のポリスチレンユニバーサル容器、尿の入ったチューブが入ったチューブのキャップを緩めます。
6. シリンジをパッケージから取り出し、プランジャーを取り外して右側に置きます。
7. フィルターパッケージの背面から安全紙を引き出し、シリンジをフィルターにしっかりと取り付けます(フィルターを下向きにして個々のメーカーのプラスチックホルダーに入れ、無菌状態を維持してください)。
8. 迅速かつ慎重に作業し、LM培地のチューブからキャップを取り外して廃棄し、シリンジ付きのフィルターをチューブの上に置きます。
9. 尿サンプルからキャップを外し、シリンジに~10 mLを静かに注ぎ(ろ過されるのは2 mLのみですが、過剰な容量は飛散を防ぎます)、顕微鏡検査のために1 mL以上が残されていることを確認します。0.5mLのみを使用しますが、ろ過前にそのような容量を正確に測定することは現実的ではないため、おおよその余剰容量が保持されます。
10. プランジャーをシリンジの後ろに非常に慎重に置きます。プランジャーが完全に作動する位置に配置される前に、少量の抵抗が感じられ、このポイントを超えてサンプルがこぼれやすくなります。尿サンプルを処理する前に、水を使用して数回練習してください。
11. プランジャーをそっと押し、抵抗が大きくなるまで2mLの尿をフィルターに通します。サンプルがこぼれたり、フィルターが壊れたりしないように、圧力をかけすぎないように注意してください。サンプルが特に密度が高く、抵抗が大きすぎる場合は、サンプルを1つのフィルターに強制的に通すのではなく、複数のフィルターに通します。
12. LM培地が入ったチューブに対してフィルターを軽くたたいて、残っているろ過済みサンプルを取り除き、フィルターとシリンジを持ち上げ、予備の30 mLポリスチレンユニバーサル容器からキャップをLM培地とろ過済み尿が入ったチューブにすばやく置きます。フィルター、シリンジ、予備のポリスチレン容器は安全に廃棄してください。
13. サンプルを30°Cの静止位置で最大1か月間インキュベートします。これにより、フィルターを通過したL型は壁を再生し、壁状の細菌として増殖し始めることができます。
14. 成長の証拠がないか毎日サンプルを観察し、ろ過されたサンプルの入ったチューブを光源に当てます。陽性サンプルの場合、通常、成長は3〜7日以内に現れます。
15. 増殖が検出されたら、サンプルを微生物学的安全キャビネットまたはブンゼンバーナーの近くに移します。サンプルを開き、成長領域を目指して5μLのプラスチックループに慎重に浸し、次に浸透圧保護なしでサンプルを標準的な固体BHI培地に縞模様にして、単一のコロ^ニー22を得ることを目指します。
16. 同時に、ステップ3で説明したように、少量のサンプルを半液体媒体の一部(~5 μL)とともに顕微鏡で調べます。サンプルを培地と一緒に顕微鏡スライドに移すことで、サンプルにまだ存在する可能性のあるL型が破裂せず、検出できるようになります。ただし、この時点での細菌の大部分は壁状の形に戻り、通常の桿体または球菌として現れると予想されます。
17. BHIプレート上に縞模様にしたサンプルを37°Cの静止位置で一晩インキュベートします。
18. 増殖の証拠がないか調べ、5 μLループを使用して各プレートから1つのコロニーを選択し、5 mLの液体BHIに接種します。振とうしながら、37°Cで一晩インキュベートします。
19. 一晩培養してグリセロールストックを調製するか、好ましい方法(Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kitなど)を使用して種同定のためのDNAを単離します。

3. 位相差顕微鏡による尿サンプルのL型の存在検査

1. 残りの尿サンプル0.5 mLを微量遠心チューブに入れ、ベンチマイクロ遠心分離機で8,000 x g で1分間遠心します。
2. 上清を約20 μL残して静かに取り除き、ペレットを3回上下に静かにピペッティングして再懸濁します。
3. 1 μLをガラス顕微鏡スライドに置き、22 x 22 mmのカバースリップで覆います(5 μLのサンプル(ステップ2.16を参照)を検査するには、22 x 50 mmのカバースリップを使用して、カバースリップがスライドにしっかりと接着することを確認します)。滅菌脱脂綿パッドを使用してカバースリップをそっと押し下げてシールを作成し、カバースリップが動かないことを確認します。脱脂綿パッドを捨てます。
4. 100倍の位相コントラスト対物レンズを装備した顕微鏡を使用して、L型様構造の存在についてスライドを調べます(図3)。
   注:患者サンプル中のL型様構造の細菌起源を確認するために、細菌配列^10,23に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いた蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)によりサンプルを調べることが推奨される。

4. in vitroでのL型の導入

1. ストリーク壁細菌は、非浸透圧保護培地(例えばBHI)を含むプレート上の単一コロ^ニー22 に選択され、37°Cで一晩静止してインキュベートします。
2. 翌日、ステップ1で説明したように、選択したL型誘導剤を含む浸透圧保護LM培地を調製します。固体媒体で必要な数のプレートを準備します。
3. 滅菌済みの5 μLプラスチックループまたはつまようじを使用して、前夜にインキュベートした非浸透圧保護BHIプレートから十分な量(~4〜5コロニー相当)を選びます。
4. LMプレート上のバクテリアを、ループの平らな面(エッジではなく)を使用してストリークします。プレートの端で1回の連続動作でバクテリアに縞模様をし、プレートを90°回転させます。ループを最初のストリークの端に接触させ、連続的な動きで、ストリークをプレートの象限に広げ、複数の重なり合うストリークでバクテリアを徐々に希釈します(必要に応じてプレート全体を使用できます。プレートの象限のみを使用する場合は、他の象限を複数の誘導に使用できます)。
   注意: 図4A は、ストリーキングの方向を概略的に示しています。ここでの目的は、単一のコロニーではなく、できるだけ多くの純粋なL型を含む成長領域を取得することです。そのため、ストリーク間のループを変更する必要はありません。L型が1コロニーで得られるのは非常に難しく、使用する細菌の数が少なすぎると、L型が全く増殖しなくなる可能性があります。一方、誘導に使用された壁のある細菌が多すぎると、すべての細菌が切り替えを受けるわけではなく、一部の細菌はまだ壁を保持している可能性があります。最適なL型の成長領域は、通常、ストリークの途中で検出できます。
5. プレートをビニール袋などの容器に入れて乾燥を防ぎ、30°Cでインキュベートします(一部の細菌種のL型は嫌気性条件下でよりよく増殖する可能性があるため、嫌気性チャンバーでL型をより効率的に増殖させることができます)。毎日プレートを調べて、成長の証拠を探します。これは通常、3〜7日以内に現れます。成長量は株によって異なります。L型の成長の例を 図4Bに示します。
6. 顕微鏡でL型の存在を確認します。2 μLの液滴であるLM培地を顕微鏡スライドに置き、ピペットチップを使用してストリークの中央から少量の細胞を取り出し、液滴に再懸濁します。
   1. 22 x 22 mmのカバーガラスで覆い、100倍の位相コントラスト対物レンズを備えた顕微鏡を使用してL型の存在を調べます。代表的な例を 図4Cに示します。

結果

スクロースを含むL型培地は、オートクレーブ後にさまざまな程度のカラメル化を受けることがあり、これは色の変化に関連しています。 図 2 は、スクロースを含む培地をオートクレーブした場合の代表的な結果を示しています。 図2A は、オートクレーブ後に色が琥珀色に変わったLM培地の典型的な例を示しています。 図2B は、オートクレーブ後の1.16 Mショ糖溶液(LM培地の作製に必要な濃度の2倍)の典型的な例を示しています。時折、LM培地またはスクロースはオートクレーブ中に広範なカラメル化を受けることがあり、このような場合に培地を使用することはお勧めしません。 図2C は、過剰にキャラメリゼされたショ糖培地の例を示しています。

L型細菌は非常に不均一である可能性があり、図3は患者の尿サンプルで観察可能なL型様構造の例を示しています。尿サンプル中に見られるL型様構造の細菌起源を確認するために、細菌配列を標的とする蛍光プローブを備えたFISHが推奨される^10,23。

実験室条件下で誘導されるL型の成長レベルは、株特異的です。 図4B は 枯草菌の L型成長の例を示し、 図4C は 図4Bで誘導されたL型の外観を示しています。

図1:ろ過法によるL型分離 - 概略図。 尿サンプルは、0.45 μm フィルターを通過し、0.2% 寒天を添加した浸透圧保護 LM 培地を含むポリスチレン万能容器に入れます。その後、サンプルを30°Cの定常位置で最大1ヶ月間インキュベートし、成長の証拠がないか毎日目視でチェックします。このインキュベーション期間により、サンプル中に存在する任意のL型が細胞壁を再生させることができます。増殖が検出されたら、細菌を通常の固体の非浸透圧保護培地(栄養寒天培地や脳心注入など)を含むプレート上に再度線条状にして、単一のコロニーを分離し、DNA抽出とシーケンシングを行って単離された細菌種を同定できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:L字型メディア。 (A)オートクレーブ後のLM培地。(B)オートクレーブ後の1.16 Mスクロース(2 x 濃度)。(C)広範囲にキャラメリゼされたLMメディウム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:位相差顕微鏡法により再発性尿路感染症患者の尿中に観察できるL型様構造の例。 (A,B)尿中に浮遊する細菌のL型を分割する典型的な構造。(C,D)真核細胞に関連する細菌のL型を分裂させる典型的な構造。(E,F)グラム陰性L型に特徴的な三日月形の構造(赤矢印)。(F,G)壁細胞とL型との間の遷移の中間段階に典型的な構造( Gの赤い矢印)。(H)大きなL型に典型的な細胞内小胞。スケールバー = 5 μm。この数値は¹⁰から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:固体媒体上にL型を誘導するためのストリークプレート技術。 (A)L型を誘導するためのプレートの4分の1を使用したストリーキングバクテリアの概略図。矢印は、バクテリアを縞模様にする方向を示しています。(B)30°Cで3日間のインキュベーション後、(A)に示すように、ストリーキング後の枯草菌のL型増殖の一例。(C)(B)で誘導されたL型を位相差顕微鏡で可視化。スケールバー = 5 μm. パネルBとCは¹⁶から変更されています この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この原稿に記載されているプロトコルは、ヒト尿からさまざまな細菌種のL型を分離し、処理するために使用されています。これには、大腸菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、クレブシエラ、シュードモナス、エンテロコッカス、エンテロバクター属が含まれ、これらはすべて通常UTIに関連しています^10,24。.しかし、ある研究室で確立されたL型の取り扱い方法が、別の研究室ではすぐにはうまくいかないかもしれませんし、ある細菌株に効くものが別の菌株には効かないかもしれません。したがって、ここで説明するプロトコルは、複数回の試行と追加の最適化が必要になる可能性があります。特に、培地の必要栄養素、酸素の利用可能性、浸透圧保護剤の濃度、流動性をテストする必要がある場合があります。L型への移行と成長に最適な条件は、同じ種の壁状型の成長に最適な条件とは異なる可能性があります。さらに、プロトコルを試行する際には、いくつかの技術的な問題が発生する可能性があります。

L型培地の調製に関連する一般的な問題は、オートクレーブ後のスクロースカラメル化です。培地の色が暗褐色に変わった場合は、廃棄して新しいバッチを準備する必要があります。スクロースを1つのボトルで水で調製し、残りの成分を別のボトルで、両方とも2倍の濃度で調製する必要がある場合があります。その後、オートクレーブ後に2倍濃縮溶液を1:1の比率で組み合わせて、目的の最終濃度を達成できます。スクロースを別々にオートクレーブすると、色がわずかに黄色に変わることがあり(図2B)、これは許容されますが、暗褐色に変色する場合(図2C)は実験に使用しないでください。オートクレーブサイクルの長さと温度を調整することは、ショ糖のカラメル化を軽減するために必要になる場合があります。調整されたオートクレーブサイクルを使用して調製した培地の無菌性を試験し、各培地のアリコートを37°Cで少なくとも3日間インキュベートすることにより、試験することをお勧めします。最後に、カラメル化の問題が続く場合は、塩などの代替浸透圧保護剤をテストする必要があるかもしれません¹⁸。

また、患者サンプルからのL型単離中にも、いくつかの問題が発生することがあります。プロトコルに記載されているように、サンプルに存在するL型は潜在的に劣化する可能性があります。そのため、寄贈後はできるだけ早くサンプルを研究室に輸送することが重要です。同じ理由で、サンプルを低温で保存したり、サンプルの組成を変更したり(PBSの添加など)することは強く推奨されません。

ろ過方法自体には限界があります。一部のL字型は、フィルターを通る媒体の流れによって発生するせん断力により引き裂かれる場合があります。Mickiewiczらによる研究では、実験室で誘導された 大腸菌 のL型を含む対照サンプルのL型のうち、フィルターを通過したのはわずか41%でした¹⁰。これは、ろ過法が陽性サンプルの数を過小評価する可能性があり、定量的研究には推奨されないことを示しています。

非常にまれなケースでは、ろ過後、翌日にはL型単離に使用される半液体培地アリコートで有意な成長が観察される場合があります。これは、プロトコール中にフィルターが壊れて壁のある細菌が通過したか、サンプルが汚染されたことを示している可能性があります。そのようなサンプルを廃棄するか、少なくとも注意して扱うことをお勧めします。サンプルの毎日の目視検査は、誤検知を防ぐために重要です。ろ過によって尿サンプルを処理する前に、実験室で誘発されたL型、壁型細菌、滅菌培地のいくつかのサンプルを選択したフィルターに通し、L型分離の効率を制御し、フィルターの破損による壁状細菌の潜在的な通過を制御し、使用される滅菌技術がうまく機能していることを確認することをお勧めします。

まれに、安定なL型がろ過によって単離され、顕微鏡で検出できる壁状の型がない場合があります。生存可能なL型細菌を維持するためには、増殖の効率に応じて、サンプルのいくつかの「ループフル」を新鮮な半液体LM培地を含むチューブに移すか、3〜7日ごとに固体浸透圧保護培地に再度ストリークすることをお勧めします。数回の継代後に壁状の形態が現れない場合は、サンプルを 40% グリセロールで -80 °C で凍結して分離物を保存することができます。ただし、一部のL型はそのような手順に十分耐えられない場合があります。

その制限にもかかわらず、ろ過方法は、患者サンプルの壁状形態からL型を分離するためにこれまでに使用された唯一の方法です。これにより、in vivoでL型スイッチングが可能な細菌株の同定が可能になります。他の種類のヒトまたは環境サンプル(血液や植物など)からL型を分離するためのろ過方法を開発し、適応させる可能性があります。

上記のすべての考慮事項を考慮すると、この原稿で概説されているプロトコルは、厳格な指示としてではなく、個々のラボでカスタマイズされたL型プロトコルを開発するための良い出発点として推奨します。Lフォームでの作業には、細心の注意、献身、忍耐が必要ですが、練習すれば、非常にやりがいのあるものになります。この原稿で概説されているガイドラインが、L型プロトコルを開発するためのベンチマークとなり、これらの魅力的な細菌型を調査するための基礎研究グループや臨床研究グループを奨励することを願っています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µL cut off filters	Sarstedt	83.1826
20 mL syringes	Fisher	17955460
30 mL polystyrene universal tubes	Starlab	E1412-3010
92 x 16 mm Petri Dishes	Starstedt	82.1473
Agar	Oxoid	LP0011
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135
Cover slips (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)	VWR	631-0137/-0125
D-cycloserine	Sigma-Aldrich	C6880
Glass microscope slides	VWR	631-1550P
Lysostaphin	Sigma-Aldrich	L7386
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L4919
MgSO4	VWR	25165.26
Moenomycin	Sigma-Aldrich	32404
Penicillin G	Sigma-Aldrich	13752
Phosphomycin	Sigma-Aldrich	P5396
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100