使用过滤法从尿液中分离 L 型细菌

摘要

在这里，我们提出了一种使用过滤方法从尿液中分离 L 型细菌的方案。还描述了制备 L 型培养基、通过相差显微镜观察 L 型和在实验室条件下诱导 L 型的补充方法。

摘要

细菌向 L 型状态的转变被认为可能在细胞壁靶向抗生素治疗期间的免疫逃避和细菌持久性中发挥作用。然而，分离和处理 L 型细菌具有挑战性，主要是因为它们对渗透压变化高度敏感。在这里，我们描述了制备 L 型培养基、使用过滤方法从尿液中分离 L 型、通过相差显微镜检测尿液样品中的 L 型以及在体外诱导 L 型的详细方案。L 型存活和生长的确切要求可能因菌株而异。因此，此处介绍的方法旨在作为在单个实验室内建立 L 型方案的基本指南，而不是作为精确的说明。过滤方法可导致样品中 L 型的数量减少，不应用于定量。然而，这是迄今为止用于有效分离细胞壁缺陷变异与其壁对应物以及鉴定细菌菌株的唯一方法，这些菌株能够在尿路感染患者中进行 L 型转换。该过滤方法有可能适用于从其他类别细菌感染患者和环境样本中分离 L 型。

引言

几乎所有细菌都被一种称为细胞壁的结构所包围。墙壁对于抵御环境压力很重要，有助于正常分裂并赋予细菌形状¹。然而，壁也是部分免疫系统和一些最好和最常用的抗生素（包括青霉素 ^2,3）的目标。尽管它很重要，但革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌偶尔可以在没有壁的情况下存活 ^4,5,6,7,8。如果周围条件提供足够的渗透保护以防止它们破裂，并且还存在细胞壁靶向剂，细菌可以转变为无壁状态，称为 L 型 4,5,6,7,8。

大量报告表明，转变为 L 型状态并返回带壁状态在体内可能很重要，因为细菌在宿主免疫系统的攻击和细胞壁靶向抗生素治疗中存活的机制 9,10,11,12,13,14,15。这种转变可能为细菌感染的复发提供强大的策略 9,10,11,12,13,14,15。了解 L 型细菌的基本生物学特性及其与宿主的相互作用对于破译它们在发病机制中的作用至关重要。然而，处理 L 型细菌具有挑战性。

首先，由于缺乏细胞壁，L 型细菌容易因渗透压的变化而破裂。此外，L 型以高度不规则的方式分裂，具有不可预测的生长模式（通常比带壁的对应物慢得多），并且根据应变，可能在半液体而不是固体或液体介质上传播得更好。上述所有考虑都使增长率的量化和比较变得困难。不同的细菌种类（甚至菌株）对 L 型转换和生长具有不同的代谢要求。例如，某些依赖于有氧呼吸的革兰氏阳性菌的 L 型细菌比其壁细菌对活性氧更敏感¹⁶。

在实验室条件下和宿主中诱导 L 型通常由细胞壁靶向剂（如抗生素和溶菌酶⁹）驱动。这种处理可能只导致部分细胞壁损失，因此样品中可能存在一些带壁（或部分壁）的细菌，因此很难区分观察到的任何实验结果是由于细菌的 L 型还是壁型的存在。体内诱导的 L 型的频率往往很低，这意味着它们可能难以发现和分离。最后，由于它们的多态性形态，L 型很容易在原位与真核来源的结构（例如凋亡小体或各种颗粒）混淆。

自 1935 年¹⁷ 被发现以来，已经开发了几种在实验室中处理 L 型的方法。其中大多数依赖于向生长培养基中添加渗透保护剂;通常是糖或盐 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。如上所述，L 型通常与患者样本中的壁细菌并存，因此很难将两个群体分开。然而，已经证明，与带壁细菌不同，L 型细菌由于其柔韧性和可变大小而可以通过 0.45 μm 过滤器。已采用一种使用这种过滤器的方法从尿液中分离 L 型 10,19,20,21。

在这里，我们提出了一种使用过滤方法从尿液中分离 L 型细菌的方案（图 1）。还描述了制备 L 型培养基、L 型的显微镜观察和体外诱导 L 型的补充方案。

研究方案

1. L 型培养基 （LM） 的制备

1. 在玻璃瓶中称取蔗糖（调整量以达到最终浓度 0.58 M）、MgSO₄ （最终浓度 8 mM）和脑心输液 （BHI）（供应商推荐的量），玻璃瓶的大小是所需培养基体积的两倍。要制备 0.5 L 培养基，请称取 100 g 蔗糖、1 g MgSO₄ 和 18.5 g BHI，然后放入 1 L 玻璃瓶中。这将允许在高压灭菌之前更容易地重新悬浮成分。
2. 如果需要固体或半固体培养基，请添加所需量的琼脂。对于固体培养基，加入 5 g 琼脂，在 0.5 L 培养基中达到 1% 的最终浓度。对于半固体培养基，加入 1 g 琼脂，在 0.5 L 培养基中达到 0.2% 的最终浓度。
3. 用去离子 （DI） 水加满至最终所需的体积。
4. 盖上瓶子，摇晃充分混合。无需完全重新悬浮成分，只需确保它们不会在瓶底聚集在一起即可。在敏感的介质循环（115°C，15 分钟）上松开盖子和高压灭菌器。建议在高压灭菌前混合成分并使用敏感的培养基循环，以防止成分结块和蔗糖焦糖化。
5. 高压灭菌后目视检查培养基。不应存在团块，培养基应为琥珀色（图 2A）。
6. 高压灭菌后，让培养基冷却至可以舒适地用手握住瓶子的温度。
7. 如果需要培养基来诱导 L 型，此时添加抗生素和/或裂解剂（例如，终浓度为 400 μg/mL 的磷酸霉素、200 μg/mL 的青霉素 G、400 μg/mL 的 D-环丝氨酸、100 μg/mL 的氨苄青霉素、50 μg/mL 的莫烯霉素、100 μg/mL 的溶菌酶或 5 μg/mL 的溶葡萄球菌酶）。根据经验确定 L 型诱导剂的类型（如果需要多种，则为试剂）及其对每种测试细菌物种的浓度。
8. 要准备单独的等分试样，请戴上手套并在微生物安全柜中工作或使用本生灯。培养基可能需要长时间孵育，无菌性至关重要。
   1. 要制备等分试样的固体培养基，请将 25 mL 转移至单独的 92/16 mm 培养皿中，并让其凝固。建议使用移液器而不是直接倾倒板，以降低污染风险。不要过度干燥板。
   2. 要制备半液体等分试样，使用移液器将 5 mL 培养基转移到多个 30 mL 聚苯乙烯通用容器中，并凝固。
9. 立即使用培养基或在 4 °C 下储存长达一周。在储存含有抗生素的培养基之前，请查看制造商的建议，因为化合物会随着时间的推移而降解，因此浓度可能会降低。

2. 从尿液中分离 L 型

注意：在实验室程序中戴上手套和实验服。在微生物安全柜中工作或使用本生灯。过滤时佩戴安全护目镜。

1. 至少在预测的尿液样品到达前 1 小时，用 70% 乙醇擦拭工作区域，并列出所需数量的半液体 LM 培养基等分试样。
   注意：将使用在实验室中在液体 LM 培养基中诱导的大 肠杆菌 ST144¹⁰ L 型悬浮液，而不是人尿液样本，来演示该方案。
2. 在处理样品之前，用 70% 乙醇再次擦拭工作区域。在工作台的一侧，放置所需数量的 0.45 μL 截止过滤器、20 mL 注射器和几个等于样品数量的空无菌 30 mL 聚苯乙烯通用容器。在预期尿液样本的数量上添加几个备用过滤器，以防需要多个过滤器来处理某些样本。将 LM 培养基等分试样和清空无菌 30 mL 聚苯乙烯通用容器放在工作台中间的稳定架子上。如果要同时进行显微镜检查，还要准备玻璃显微镜载玻片、22 x 22 mm 盖玻片、2 μL 和 1 mL 移液器、无菌 10 μL 和 1 mL 吸头、无菌 1.5 mL 试管，并确保有台式微量离心机。
3. 捐献后应尽快将尿液样本从供体运送到实验室，以防止样本中 L 型细菌可能变质。
4. 戴上手套和护目镜，从安全袋中取出尿样，用乙醇喷洒，擦拭并放在架子上，靠近 LM 培养基等分试样和无菌备用 30 mL 聚苯乙烯容器。从此时开始，一次处理一个样品。
5. 松开装有 LM 培养基的试管、备用聚苯乙烯通用容器和装有尿液的试管上的盖子。
6. 从包装中取出注射器，取下柱塞并放在您的右侧。
7. 从过滤器包装的背面拉出安全纸，并将注射器牢固地连接到过滤器上（将过滤器正面朝下放在各个制造商的塑料支架中，以确保其保持无菌状态）。
8. 快速但小心地工作，从 LM 培养基管中取出并丢弃盖子，然后将带有注射器的过滤器放在管子顶部。
9. 取下尿液样本的盖子，轻轻地将 ~10 mL 倒入注射器中（仅过滤 2 mL，但多余的体积可防止飞溅），确保留下超过 1 mL 用于显微镜检查。仅使用 0.5 mL，但在进行过滤时精确测量这样的体积是不切实际的，因此会保留大致多余的体积。
10. 非常小心地将柱塞放入注射器的背面。在将柱塞置于完全运行的位置之前，可以感觉到少量阻力，并且很容易将样品溢出超过此点。在处理尿液样本之前，用水练习几次。
11. 轻轻按压柱塞，将 2 mL 尿液通过过滤器，直到感觉到阻力增加。小心不要施加太大的压力，以防止样品溢出和过滤器破裂。如果样品特别致密并产生太大的阻力，请让样品通过多个过滤器，而不是强迫它通过一个过滤器。
12. 将过滤器轻轻敲击含有 LM 培养基的试管，以去除任何剩余的过滤样品，提起过滤器和注射器，将备用 30 mL 聚苯乙烯通用容器的盖子快速放在装有 LM 培养基和过滤尿液的试管上，确保不要用盖子的边缘接触试管内部。安全处理过滤器、注射器和备用聚苯乙烯容器。
13. 将样品在 30 °C 的固定位置孵育长达 1 个月。这将允许通过过滤器的 L 型再生其壁并开始生长为壁细菌。
14. 每天观察样品是否有生长的证据，将装有过滤样品的试管对着光源。对于阳性样本，生长通常在 3 到 7 天内出现。
15. 一旦检测到生长，将样品转移到微生物安全柜或本生灯附近。打开样品，小心地浸入 5 μL 塑料环中，瞄准生长区域，然后在无渗透保护的标准固体 BHI 培养基上对样品进行划线，以获得单个菌落²²。
16. 同时，如步骤 3 中所述，在显微镜下检查少量样品以及一小部分半液体培养基 （~5 μL）。将样品与培养基一起转移到显微镜载玻片上，将确保样品中可能仍然存在的任何 L 形不会爆裂并且可以被检测到。然而，此时的大多数细菌预计已经恢复到有壁的形式，并表现为规则的杆状或球菌。
17. 将BHI板上划线的样品在37°C下固定孵育过夜。
18. 检查生长证据，使用 5 μL 定量环从每个板中挑选一个菌落，然后接种到 5 mL 液体 BHI 中。在 37 °C 下孵育过夜，同时振荡。
19. 使用过夜培养物制备甘油原液或使用首选方法（例如，Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit）分离DNA以进行物种鉴定。

3. 通过相差显微镜检查尿液样本是否存在 L 型

1. 将剩余的 0.5 mL 尿液样品放入微量离心管中，并在台式微量离心机中以 8,000 x g 离心 1 分钟。
2. 轻轻去除上清液，留下约 20 μL，然后轻轻上下吹打 3 次，重悬沉淀。
3. 将 1 μL 放在显微镜玻璃载玻片上，并用 22 x 22 mm 盖玻片盖住（要检查 5 μL 样品（参见步骤 2.16），请使用 22 x 50 mm 盖玻片确保盖玻片能很好地粘附在载玻片上）。使用无菌棉棉垫轻轻按压盖玻片以形成密封并检查盖玻片是否无法移动。丢弃棉絮垫。
4. 使用配备 100 倍相差物镜的显微镜检查载玻片是否存在 L 型样结构（图 3）。
   注：为了确认患者样本中 L 型样结构的细菌来源，建议使用对细菌序列^10,23 具有特异性的寡核苷酸探针通过荧光原位杂交 （FISH） 检查样本。

4. 体外诱导 L 型

1. 在含有非渗透保护性培养基（例如 BHI）的平板上将选择的壁细菌划线到单个菌落²² ，并在 37 °C 下固定孵育过夜。
2. 第二天，制备渗透保护性 LM 培养基，其中包含步骤 1 中所述的所选 L 型诱导剂。用固体培养基准备所需数量的板。
3. 使用无菌的 5 μL 塑料定量环或牙签，从前一天晚上孵育的非渗透保护性 BHI 板中挑选大量（~4-5 个菌落）。
4. 使用环的平坦表面（而不是边缘）在 LM 板上划线细菌。在板的边缘连续移动一次，将细菌划线，然后将板旋转 90°。将环触摸到第一条条纹的边缘，然后以连续运动将条纹涂抹在板的一个象限上，逐渐稀释具有多个重叠条纹的细菌（如果需要，可以使用整个板。如果仅使用板的一个象限，则其他象限可用于多次诱导）。
   注意： 图 4A 示意性地显示了条纹的方向。这里的目标是获得包含尽可能多的纯 L 型的生长区域，而不是单个菌落。因此，无需更改 streaks 之间的循环。L 型的单个菌落可能非常难以获得，并且使用太少量的细菌可能会导致根本没有 L 型生长。另一方面，如果使用了太多的壁细菌进行诱导，并不是所有的细菌都会经历转换，有些细菌可能仍然保留壁。最好的 L 形生长区域通常可以在条纹的中间检测到。
5. 将板放入塑料袋或其他容器中以防止其干燥并在 30 °C 下孵育（某些细菌种类的 L 型可能在厌氧条件下生长得更好，因此可以测试厌氧室以实现更有效的 L 型生长）。每天检查板是否有生长的证据。这通常在 3 到 7 天内出现。生长量是菌株特异性的。L 型生长的示例如图 4B 所示。
6. 使用显微镜确认 L 形的存在。将 2 μL LM 培养基液滴放在显微镜载玻片上，使用移液器吸头从条纹中间挑选少量细胞，然后重悬于液滴中。
   1. 用 22 x 22 mm 盖玻片覆盖，并使用具有 100 倍相差物镜的显微镜检查是否存在 L 形。 图 4C 中是一个具有代表性的示例。

结果

含有蔗糖的 L 型培养基在高压灭菌后会发生不同程度的焦糖化，这与颜色变化有关。 图 2 显示了含有蔗糖的高压灭菌培养基的代表性结果。 图 2A 显示了 LM 培养基的典型示例，该培养基在高压灭菌后已变为琥珀色。 图 2B 显示了高压灭菌后 1.16 M 蔗糖溶液（制备 LM 培养基所需的 2 倍浓度）的典型示例。有时，LM 培养基或蔗糖在高压灭菌过程中可能会发生广泛的焦糖化，如果发生这种情况，不建议使用该培养基。 图 2C 显示了过度焦糖化蔗糖培养基的示例。

L 型细菌可能具有高度异质性，图 3 显示了在患者尿液样本中观察到的 L 型样结构的示例。为了确认尿液样本中发现的 L 型样结构的细菌来源，建议使用靶向细菌序列的荧光探针^{FISH 10,23}。

在实验室条件下诱导的 L 型的生长水平是菌株特异性的。 图 4B 显示了 枯草芽孢杆菌 L 型生长的一个例子， 图 4C 显示了 图 4B 中诱导的 L 型的微观外观。

图 1：使用过滤法分离 L 型 - 示意图。 将尿液样品通过 0.45 μm 过滤器进入聚苯乙烯通用容器中，该容器中含有补充有 0.2% 琼脂的渗透保护性 LM 培养基。然后将样品在 30 °C 的固定位置孵育长达一个月，并每天目视检查是否有生长迹象。此孵育期允许样品中存在的任何 L 型细胞壁再生。一旦检测到生长，就可以在含有常规、固体、非渗透保护性培养基（如营养琼脂或脑心脏输注）的平板上重新划线，以分离单个菌落，然后进行 DNA 提取和测序以鉴定分离的细菌种类。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：L 型介质。 （A） 高压灭菌后的 LM 培养基。（B） 高压灭菌后 1.16 M 蔗糖（2 x 浓度）。（C） 广泛焦糖化的 LM 培养基。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：通过相差显微镜在复发性 UTI 患者的尿液中观察到的 L 型样结构示例。 （A，B）悬浮在尿液中的分裂细菌 L 型的典型结构。（C，D）与真核细胞相关的分裂细菌 L 型的典型结构。（东、女）革兰氏阴性 L 型的新月形结构特征（红色箭头）。（F，G）壁细胞和 L 型之间过渡中间阶段的典型结构（ G 中的红色箭头）。（H） 大 L 型的典型细胞内囊泡。比例尺 = 5 μm。此数字已从¹⁰ 修改。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：在固体培养基上诱导 L 型的条纹板技术。 （A） 使用四分之一板诱导 L 型的条纹细菌的示意图。箭头指示细菌划线的方向。（B） 在 30 °C 下孵育 3 天后，枯 草芽孢杆菌 L 型在条纹后生长的实例，如 （A） 所示。（C） 在 （B） 中诱导的 L 型通过相差显微镜观察。比例尺 = 5 μm。图 B 和 C 已从¹⁶ 修改 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

本手稿中描述的方案已用于从人尿液中分离和处理各种细菌种类的 L 型，包括大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌、克雷伯菌、假单胞菌、肠球菌和肠杆菌属，所有这些通常都与 UTI 有关^10,24.然而，在一个实验室建立的处理 L 型的方法在另一个实验室中可能无法立即起作用，并且对一种细菌菌株有效的方法可能不适用于另一种细菌菌株。因此，此处描述的协议可能需要多次尝试和额外的优化。特别是，可能需要测试培养基的营养需求、氧气可用性、渗透保护剂浓度和流动性。L 型过渡和生长的最佳条件可能与同一物种的壁式生长的最佳条件不同。此外，在尝试协议时可能会遇到一些技术问题。

与 L 型培养基制备相关的一个常见问题是高压灭菌后的蔗糖焦糖化。如果培养基变成深棕色，则应丢弃并准备新的批次。可能需要在一个瓶子中制备蔗糖中的水中，在另一个瓶子中制备剩余的成分，两者的浓度均为 2 倍。高压灭菌后，可以将 2x 浓缩溶液以 1：1 的比例混合，以达到所需的最终浓度。单独高压灭菌的蔗糖可能会变成微黄色（图 2B），这是可以接受的，但如果它变成深棕色（图 2C），则不应用于实验。调整高压灭菌周期的长度和温度对于减轻蔗糖焦糖化可能是必要的。建议通过将每种培养基的等分试样在 37 °C 下孵育至少 3 天，测试使用调整后的高压灭菌循环制备的培养基的无菌性。最后，如果焦糖化问题仍然存在，则可能需要测试替代的渗透保护剂，例如盐¹⁸。

从患者样本中分离 L 型时，可能还会遇到几个问题。如实验方案中所述，样品中存在的 L 型可能会变质;因此，捐献后尽快将样本运送到实验室非常重要。出于同样的原因，强烈建议不要在低温下储存样品或改变样品成分（例如通过添加 PBS）。

过滤方法本身有其局限性。由于介质流经过滤器时产生的剪切力，一些 L 形可能会被撕裂。在 Mickiewicz 等人的研究中，含有实验室诱导 的大肠杆菌 L 型的对照样品中只有 41% 的 L 型通过过滤器¹⁰。这表明过滤方法会导致低估阳性样品的数量，因此不建议用于定量研究。

在极少数情况下，过滤后，第二天可能会在用于 L 型分离的半液体培养基等分试样中观察到显著增长。这可能表明过滤器在实验步骤期间破裂，允许壁细菌通过，或者样品被污染。最好丢弃此类样本或至少谨慎处理它们。对样品进行日常目视检查对于防止假阳性至关重要。在通过过滤处理尿液样本之前，建议将实验室诱导的 L 型、壁状细菌和无菌培养基的几个样品通过所选过滤器，以控制 L 型分离的效率、由于过滤器破损而可能导致壁状细菌通过，并确保所使用的无菌技术运行良好。

在极少数情况下，稳定的 L 型可以通过过滤分离出来，显微镜检查无法检测到壁状。为了保持活的 L 型细菌，建议将几个“满环”的样品转移到含有新鲜半液体 LM 培养基的试管中，或每 3-7 天在固体渗透保护培养基上重新划线，具体取决于生长效率。如果多次传代后没有出现壁状形式，则可以尝试在 –80 °C 下用 40% 甘油冷冻样品以保存分离物;然而，一些 L 型可能不能很好地耐受这种手术。

尽管存在局限性，但过滤方法是迄今为止唯一用于分离患者样本中 L 型和壁型的方法。它允许识别能够在体内进行 L 型转换的细菌菌株。有可能开发和调整过滤方法，以便从其他类型的人类或环境样品（例如血液或植物）中分离 L 型。

考虑到上述所有考虑因素，我们建议将本手稿中概述的方案作为在单个实验室中开发定制 L 型方案的良好起点，而不是作为僵化的说明。使用 L 表格需要非常小心、奉献和耐心，但通过练习，它可以非常有益。我们希望本手稿中概述的指南将成为开发 L 型方案的基准，并鼓励更多基础和临床研究小组研究这些迷人的细菌形式。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µL cut off filters	Sarstedt	83.1826
20 mL syringes	Fisher	17955460
30 mL polystyrene universal tubes	Starlab	E1412-3010
92 x 16 mm Petri Dishes	Starstedt	82.1473
Agar	Oxoid	LP0011
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135
Cover slips (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)	VWR	631-0137/-0125
D-cycloserine	Sigma-Aldrich	C6880
Glass microscope slides	VWR	631-1550P
Lysostaphin	Sigma-Aldrich	L7386
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L4919
MgSO4	VWR	25165.26
Moenomycin	Sigma-Aldrich	32404
Penicillin G	Sigma-Aldrich	13752
Phosphomycin	Sigma-Aldrich	P5396
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100