בידוד חיידקים בצורת L מהשתן בשיטת סינון

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חיידקים בצורת L מהשתן, בשיטת סינון. מתוארות גם שיטות משלימות להכנת מדיום בצורת L, תצפית על צורות L על ידי מיקרוסקופ ניגוד פאזה ואינדוקציה של צורות L בתנאי מעבדה.

Abstract

מעבר של חיידקים למצב צורת L נחשב כממלא תפקיד אפשרי בהתחמקות חיסונית ובהתמדה חיידקית במהלך טיפול באנטיביוטיקה המכוונת לדופן התא. עם זאת, בידוד וטיפול בחיידקים בצורת L הוא מאתגר, בעיקר בשל רגישותם הגבוהה לשינויים באוסמולריות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים להכנת מדיום בצורת L, בידוד צורות L משתן בשיטת סינון, זיהוי צורות L בדגימות שתן על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ואינדוקציה של צורות L במבחנה. הדרישות המדויקות להישרדות וצמיחה של צורות L עשויות להשתנות מזן לזן. לכן, השיטות המוצגות כאן נועדו לשמש כקווים מנחים בסיסיים לקביעת פרוטוקולים בצורת L בתוך מעבדות בודדות, ולא כהוראות מדויקות. שיטת הסינון יכולה להוביל להפחתה במספר צורות ה-L בדגימה ואין להשתמש בה לכימות. עם זאת, זוהי השיטה היחידה ששימשה עד כה להפרדה יעילה של וריאנטים חסרי דופן התא מעמיתיהם בעלי הקירות ולזיהוי זני חיידקים, המסוגלים להחליף צורת L בחולים עם דלקות בדרכי השתן. לשיטת הסינון יש פוטנציאל להתאים לבידוד צורות L מחולים עם קטגוריות אחרות של זיהומים חיידקיים ומדגימות סביבתיות.

Introduction

כמעט כל החיידקים מוקפים במבנה שנקרא דופן התא. הקיר חשוב להגנה מפני לחצים סביבתיים, מסייע בחלוקה קבועה ומעניק לחיידקים את צורתם¹. עם זאת, הקיר הוא גם מטרה לחלקים ממערכת החיסון ולכמה מהאנטיביוטיקות הטובות והנפוצות ביותר, כולל פניצילין ^2,3. למרות חשיבותו, גם חיידקים גראם חיוביים וגם חיידקים גראם-שליליים יכולים לשרוד מדי פעם ללא הקיר 4,5,6,7,8. אם התנאים שמסביב מספקים מספיק הגנה אוסמולוגית כדי למנוע מהם להתפוצץ וקיימים גם חומרים מכוונים לדופן התא, חיידקים יכולים לעבור למצב חסר דופן, המכונה צורת L 4,5,6,7,8.

דיווחים רבים מצביעים על כך שמעבר למצב בצורת L וחזרה למצב חומה עשוי להיות חשוב in vivo כמנגנון לחיידקים לשרוד הן את ההתקפה של מערכת החיסון המארחת והן את הטיפול באנטיביוטיקה המכוונת לדופן התא 9,10,11,12,13,14,15. מעבר כזה מספק אסטרטגיה רבת עוצמה להישנות זיהום חיידקי 9,10,11,12,13,14,15. הבנת הביולוגיה הבסיסית של חיידקים בצורת L והאינטראקציות שלהם עם המארח הם קריטיים לפענוח תפקידם בפתוגנזה. עם זאת, הטיפול בחיידקים בצורת L הוא מאתגר.

ראשית, בגלל היעדר דופן התא, חיידקים בצורת L נוטים להתפוצץ בתגובה לשינויים באוסמולריות. בנוסף, צורות L מתחלקות בצורה מאוד לא סדירה, יש להן דפוסי צמיחה בלתי צפויים (בדרך כלל הרבה יותר איטיים ממקבילותיהן המוקפות דפנות) ובהתאם למתח, עשויות להתפשט טוב יותר על מדיה נוזלית למחצה, ולא על מדיה מוצקה או נוזלית. כל השיקולים לעיל מקשים על כימות והשוואה של שיעורי הצמיחה. למיני חיידקים שונים (או אפילו לזנים) יש דרישות מטבוליות מגוונות להחלפה וצמיחה של צורת L. לדוגמה, צורות L של חיידקים גראם-חיוביים מסוימים, המסתמכים על נשימה אירובית, רגישים יותר למיני חמצן תגובתיים מאשר עמיתיהם המוקפים בקירות¹⁶.

אינדוקציה של צורות L בתנאי מעבדה ובמארח מונעת בדרך כלל על ידי חומרים מכוונים לדופן התא, כגון אנטיביוטיקה וליזוזים⁹. טיפול כזה עלול לגרום לאובדן חלקי בלבד של דופן התא ולכן כמה חיידקים בעלי דופן (או דופן חלקית) יכולים להיות נוכחים בדגימות, מה שמקשה על ההבחנה אם תוצאות ניסוי כלשהן שנצפו נובעות מנוכחות של צורות L או צורות דופן של חיידקים. התדירות של צורות L המושרות in vivo נוטה להיות נמוכה, כלומר יכול להיות קשה למצוא ולבודד אותן. לבסוף, בשל המורפולוגיה הפולימורפית שלהם, ניתן לבלבל בקלות בין צורות L באתרן לבין מבנים ממוצא אוקריוטי, כגון גופים אפופטוטיים או גרגירים שונים.

מאז גילויים ב-1935^פותחו מספר שיטות לטיפול בצורות L במעבדה. רובם מסתמכים על תוספת של חומר אוסמו-פרוטקטיבי למדיום הגידול; בדרך כלל סוכר או מלח 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. כפי שהוזכר לעיל, צורות L מופיעות לעתים קרובות לצד חיידקים בעלי קירות בדגימות מטופלים והפרדת שתי האוכלוסיות יכולה להיות קשה. עם זאת, הוכח כי בניגוד לחיידקים בעלי קירות, צורות L יכולות לעבור דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר בשל גמישותן וגודלן המשתנה. נעשה שימוש בשיטה המשתמשת במסנן כזה כדי לבודד צורות L משתן 10,19,20,21.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חיידקים בצורת L מהשתן, באמצעות שיטת סינון (איור 1). מתוארים גם פרוטוקולים משלימים להכנת מדיום בצורת L, תצפית מיקרוסקופית על צורות L ואינדוקציה של צורות L במבחנה.

Protocol

1. הכנת מדיום בצורת L (LM)

1. שקלו סוכרוז (כמות מותאמת להשגת ריכוז סופי של 0.58 מ'), MgSO₄ (ריכוז סופי של 8 מ"מ) ועירוי לב מוח (BHI) (כמות המומלצת על ידי הספק) בבקבוק זכוכית בגודל כפול מנפח המדיום הרצוי. להכנת 0.5 ליטר מהמדיום, שקלו 100 גרם סוכרוז, 1 גרם MgSO₄ ו -18.5 גרם BHI והניחו בבקבוק זכוכית של 1 ליטר. זה יאפשר השעיה קלה יותר של המרכיבים לפני החיטוי.
2. אם נדרשת מדיה מוצקה או מוצקה למחצה, הוסף את הכמות הרצויה של אגר. למדיה מוצקה, הוסף 5 גרם אגר כדי להשיג ריכוז סופי של 1% ב-0.5 ליטר מדיום. עבור מדיה מוצקה למחצה, הוסף 1 גרם אגר כדי להשיג ריכוז סופי של 0.2% ב-0.5 ליטר מדיום.
3. מלאו במים נטולי יונים (DI) עד לנפח הרצוי הסופי.
4. סוגרים את הבקבוק ומערבבים היטב על ידי ניעור. אין צורך להשהות את המרכיבים לחלוטין, רק וודאו שהם לא מקובצים יחד בתחתית הבקבוק. שחרר את המכסה והחיטוי במחזור מדיה רגיש (115 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות). מומלץ לערבב את החומרים לפני החיטוי ולהשתמש במחזור מדיה רגיש כדי למנוע התגבשות של המרכיבים וקרמל סוכרוז.
5. לבחון ויזואלית את המדיום לאחר חיטוי. לא אמורים להיות גושים והמדיום צריך להיות בצבע ענבר (איור 2A).
6. לאחר החיטוי, הניחו למדיום להתקרר לטמפרטורה המאפשרת להחזיק את הבקבוק בנוחות ביד.
7. אם המדיום נדרש לאינדוקציה של צורות L, הוסף אנטיביוטיקה ו/או חומר ליטי בשלב זה (לדוגמה, פוספומיצין בריכוז סופי של 400 מיקרוגרם/מ"ל, פניצילין G ב-200 מיקרוגרם/מ"ל, D-ציקלוסרין ב-400 מיקרוגרם/מ"ל, אמפיצילין ב-100 מיקרוגרם/מ"ל, מונומיצין ב-50 מיקרוגרם/מ"ל, ליזוזים ב-100 מיקרוגרם/מ"ל או ליזוסטפין ב-5 מיקרוגרם/מ"ל). קבע באופן אמפירי את סוג החומר המעורר בצורת L (או חומרים אם נדרש יותר מאחד) ואת ריכוזו עבור כל אחד ממיני החיידקים שנבדקו.
8. כדי להכין מנות אישיות, יש ללבוש כפפות ולעבוד בארון בטיחות מיקרוביולוגי או להשתמש במבער בונסן. המדיה עשויה לדרוש דגירה לפרקי זמן ממושכים וסטריליות היא בעלת חשיבות עליונה.
   1. להכנת מנות של מדיום מוצק, העבירו 25 מ"ל לצלחות פטרי בודדות בגודל 92/16 מ"מ ותנו להן להתייצב. מומלץ להשתמש בפיפטור במקום לשפוך צלחות ישירות כדי להפחית את הסיכון לזיהום. אין לייבש יתר על המידה את הצלחות.
   2. להכנת מנות נוזליות למחצה, העבירו 5 מ"ל של מדיום למספר מיכלים אוניברסליים של פוליסטירן בנפח 30 מ"ל באמצעות פיפטור ותנו להם להתייצב.
9. השתמש במדיה מיד או אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבוע לפני השימוש. בדוק את המלצות היצרן לפני אחסון מדיום המכיל אנטיביוטיקה מכיוון שהריכוז עלול לרדת, עקב פירוק התרכובת עם הזמן.

2. בידוד צורות L מהשתן

הערה: יש ללבוש כפפות וחלוק מעבדה במהלך הליכי המעבדה. עבוד בארון בטיחות מיקרוביולוגי או השתמש במבער בונסן ללבוש גוגל בטיחות במהלך הסינון.

1. לפחות שעה אחת לפני ההגעה הצפויה של דגימות השתן, נגב את אזור העבודה עם 70% אתנול וקבע את המספר הנדרש של כמות בינונית LM נוזלית למחצה.
   הערה: תרחיף של E. coli ST144¹⁰ צורות L שהושרו במעבדה במדיום LM נוזלי, במקום דגימות שתן אנושיות, ישמש להדגמת הפרוטוקול.
2. נגב שוב את אזור העבודה עם 70% אתנול לפני עיבוד הדגימות. בצד אחד של הספסל, הניחו את המספר הרצוי של 0.45 מיקרוליטר פילטרים חתוכים, מזרקים של 20 מ"ל וכמה מיכלים אוניברסליים ריקים של פוליסטירן 30 מ"ל השווים למספר הדגימות. הוסף מספר מסננים רזרביים בנוסף למספר דגימות השתן הצפויות, למקרה שיהיה צורך ביותר ממסנן אחד כדי לעבד חלק מהדגימות. הנח את המיכלים האוניברסליים הבינוניים של LM ורוקן מיכלים אוניברסליים מפוליסטירן סטריליים של 30 מ"ל במתלה יציב באמצע הספסל. אם יש לבצע בדיקה מיקרוסקופית במקביל, הכינו גם שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, כיסויים בגודל 22 x 22 מ"מ, פיפטות 2 מיקרוליטר ו-1 מ"ל, טיפים סטריליים של 10 מיקרוליטר ו-1 מ"ל, צינורות סטריליים של 1.5 מ"ל וודאו שיש מיקרו-צנטריפוגה לספסל.
3. הובלת דגימות שתן מהתורם למעבדה בהקדם האפשרי לאחר התרומה, כדי למנוע הידרדרות פוטנציאלית של חיידקים בצורת L בדגימה.
4. לבש כפפות ומשקפי מגן, הסר את דגימות השתן משקית הבטיחות, רסס אותן באתנול, נגב והניח במתלה, ליד מיכלי הפוליסטירן הבינוניים של LM ומיכלי פוליסטירן סטריליים רזרביים של 30 מ"ל. מנקודה זו, עבד דגימה אחת בכל פעם.
5. שחרר את המכסים על צינור המכיל מדיום LM, מיכל אוניברסלי רזרבי מפוליסטירן וצינור המכיל שתן.
6. הסר את המזרק מהאריזה, הסר את הבוכנה והניח מימינך.
7. משוך את נייר הבטיחות מגב אריזת המסנן והצמד את המזרק בחוזקה למסנן (שמור את המסנן עם הפנים כלפי מטה במחזיק הפלסטיק של היצרן האישי כדי לוודא שהוא נשאר סטרילי).
8. עבדו במהירות אך בזהירות, הסירו והשליכו את המכסה מהצינור של מדיום LM והניחו את המסנן עם המזרק על גבי הצינור.
9. הסר את המכסה מדגימת השתן ושפך בעדינות ~10 מ"ל לתוך המזרק (רק 2 מ"ל יסוננו אך נפח עודף מונע התזה), וודא שנותר מעל 1 מ"ל לבדיקה מיקרוסקופית. רק 0.5 מ"ל ישמש, אך זה לא מעשי למדוד במדויק נפח כזה תוך ביצוע סינון, ולכן נשמר נפח עודף משוער.
10. הנח בזהירות רבה את הבוכנה בחלק האחורי של המזרק. ניתן להרגיש כמות קטנה של התנגדות לפני שהבוכנה ממוקמת במצב תפעולי מלא וקל לשפוך את הדגימה מעבר לנקודה זו. התאמן מספר פעמים בשימוש במים לפני עיבוד דגימות שתן.
11. לחץ בעדינות על הבוכנה והעביר 2 מ"ל שתן דרך המסנן עד שמורגשת התנגדות גוברת. היזהר לא להפעיל לחץ רב מדי כדי למנוע מהדגימה להישפך והמסנן להישבר. אם הדגימה צפופה במיוחד ומייצרת התנגדות רבה מדי, העבירו את הדגימה דרך מספר מסננים, במקום לאלץ אותה לעבור דרך אחד.
12. הקש בעדינות על המסנן על הצינור המכיל מדיה LM כדי לעקור את כל הדגימה המסוננת שנותרה, הרם את המסנן ואת המזרק והנח במהירות את המכסה מהמיכל האוניברסלי של פוליסטירן 30 מ"ל רזרבי על הצינור המכיל מדיום LM ושתן מסונן, הקפד לא לגעת בחלק הפנימי של הצינור עם קצה המכסה. השלך בבטחה את המסנן, המזרק ומיכל הפוליסטירן הרזרבי.
13. דגרו את הדגימות במצב נייח בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. זה יאפשר לצורות L שעברו דרך המסנן לחדש את דפנותיהן ולהתחיל לצמוח כחיידקים בעלי קירות.
14. התבונן בדגימות מדי יום לאיתור עדות לגדילה, והחזק את הצינורות המכילים דגימות מסוננות כנגד מקור אור. עבור דגימות חיוביות, הגידול מופיע בדרך כלל תוך 3 עד 7 ימים.
15. לאחר זיהוי הגידול, העבירו את הדגימה לארון בטיחות מיקרוביולוגי או בקרבת מבער בונסן. פתח את הדגימה וטבל בזהירות בלולאת פלסטיק של 5 מיקרוליטר, מכוון לאזור הגידול, ולאחר מכן פס את הדגימות על מדיום BHI מוצק סטנדרטי ללא הגנה על אוסמו, במטרה להשיג מושבות בודדות²².
16. במקביל, בחנו כמות קטנה של הדגימה, יחד עם חלק של מדיום נוזלי למחצה (~5 מיקרוליטר), באופן מיקרוסקופי כמתואר בשלב 3. העברת הדגימה לשקופית מיקרוסקופית יחד עם המדיום תבטיח שכל צורות L שעשויות עדיין להיות קיימות בדגימה לא יתפוצצו וניתן יהיה לזהות אותן. עם זאת, רוב החיידקים בשלב זה צפויים לחזור לצורות קירות ולהופיע כמוטות רגילים או קוקיות.
17. דגרו את הדגימות המפוספסות על לוחות ה-BHI במצב נייח ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
18. בדוק אם יש עדות לגדילה, בחר מושבה בודדת מכל צלחת באמצעות לולאה של 5 מיקרוליטר וחסן ל-5 מ"ל של BHI נוזלי. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, עם טלטולים.
19. השתמש בתרביות הלילה כדי להכין מלאי גליצרול או כדי לבודד DNA לזיהוי מינים בשיטה מועדפת (למשל, Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit).

3. בדיקת דגימות שתן לנוכחות צורות L במיקרוסקופ ניגודיות פאזה

1. הנח את 0.5 מ"ל דגימת השתן הנותרת בצינור מיקרוצנטריפוגה וסובב ב-8,000 x גרם למשך דקה אחת במיקרו-צנטריפוגה ספסל.
2. הסר בעדינות את הסופרנטנט, השאיר מאחור כ-20 מיקרוליטר והשהה מחדש את הגלולה על ידי פיפטינג בעדינות 3 פעמים למעלה ולמטה.
3. הנח 1 מיקרוליטר על שקופית מיקרוסקופ זכוכית וכסה בכיסוי של 22 x 22 מ"מ (כדי לבחון דגימה של 5 מיקרוליטר (ראה שלב 2.16) השתמש בכיסוי בגודל 22 x 50 מ"מ כדי לוודא שהכיסוי יידבק היטב לשקופית). לחץ כלפי מטה על הכיסוי בעדינות באמצעות כרית צמר גפן סטרילית כדי ליצור אטימה וכדי לבדוק שהחלקת הכיסוי אינה מסוגלת לזוז. השלך את כרית צמר הגפן.
4. בחנו את השקופית באמצעות מיקרוסקופ המצויד באובייקט ניגודיות פאזה פי 100 לנוכחות מבנים דמויי צורת L (איור 3).
   הערה: כדי לאשר את המקור החיידקי של מבנים דמויי צורת L בדגימות חולים, מומלץ לבחון את הדגימות על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים ספציפיות לרצפי חיידקים^10,23.

4. אינדוקציה של צורות L במבחנה

1. פס חיידקים בעלי דופן לבחירה למושבות בודדות²² על צלחת המכילה מדיום שאינו מגן אוסמו-פרוטקטיבי (למשל BHI) ודגירה נייחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. למחרת, הכינו מדיום LM מגן אוסמו, המכיל סוכנים/ים מעוררים בצורת L לבחירה כמתואר בשלב 1. הכן את המספר הרצוי של צלחות עם מדיום מוצק.
3. בעזרת לולאת פלסטיק סטרילית של 5 מיקרוליטר או קיסם, בחרו כמות נדיבה (בשווי ~4-5 מושבות) מצלחת ה-BHI הלא אוסמו-מגנה שהודגרה בלילה הקודם.
4. פס חיידקים על לוחית ה-LM באמצעות המשטח השטוח של הלולאה (ולא הקצה). פס את החיידקים בתנועה רציפה אחת על קצה הצלחת, ואז סובב את הצלחת ב-90°. גע בלולאה עד קצה הפס הראשון ובתנועה מתמשכת, פרש את הפס על רבע הצלחת, ודלל בהדרגה את החיידקים עם מספר פסים חופפים (ניתן להשתמש בצלחת כולה אם תרצה. אם משתמשים רק ברבע של הצלחת, ניתן להשתמש ברבעים אחרים לאינדוקציות מרובות).
   הערה: איור 4A מראה באופן סכמטי את כיוון הפסים. המטרה כאן היא להשיג אזור גידול המכיל כמה שיותר צורות L טהורות, ולא מושבות בודדות. מסיבה זו, אין צורך לשנות את הלולאות בין הפסים. מושבות בודדות של צורת L יכולות להיות קשות מאוד להשגה, ושימוש במספר קטן מדי של חיידקים עלול לגרום לחוסר צמיחה בצורת L כלל. מצד שני, אם נעשה שימוש ביותר מדי חיידקים בעלי קירות לאינדוקציה, לא כל החיידקים יעברו את המעבר וחלקם עדיין עשויים לשמור על הקיר. בדרך כלל ניתן לזהות את אזור הגידול הטוב ביותר בצורת L באמצע הפס.
5. הניחו את הצלחת בשקית ניילון או במיכל אחר כדי למנוע ממנה להתייבש ודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס (צורות L של מיני חיידקים מסוימים עשויות לגדול טוב יותר בתנאים אנאירוביים, כך שניתן לבדוק תא אנאירובי לצמיחה יעילה יותר בצורת L). בדוק את הצלחת לאיתור עדויות לצמיחה מדי יום. זה מופיע בדרך כלל תוך 3 עד 7 ימים. כמות הגידול היא ספציפית לזן. דוגמה לגדילה בצורת L מוצגת באיור 4B.
6. אשר את נוכחותם של צורות L באמצעות מיקרוסקופ. הניחו טיפה של 2 מיקרוליטר של מדיום LM על שקופית מיקרוסקופית, ובעזרת קצה פיפטה, בחרו כמות קטנה של תאים מאמצע הפס והשעו מחדש בטיפה.
   1. מכסים בכיסוי בגודל 22 x 22 מ"מ ובודקים נוכחות של צורות L באמצעות מיקרוסקופ עם יעד ניגודיות פאזה פי 100. דוגמה מייצגת ניתן למצוא באיור 4C.

תוצאות

חומר בצורת L המכיל סוכרוז יכול לעבור דרגות שונות של קרמל לאחר חיטוי, הקשורות לשינוי בצבע. איור 2 מציג תוצאות מייצגות של חומרי חיטוי המכילים סוכרוז. איור 2A מציג דוגמה טיפוסית למדיום LM, שהפך לצבע ענבר בעקבות החיטוי. איור 2B מציג דוגמה אופיינית לתמיסת סוכרוז של 1.16 M (ריכוז פי 2 הנדרש לייצור מדיום LM) לאחר חיטוי. לעיתים, מדיום LM או סוכרוז עשויים לעבור קרמל נרחב במהלך החיטוי, ולא מומלץ להשתמש במדיום אם זה קורה. איור 2C מציג דוגמה למדיום סוכרוז מקורמל יתר על המידה.

חיידקים בצורת L יכולים להיות הטרוגניים מאוד, ואיור 3 מציג דוגמאות למבנים דמויי צורת L שניתן להבחין בהם בדגימות שתן של מטופלים. כדי לאשר את המקור החיידקי של המבנים דמויי צורת L המצויים בדגימות שתן, מומלץ FISH עם בדיקות פלואורסצנטיות המכוונות לרצפי חיידקים^10,23.

רמות הגידול של צורות L המושרות בתנאי מעבדה הן ספציפיות לזן. איור 4B מציג דוגמה לצמיחה בצורת L של Bacillus subtilis ואיור 4C מראה את המראה המיקרוסקופי של צורות L המושרות באיור 4B.

איור 1: בידוד צורות L בשיטת סינון - ייצוג סכמטי. דגימת השתן מועברת דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר למיכל אוניברסלי מפוליסטירן, המכיל מדיום LM מגן אוסמו-פרוטקטיבי בתוספת 0.2% אגר. לאחר מכן הדגימה מודגרת במצב נייח ב-30 מעלות צלזיוס למשך עד חודש ונבדקת ויזואלית מדי יום לאיתור עדות לגדילה. תקופת דגירה זו מאפשרת לכל צורות L הקיימות בדגימה לחדש את דפנות התא שלהן. לאחר זיהוי הגידול, ניתן לפספס מחדש את החיידקים על צלחת המכילה מדיום רגיל, מוצק ולא אוסמו-מגן (כגון אגר מזין או עירוי מוח-לב) כדי לבודד מושבות בודדות, אשר לאחר מכן ניתן לעבור מיצוי וריצוף DNA כדי לזהות את מיני החיידקים המבודדים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מדיה בצורת L. (A) מדיום LM לאחר חיטוי. (B) 1.16 מיליון סוכרוז (ריכוז פי 2) לאחר חיטוי. (C) מדיום LM מקורמל בהרחבה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דוגמאות למבנים דמויי צורת L הנצפים בשתן של חולים עם דלקת בדרכי השתן חוזרות על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. (א,ב) מבנים אופייניים לחלוקת צורות L חיידקיות תלויות בשתן. (ג,ד) מבנים אופייניים לחלוקת צורות L חיידקיות הקשורות לתאים אוקריוטיים. (ה,ו) מבנה בצורת סהר האופייני לצורות L גראם שליליות (חץ אדום). (ו,ז) מבנים האופייניים לשלבי ביניים של מעבר בין התאים בעלי הקירות לצורות L (חץ אדום ב-G). (H) שלפוחיות תוך-תאיות האופייניות לצורות L גדולות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. נתון זה שונה^מ-10. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: טכניקת לוחות פסים עבור אינדוקציה של צורות L על מדיה מוצקה. (A) ייצוג סכמטי של חיידקים מפוספסים באמצעות רבע צלחת לאינדוקציה של צורות L. החץ מציין את הכיוון לפס החיידקים. (B) דוגמה לצמיחה בצורת L של Bacillus subtilis בעקבות פסים, כפי שמוצג ב-(A), לאחר 3 ימי דגירה ב-30 מעלות צלזיוס. (C) צורות L המושרות ב-(B) המודגמות על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. לוחות B ו-C שונו^מ-16 אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הפרוטוקולים המתוארים בכתב יד זה שימשו לבידוד וטיפול בצורות L של מיני חיידקים שונים משתן אנושי, כולל E. coli, Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterococcus ו-Enterobacter spp, שכולם קשורים בדרך כלל לדלקות בדרכי השתן ^10,24. עם זאת, שיטות לטיפול בצורות L, שנקבעו במעבדה אחת, עשויות שלא לעבוד באופן מיידי במעבדה אחרת, ומה שעובד עבור זן חיידקים אחד עשוי שלא לעבוד עבור אחר. לכן, הפרוטוקולים המתוארים כאן עשויים לדרוש ניסיונות מרובים ואופטימיזציה נוספת. בפרט, ייתכן שיהיה צורך לבדוק את דרישות התזונה, זמינות החמצן, ריכוז האוסמו-מגן ונזילות המדיום. התנאים האופטימליים למעבר וצמיחה של צורת L יכולים להיות שונים מתנאים אופטימליים לגידול צורות מוקפות דופן מאותו המין. יתר על כן, ניתן להיתקל במספר בעיות טכניות בעת ניסיון הפרוטוקולים.

בעיה נפוצה הקשורה להכנת חומר בצורת L היא קרמל סוכרוז לאחר חיטוי. אם המדיום הופך לצבע חום כהה, יש להשליך אותו ולהכין אצווה טרייה. יתכן שיהיה צורך להכין את הסוכרוז במים בבקבוק אחד ואת שאר המרכיבים בבקבוק אחר, שניהם בריכוז פי 2. לאחר מכן ניתן לשלב תמיסות מרוכזות פי 2 ביחס של 1:1 לאחר החיטוי, כדי להשיג את הריכוזים הסופיים הרצויים. סוכרוז שעובר חיטוי בנפרד עשוי להפוך לצהוב מעט בצבע (איור 2B), וזה מקובל, אולם אם הוא הופך לחום כהה (איור 2C), אין להשתמש בו לניסויים. ייתכן שיהיה צורך להתאים את האורך והטמפרטורה של מחזור החיטוי כדי להקל על קרמל הסוכרוז. מומלץ לבדוק את הסטריליות של המדיה שהוכנה באמצעות מחזור חיטוי מותאם, על ידי דגירה של כל אחת מהמדיה למשך 3 ימים לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, ייתכן שיהיה צורך לבדוק חומר אוסמו-מגן חלופי, כגון מלח, אם בעיית הקרמל נמשכת¹⁸.

מספר בעיות עשויות להיתקל גם במהלך בידוד של צורות L מדגימות חולים. כפי שצוין בפרוטוקול, צורות L הקיימות בדגימות עלולות להידרדר; לכן, חשוב להעביר את הדגימות למעבדה בהקדם האפשרי לאחר התרומה. מאותה סיבה, אחסון דגימות בטמפרטורות נמוכות או שינוי הרכב הדגימה (למשל על ידי הוספת PBS) אינו מומלץ מאוד.

לשיטת הסינון עצמה יש מגבלות. צורות L מסוימות עשויות להיקרע עקב כוחות גזירה הנוצרים על ידי זרימת המדיה דרך המסנן. במחקר של Mickiewicz et al., רק 41% מצורות ה-L בדגימות ביקורת, שהכילו צורות E. coli L שהושרו במעבדה, עברו דרך המסנן¹⁰. זה מוכיח ששיטת הסינון יכולה להוביל להערכת חסר של מספר הדגימות החיוביות ואינה מומלצת למחקרים כמותיים.

במקרים נדירים מאוד, לאחר הסינון, ניתן להבחין בגידול משמעותי למחרת בכמות המדיה הנוזלית למחצה המשמשת לבידוד בצורת L. זו יכולה להיות אינדיקציה לכך שהמסנן נשבר במהלך הפרוטוקול, מה שאפשר מעבר של חיידקים מוקפים, או שהדגימה הייתה מזוהמת. מומלץ להשליך דגימות כאלה או לפחות להתייחס אליהן בזהירות. בדיקה ויזואלית יומית של הדגימות היא קריטית כדי למנוע תוצאות חיוביות כוזבות. לפני עיבוד דגימות שתן על ידי סינון, מומלץ להעביר מספר דגימות של צורות L המושרות במעבדה, חיידקים בעלי קירות ומדיום סטרילי דרך המסנן הנבחר, כדי לשלוט ביעילות ההפרדה בצורת L, מעבר פוטנציאלי של חיידקים בעלי קירות עקב שבירת המסנן וכדי לוודא שהטכניקה הסטרילית בה נעשה שימוש פועלת היטב.

במקרים נדירים, צורות L יציבות עשויות להיות מבודדות על ידי סינון, ללא צורות דופן הניתנות לזיהוי במיקרוסקופיה. כדי לשמור על חיידקים בצורת L ברי קיימא, מומלץ להעביר מספר "לולאות מלאות" של הדגימה לצינור המכיל מדיום LM נוזלי למחצה טרי או לפס מחדש על מדיום אוסמו-מגן מוצק כל 3-7 ימים, תלוי ביעילות הגידול. אם לא מופיעות צורות דופן לאחר מספר מעברים, ניתן לנסות להקפיא דגימות ב-40% גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס כדי לשמר את המבודד; עם זאת, ייתכן שחלק מצורות ה-L לא יסבלו הליך כזה היטב.

למרות מגבלותיה, שיטת הסינון היא היחידה ששימשה עד כה להפרדת צורות L מצורות דופן בדגימות חולים. זה מאפשר זיהוי של זני חיידקים המסוגלים להחליף צורת L in vivo. קיים פוטנציאל לפתח ולהתאים את שיטת הסינון לבידוד צורות L מסוגים אחרים של דגימות אנושיות או סביבתיות (למשל דם או צמחים).

בהתחשב בכל השיקולים לעיל, אנו ממליצים על הפרוטוקולים המתוארים בכתב יד זה כנקודת התחלה טובה לפיתוח פרוטוקולים מותאמים בצורת L במעבדות בודדות, ולא כהוראות נוקשות. עבודה עם צורות L דורשת זהירות רבה, מסירות וסבלנות אך עם תרגול, זה יכול להיות מתגמל ביותר. אנו מקווים שההנחיות המתוארות בכתב היד הזה יהפכו לאמת מידה לפיתוח פרוטוקולים בצורת L ויעודדו קבוצות מחקר בסיסיות וקליניות יותר לחקור את צורות החיידקים המרתקות האלה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µL cut off filters	Sarstedt	83.1826
20 mL syringes	Fisher	17955460
30 mL polystyrene universal tubes	Starlab	E1412-3010
92 x 16 mm Petri Dishes	Starstedt	82.1473
Agar	Oxoid	LP0011
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135
Cover slips (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)	VWR	631-0137/-0125
D-cycloserine	Sigma-Aldrich	C6880
Glass microscope slides	VWR	631-1550P
Lysostaphin	Sigma-Aldrich	L7386
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L4919
MgSO4	VWR	25165.26
Moenomycin	Sigma-Aldrich	32404
Penicillin G	Sigma-Aldrich	13752
Phosphomycin	Sigma-Aldrich	P5396
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100