Выделение бактерий L-формы из мочи методом фильтрации

Резюме

Здесь мы представляем протокол выделения бактерий L-формы из мочи с помощью метода фильтрации. Описаны дополнительные методы получения L-формной среды, наблюдения L-форм методом фазово-контрастной микроскопии и индукции L-форм в лабораторных условиях.

Аннотация

Считается, что переход бактерий в состояние L-формы играет возможную роль в уклонении от иммунитета и бактериальной персистенции во время лечения антибиотиками, нацеленными на клеточную стенку. Тем не менее, выделение и обработка бактерий L-формы является сложной задачей, в основном из-за их высокой чувствительности к изменениям осмолярности. Здесь подробно описаны протоколы приготовления среды L-форм, выделения L-форм из мочи методом фильтрации, обнаружения L-форм в образцах мочи методом фазово-контрастной микроскопии и индукции L-форм in vitro. Точные требования к выживаемости и росту L-форм могут варьироваться от штамма к штамму. Таким образом, представленные здесь методы предназначены для того, чтобы действовать как основные рекомендации для создания протоколов L-формы в отдельных лабораториях, а не как точные инструкции. Метод фильтрации может привести к уменьшению количества L-форм в образце и не должен использоваться для количественного определения. Тем не менее, это единственный метод, используемый до сих пор для эффективного отделения вариантов с дефицитом клеточной стенки от их стенчатых аналогов и для идентификации бактериальных штаммов, которые способны к переключению L-формы у пациентов с инфекциями мочевыводящих путей. Метод фильтрации может быть адаптирован для выделения L-форм у пациентов с другими категориями бактериальных инфекций и из образцов окружающей среды.

Введение

Практически все бактерии окружены структурой, называемой клеточной стенкой. Стена важна для защиты от стрессов окружающей среды, помогает при регулярном делении и придает бактериям форму¹. Тем не менее, стенка также является мишенью для некоторых частей иммунной системы и некоторых из лучших и наиболее часто используемых антибиотиков, включая пенициллин ^2,3. Несмотря на свою важность, как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии иногда могут выживать без стенки 4,5,6,7,8. Если окружающие условия обеспечивают достаточную осмозащиту, чтобы предотвратить их разрыв, а также присутствуют агенты, нацеленные на клеточную стенку, бактерии могут перейти в состояние без стенок, называемое L-формой 4,5,6,7,8.

Многочисленные отчеты указывают на то, что переход в состояние L-формы и обратно в состояние стен может быть важным in vivo в качестве механизма выживания бактерий как при атаке иммунной системы хозяина, так и при лечении антибиотиками, нацеленными на клеточную стенку 9,10,11,12,13,14,15. Такой переход потенциально обеспечивает мощную стратегию для рецидива бактериальной инфекции 9,10,11,12,13,14,15. Понимание базовой биологии L-формных бактерий и их взаимодействия с хозяином имеет решающее значение для расшифровки их роли в патогенезе. Тем не менее, работа с бактериями L-формы является сложной задачей.

Во-первых, из-за отсутствия клеточной стенки бактерии L-формы склонны к разрыву в ответ на изменения осмолярности. Кроме того, L-формы делятся крайне нерегулярным образом, имеют непредсказуемые закономерности роста (обычно намного медленнее, чем их стенчатые аналоги) и, в зависимости от деформации, могут лучше распространяться в полужидких, а не в твердых или жидких средах. Все вышеизложенные соображения затрудняют количественную оценку и сравнение темпов роста. Различные виды бактерий (или даже штаммы) имеют различные метаболические потребности для переключения и роста L-формы. Например, L-формы некоторых грамположительных бактерий, которые полагаются на аэробное дыхание, более чувствительны к активным формам кислорода, чем их стенчатые^{аналоги.}

Индукция L-форм в лабораторных условиях и в организме хозяина обычно обусловлена агентами, нацеленными на клеточную стенку, такими как антибиотики и лизоцим⁹. Такое лечение может привести только к частичной потере клеточной стенки, и, следовательно, в образцах могут присутствовать некоторые стенчатые (или частично стенированные) бактерии, что затрудняет различие, связаны ли какие-либо наблюдаемые экспериментальные результаты с присутствием L-форм или пристенчатых форм бактерий. Частота индуцированных in vivo L-форм, как правило, низкая, что означает, что их может быть трудно найти и выделить. Наконец, благодаря своей полиморфной морфологии L-формы можно легко спутать in situ со структурами эукариотического происхождения, такими как апоптотические тельца или различные гранулы.

С момента их открытия в 1935 году было разработано несколько методов работы с L-формами в лаборатории. Большинство из них основаны на добавлении осмопротекторного агента в питательную среду; обычно сахар или соль 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Как упоминалось выше, L-формы часто встречаются бок о бок со стенчатыми бактериями в образцах пациентов, и разделение этих двух популяций может быть затруднено. Тем не менее, было продемонстрировано, что, в отличие от бактерий со стенками, L-формы могут проходить через фильтр размером 0,45 мкм благодаря своей гибкости и переменным размерам. Способ с использованием такого фильтра был использован для выделения L-форм из мочи 10,19,20,21.

Здесь мы представляем протокол выделения бактерий L-формы из мочи с помощью метода фильтрации (Рисунок 1). Также описаны комплементарные протоколы получения среды L-форм, микроскопического наблюдения за L-формами и индукции L-форм in vitro.

протокол

1. Приготовление среды L-формы (ЛМ)

1. Взвесьте сахарозу (количество, скорректированное для достижения конечной концентрации 0,58 М), MgSO₄ (конечная концентрация 8 мМ) и инфузию Brain Heart Infusion (BHI) (количество, рекомендованное поставщиком) в стеклянной бутылке, размер которой в два раза превышает желаемый объем среды. Для приготовления 0,5 л среды взвесить 100 г сахарозы, 1 г MgSO₄ и 18,5 г BHI и поместить в стеклянную бутылку объемом 1 л. Это позволит легче повторно суспендировать ингредиенты перед автоклавированием.
2. Если требуются твердые или полутвердые среды, добавьте нужное количество агара. Для твердых сред добавьте 5 г агара для достижения конечной концентрации 1% в 0,5 л среды. Для полутвердых сред добавьте 1 г агара для достижения конечной концентрации 0,2% в 0,5 л среды.
3. Долейте деионизированную (DI) воду до конечного желаемого объема.
4. Закройте бутылку и хорошо перемешайте, встряхивая. Нет необходимости полностью суспендировать ингредиенты, просто убедитесь, что они не слиплись на дне бутылки. Ослабьте колпачок и автоклав на цикле чувствительной среды (115 °C в течение 15 минут). Рекомендуется смешивать ингредиенты перед автоклавированием и использовать цикл чувствительной среды, чтобы предотвратить слипание ингредиентов и карамелизацию сахарозы.
5. Визуально осмотрите среду после автоклавирования. Не должно быть комочков, а среда должна быть янтарного цвета (Рисунок 2А).
6. После автоклавирования дайте среде остыть до температуры, которую можно удобно держать в руке.
7. Если для индукции L-форм требуется среда, добавьте на этом этапе антибиотик и/или литическое средство (например, фосфомицин в конечной концентрации 400 мкг/мл, пенициллин G в концентрации 200 мкг/мл, D-циклосерин в концентрации 400 мкг/мл, ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, меномицин в концентрации 50 мкг/мл, лизоцим в концентрации 100 мкг/мл или лизостафин в концентрации 5 мкг/мл). Опытным путем установить тип агента, индуцирующего L-форму (или агентов, если требуется более одного) и его концентрацию для каждого из испытуемых видов бактерий.
8. Для приготовления индивидуальных аликвот надевайте перчатки и работайте в шкафу микробиологической безопасности или используйте горелку Бунзена. Среды могут нуждаться в инкубации в течение длительных периодов времени, и стерильность имеет первостепенное значение.
   1. Для приготовления аликвот твердой среды переложите 25 мл в отдельные чашки Петри 92/16 мм и дайте им застыть. Для снижения риска загрязнения рекомендуется использовать пипетку, а не заливать пластины напрямую. Не пересушивайте пластины.
   2. Для приготовления полужидких аликвот перелейте 5 мл среды в несколько универсальных емкостей из полистирола объемом 30 мл с помощью пипеттора и дайте им застыть.
9. Используйте носитель сразу или храните при температуре 4 °C в течение недели перед использованием. Ознакомьтесь с рекомендациями производителя перед хранением среды, содержащей антибиотики, так как концентрация может снизиться из-за того, что соединение со временем разрушается.

2. Выделение L-форм из мочи

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время лабораторных процедур надевайте перчатки и лабораторный халат. Работайте в шкафу микробиологической безопасности или используйте горелку Бунзена. Во время фильтрации надевайте защитные гочки.

1. Не менее чем за 1 ч до предполагаемого поступления образцов мочи протрите рабочую зону 70% этанолом и выложите необходимое количество полужидких средних аликвот.
   Примечание: Для демонстрации протокола будет использоваться суспензия^{10-L-форм} E. coli ST144, индуцированная в лаборатории в жидкой среде LM, а не в образцах мочи человека.
2. Перед обработкой образцов еще раз протрите рабочую область 70% этанолом. С одной стороны от скамейки разложите нужное количество отсечных фильтров объемом 0,45 мкл, шприцев по 20 мл и несколько пустых стерильных универсальных контейнеров из полистирола объемом 30 мл, равном количеству образцов. Добавьте несколько запасных фильтров в дополнение к количеству ожидаемых образцов мочи, на случай, если для обработки некоторых образцов потребуется более одного фильтра. Поместите средние аликвоты LM и пустые стерильные универсальные контейнеры из полистирола объемом 30 мл в устойчивую стойку в центре скамейки. Если микроскопическое исследование должно проводиться параллельно, подготовьте также предметные стекла для микроскопа, покровные стекла 22 x 22 мм, пипетки объемом 2 л и 1 мл, стерильные наконечники объемом 10 л и 1 мл, стерильные пробирки объемом 1,5 мл и убедитесь в наличии настольной микроцентрифуги.
3. Транспортируйте образцы мочи от донора в лабораторию как можно скорее после сдачи крови, чтобы предотвратить потенциальное ухудшение состояния L-формных бактерий в образце.
4. Наденьте перчатки и защитные очки, достаньте образцы мочи из безопасного мешка, распылите на них этанол, протрите и поместите в стеллаж, рядом со средними аликвотами LM и стерильными запасными полистирольными контейнерами объемом 30 мл. С этого момента обрабатывайте по одному образцу за раз.
5. Ослабьте колпачки на пробирке, содержащей LM-среду, запасной универсальный контейнер из полистирола и пробирку с мочой.
6. Извлеките шприц из упаковки, снимите поршень и поставьте справа от себя.
7. Вытяните безопасную бумагу с обратной стороны упаковки с фильтром и плотно прикрепите шприц к фильтру (держите фильтр лицевой стороной вниз в пластиковом держателе отдельного производителя, чтобы убедиться, что он остается стерильным).
8. Работая быстро, но осторожно, снимите и выбросьте колпачок с тюбика LM medium и поместите фильтр со шприцем на верхнюю часть пробирки.
9. Снимите колпачок с образца мочи и аккуратно налейте ~10 мл в шприц (будет отфильтровано только 2 мл, но избыток объема предотвращает разбрызгивание), убедившись, что более 1 мл осталось для микроскопического исследования. Будет использовано всего 0,5 мл, но точно измерить такой объем при предварительной фильтрации нецелесообразно, поэтому сохраняется примерный избыточный объем.
10. Очень аккуратно поместите поршень в заднюю часть шприца. Перед тем, как поршень будет помещен в полностью рабочее положение, можно почувствовать небольшое сопротивление, и за это место можно легко пролить образец. Потренируйтесь несколько раз с использованием воды перед обработкой образцов мочи.
11. Осторожно нажмите на поршень и пропустите 2 мл мочи через фильтр до тех пор, пока не почувствуете нарастающее сопротивление. Будьте осторожны и не оказывайте слишком большого давления, чтобы образец не пролился и фильтр не сломался. Если образец особенно плотный и создает слишком большое сопротивление, пропустите образец через несколько фильтров, а не через один.
12. Осторожно постучите фильтром по пробирке с фильтрующим материалом LM, чтобы удалить оставшийся отфильтрованный образец, поднимите фильтр и шприц и быстро наденьте колпачок из запасного универсального контейнера из полистирола объемом 30 мл на пробирку, содержащую среду LM и отфильтрованную мочу, следя за тем, чтобы не касаться внутренней стороны пробирки краем колпачка. Безопасно утилизируйте фильтр, шприц и запасной контейнер из полистирола.
13. Инкубируйте образцы в неподвижном положении при температуре 30 °C в течение 1 месяца. Это позволит L-формам, прошедшим через фильтр, регенерировать свои стенки и начать расти в виде стенчатых бактерий.
14. Наблюдайте за образцами каждый день на предмет признаков роста, поднося пробирки с отфильтрованными образцами к источнику света. При положительных пробах нарост обычно появляется в течение 3-7 дней.
15. Как только рост будет обнаружен, перенесите образец в шкаф микробиологической безопасности или в ближайшую близость к горелке Бунзена. Откройте образец и осторожно окуните его в пластиковую петлю объемом 5 мкл, стремясь к области роста, а затем нанесите образцы на стандартную твердую среду BHI без осмозащиты, стремясь получить одиночные колонии²².
16. В то же время исследуйте небольшое количество образца вместе с фракцией полужидкой среды (~5 мкл) микроскопически, как описано на шаге 3. Перенос образца на предметное стекло вместе со средой гарантирует, что любые L-формы, которые все еще могут присутствовать в образце, не лопнут и могут быть обнаружены. Тем не менее, ожидается, что большинство бактерий на этом этапе вернутся к стенчатым формам и появятся в виде обычных палочек или кокков.
17. Инкубируйте образцы, нанесенные на планшеты BHI, в неподвижном положении при температуре 37 °C в течение ночи.
18. Исследуйте признаки роста, выберите по одной колонии из каждой пластины с помощью петли объемом 5 мкл и введите 5 мл жидкого BHI. Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи, встряхивая.
19. Используйте ночные культуры для подготовки запасов глицерина или для выделения ДНК для идентификации вида с использованием предпочтительного метода (например, Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit).

3. Исследование образцов мочи на наличие L-форм методом фазово-контрастной микроскопии

1. Поместите оставшиеся 0,5 мл образца мочи в микроцентрифужную пробирку и вращайте при давлении 8 000 x g в течение 1 минуты в настольной микроцентрифуге.
2. Аккуратно удалите надосадочную жидкость, оставив около 20 μл, и повторно суспендируйте гранулу путем дозирования 3 раза вверх и вниз.
3. Поместите 1 мкл на предметное стекло микроскопа и накройте крышкой 22 x 22 мм (для исследования образца размером 5 мкл (см. шаг 2.16) используйте покровную крышку 22 x 50 мм, чтобы убедиться, что покровная крышка хорошо прилипает к предметному стеклу). Осторожно надавите на покровное стекло с помощью стерильной ватной ваты, чтобы создать уплотнение и убедиться, что покровное стекло не может сдвинуться. Выбросьте ватный диск.
4. Рассмотрите предметное стекло с помощью микроскопа, оснащенного 100-кратным фазовым контрастным объективом, на наличие L-формоподобных структур (Рисунок 3).
   Примечание: Для подтверждения бактериального происхождения L-формоподобных структур в образцах пациентов рекомендуется исследовать образцы методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с использованием олигонуклеотидных зондов, специфичных для бактериальных последовательностей^10,23.

4. Индукция L-форм in vitro

1. Распределите выбранные стенчатые бактерии по одиночным колониям²² на планшете, содержащем неосмопротекторную среду (например, BHI), и инкубируйте стационарно при 37 °C в течение ночи.
2. На следующий день приготовьте осмопротекторную среду LM, содержащую агенты, индуцирующие L-форму, как описано в шаге 1. Подготовьте нужное количество пластин с твердой средой.
3. Используя стерильную пластиковую петлю объемом 5 мкл или зубочистку, выберите большое количество (~4-5 колоний) из неосмопротекторной пластины BHI, инкубированной накануне вечером.
4. Нанесите бактерии на пластину LM, используя плоскую поверхность петли (а не край). Разбейте бактерии одним непрерывным движением по краю пластины, затем поверните пластину на 90°. Прикоснитесь петлей к краю первой полосы и непрерывным движением распределите полосу по квадранту пластины, постепенно разбавляя бактерии многократными перекрывающимися полосами (при желании можно использовать всю пластину. Если используется только один квадрант пластины, другие квадранты могут быть использованы для множественных индукций).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 4А схематически показано направление полос. Цель здесь состоит в том, чтобы получить область произрастания, содержащую как можно больше чистых L-форм, а не отдельных колоний. По этой причине нет необходимости менять петли между полосами. Одиночные колонии L-форм может быть очень трудно получить, а использование слишком малого количества бактерий может привести к полному отсутствию роста L-формы. С другой стороны, если для индукции было использовано слишком много бактерий со стенками, не все бактерии пройдут через переключение, и некоторые из них все еще могут сохранить стенку. Наилучшая область роста L-формы обычно может быть обнаружена в середине полосы.
5. Поместите планшет в пластиковый пакет или другой контейнер, чтобы предотвратить его высыхание, и инкубируйте при 30 °C (L-формы некоторых видов бактерий могут лучше расти в анаэробных условиях, поэтому анаэробная камера может быть протестирована на более эффективный рост L-формы). Осматривайте пластину на наличие признаков роста каждый день. Обычно это появляется в течение 3-7 дней. Величина роста зависит от штамма. Пример роста L-формы показан на рисунке 4B.
6. Подтвердите наличие L-форм с помощью микроскопа. Поместите каплю среды LM объемом 2 мкл на микроскопическое предметное стекло и с помощью наконечника для пипетки выберите небольшое количество клеток из середины полосы и повторно суспендируйте в капле.
   1. Накройте покровным колпачком размером 22 x 22 мм и исследуйте наличие L-форм с помощью микроскопа со 100-кратным фазовым контрастным объективом. Показательный пример можно найти на рисунке 4C.

Результаты

Среда L-формы, содержащая сахарозу, может подвергаться различной степени карамелизации после автоклавирования, что связано с изменением цвета. На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты автоклавирования сред, содержащих сахарозу. На рисунке 2А показан типичный пример среды LM, которая после автоклавирования приобрела янтарный цвет. На рисунке 2В показан типичный пример 1,16 М раствора сахарозы (в 2 раза больше концентрации, необходимой для получения LM среды) после автоклавирования. Иногда среда LM или сахароза могут подвергаться обширной карамелизации во время автоклавирования, и в этом случае не рекомендуется использовать среду. На рисунке 2C показан пример чрезмерно карамелизированной сахарозной среды.

L-формы бактерий могут быть очень гетерогенными, и на рисунке 3 показаны примеры L-формоподобных структур, наблюдаемых в образцах мочи пациентов. Для подтверждения бактериального происхождения L-формоподобных структур, обнаруженных в образцах мочи, рекомендуется использовать FISH с флуоресцентными зондами, нацеленными на бактериальные последовательности^10,23.

Уровни роста L-форм, индуцированные в лабораторных условиях, специфичны для штамма. На рисунке 4B показан пример роста L-формы Bacillus subtilis , а на рисунке 4C показан микроскопический вид индуцированных L-форм на рисунке 4B.

Рисунок 1: Выделение L-форм методом фильтрации – схематическое изображение. Образец мочи пропускают через фильтр 0,45 мкм в универсальный контейнер из полистирола, содержащий осмопротекторную среду LM с добавлением 0,2% агара. Затем образец инкубируют в неподвижном положении при температуре 30 °C в течение месяца и ежедневно визуально проверяют на наличие признаков роста. Этот инкубационный период позволяет любым L-формам, присутствующим в образце, регенерировать свои клеточные стенки. Как только рост обнаружен, бактерии могут быть повторно помещены на планшет, содержащий обычную, твердую, не осмопротекторную среду (такую как питательный агар или инфузия мозга и сердца) для выделения отдельных колоний, которые затем могут быть подвергнуты экстракции ДНК и секвенированию для идентификации выделенных видов бактерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Среда с L-формой. (A) Среда LM после автоклавирования. (B) 1,16 М сахарозы (2 x концентрация) после автоклавирования. (C) Сильно карамелизированная среда LM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Примеры L-формоподобных структур, наблюдаемых в моче пациентов с рецидивирующими ИМП с помощью фазово-контрастной микроскопии. (А,Б) Структуры, типичные для деления бактериальных L-форм, взвешенные в моче. (К,Г) Структуры, типичные для деления бактериальных L-форм, связаны с эукариотическими клетками. (Э,Ж) Серповидная структура, характерная для грамотрицательных L-форм (красная стрелка). (Ф,Г) Структуры, характерные для промежуточных стадий перехода между стенчатыми клетками и L-формами (красная стрелка в G). (H) Внутриклеточные везикулы, типичные для крупных L-форм. Масштабная линейка = 5 мкм. Эта цифра была изменена с¹⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Иллюстрация 4: Метод полосной пластины для индукции L-форм на твердых средах. (А) Схематическое изображение полосатых бактерий с использованием четверти пластины для индукции L-форм. Стрелка указывает направление распространения бактерий. (B) Пример роста L-формы Bacillus subtilis после полос, как показано на рисунке (A), после 3-дневной инкубации при 30 °C. (C) L-формы, индуцированные в (B), визуализированы с помощью фазово-контрастной микроскопии. Масштабная линейка = 5 мкм. Панели B и C были изменены по сравнению с¹⁶ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Протоколы, описанные в данной рукописи, были использованы для выделения и обработки L-форм различных видов бактерий из мочи человека, включая E. coli, Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterococcus и Enterobacter spp, все из которых обычно связаны с ИМП^10,24. Однако методы обработки L-форм, разработанные в одной лаборатории, могут не сработать сразу в другой, а то, что работает для одного штамма бактерий, может не работать для другого. Поэтому описанные здесь протоколы, скорее всего, потребуют многократных попыток и дополнительной оптимизации. В частности, может потребоваться проверка потребности в питательных веществах, доступности кислорода, концентрации осмопротекторов и текучести среды. Условия, оптимальные для перехода и роста L-формы, могут отличаться от условий, оптимальных для роста стенчатых форм того же вида. Кроме того, при попытке использования протоколов может возникнуть ряд технических проблем.

Распространенной проблемой, связанной с получением L-формных сред, является карамелизация сахарозы после автоклавирования. Если среда приобретает темно-коричневый цвет, ее следует выбросить и подготовить новую партию. Может потребоваться приготовить сахарозу в воде в одной бутылке, а остальные ингредиенты в другой, обе в 2-кратной концентрации. Затем после автоклавирования можно объединить 2x концентрированных раствора в соотношении 1:1 для достижения желаемых конечных концентраций. Сахароза, автоклавированная отдельно, может иметь слегка желтый цвет (Рисунок 2В), что допустимо, но если она становится темно-коричневой (Рисунок 2В), ее не следует использовать для экспериментов. Для облегчения карамелизации сахарозы может потребоваться регулировка продолжительности и температуры цикла автоклавирования. Рекомендуется проводить испытание стерильности сред, приготовленных с использованием отрегулированного цикла автоклава, путем инкубации аликвоты каждой из сред в течение не менее 3 суток при 37 °С. Наконец, может потребоваться проверить альтернативное осмопротекторное средство, такое как соль, если проблема с карамелизацией сохраняется¹⁸.

При выделении L-форм из образцов пациента также может возникнуть ряд проблем. Как указано в протоколе, L-формы, присутствующие в образцах, могут потенциально испортиться; Поэтому важно как можно скорее после сдачи материала перевезти образцы в лабораторию. По этой же причине категорически не рекомендуется хранить образцы при низких температурах или изменять состав образца (например, путем добавления PBS).

Сам метод фильтрации имеет свои ограничения. Некоторые L-формы могут быть разорваны на части из-за поперечных сил, создаваемых потоком фильтрующего материала через фильтр. В исследовании Mickiewicz et al. только 41% L-форм в контрольных образцах, которые содержали индуцированные в лаборатории L-формы E. coli , прошли через фильтр¹⁰. Это свидетельствует о том, что метод фильтрации может привести к занижению количества положительных проб и не рекомендуется для количественных исследований.

В очень редких случаях, после фильтрации, на следующий день может наблюдаться значительный рост в аликвотах полужидких сред, используемых для выделения L-формы. Это может быть признаком того, что либо фильтр сломался во время протокола, что позволило пройти бактериям, содержащимся в стенах, либо образец был загрязнен. Хорошей практикой является выбрасывание таких образцов или, по крайней мере, обращение с ними с осторожностью. Ежедневный визуальный осмотр образцов имеет решающее значение для предотвращения ложноположительных результатов. Перед обработкой образцов мочи методом фильтрации рекомендуется пропустить несколько образцов лабораторно индуцированных L-форм, скрытых бактерий и стерильной среды через выбранный фильтр, чтобы контролировать эффективность разделения L-форм, потенциальное прохождение скрытых бактерий из-за поломки фильтра и убедиться, что используемая стерильная техника работает хорошо.

В редких случаях стабильные L-формы могут быть выделены с помощью фильтрации, при этом стенчатые формы не могут быть обнаружены с помощью микроскопии. Для поддержания жизнеспособности бактерий L-формы рекомендуется переносить несколько «петлей» образца в пробирку, содержащую свежую полужидкую среду LM, или повторно наносить твердую осмопротекторную среду каждые 3-7 дней, в зависимости от эффективности роста. Если после нескольких проходов не появляются стенчатые формы, можно попытаться заморозить образцы в 40% глицерине при температуре –80 °C для сохранения изолята; Однако некоторые L-формы могут плохо переносить такую процедуру.

Несмотря на свои ограничения, метод фильтрации до сих пор является единственным, используемым для отделения L-форм от стенчатых форм в образцах пациентов. Это позволяет идентифицировать штаммы бактерий, способные к переключению L-формы in vivo. Существует потенциал для разработки и адаптации метода фильтрации для выделения L-форм из других типов образцов человека или окружающей среды (например, крови или растений).

Принимая во внимание все вышеизложенные соображения, мы рекомендуем протоколы, изложенные в данной рукописи, в качестве хорошей отправной точки для разработки индивидуальных протоколов L-формы в отдельных лабораториях, а не в качестве жестких инструкций. Работа с L-формами требует большой осторожности, самоотверженности и терпения, но с практикой она может быть чрезвычайно полезной. Мы надеемся, что рекомендации, изложенные в этой рукописи, станут ориентиром для разработки протоколов L-форм и побудят больше фундаментальных и клинических исследовательских групп исследовать эти удивительные бактериальные формы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µL cut off filters	Sarstedt	83.1826
20 mL syringes	Fisher	17955460
30 mL polystyrene universal tubes	Starlab	E1412-3010
92 x 16 mm Petri Dishes	Starstedt	82.1473
Agar	Oxoid	LP0011
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135
Cover slips (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)	VWR	631-0137/-0125
D-cycloserine	Sigma-Aldrich	C6880
Glass microscope slides	VWR	631-1550P
Lysostaphin	Sigma-Aldrich	L7386
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L4919
MgSO4	VWR	25165.26
Moenomycin	Sigma-Aldrich	32404
Penicillin G	Sigma-Aldrich	13752
Phosphomycin	Sigma-Aldrich	P5396
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100