Filtration Method를 사용한 소변에서 L-form 박테리아 분리

요약

여기에서는 여과 방법을 사용하여 소변에서 L형 박테리아를 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. L-form medium의 준비, 위상차 현미경에 의한 L-form 관찰 및 실험실 조건에서 L-form의 유도를 위한 보완적인 방법도 설명됩니다.

초록

박테리아가 L-form 상태로의 전환은 세포벽 표적 항생제로 치료하는 동안 면역 회피 및 박테리아 지속성에 가능한 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 그러나 L-form 박테리아의 분리 및 처리는 주로 삼투압 변화에 대한 민감도가 높기 때문에 까다롭습니다. 여기에서는 L-form medium의 준비, 여과 방법을 사용한 소변에서 L-form의 분리, 위상차 현미경 검사에 의한 소변 샘플에서 L-form의 검출 및 in vitro에서 L-form의 유도에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. L-form의 생존 및 성장에 대한 정확한 요구 사항은 균주에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 여기에 제시된 방법은 정확한 지침이라기보다는 개별 실험실 내에서 L-form 프로토콜을 수립하기 위한 기본 지침으로 작용하기 위한 것입니다. 여과 방법은 샘플의 L-form 수를 줄일 수 있으므로 정량화에 사용해서는 안 됩니다. 그러나 이 방법은 세포벽이 결핍된 변이체를 벽으로 둘러싸인 변이체로부터 효과적으로 분리하고 요로 감염 환자에서 L자형 전환이 가능한 박테리아 균주를 식별하기 위해 지금까지 사용된 유일한 방법입니다. 여과 방법은 다른 범주의 박테리아 감염이 있는 환자 및 환경 샘플에서 L-form을 분리하는 데 적용할 수 있는 잠재력이 있습니다.

서문

거의 모든 박테리아는 세포벽이라고 하는 구조로 둘러싸여 있습니다. 벽은 환경 스트레스로부터 보호하는 데 중요하며 규칙적인 분열을 돕고 박테리아의 모양을 제공합니다¹. 그러나 이 장벽은 면역 체계의 일부와 페니실린 ^2,3을 포함하여 가장 우수하고 가장 많이 사용되는 항생제의 표적이기도 합니다. 그 중요성에도 불구하고 그람 양성 박테리아와 그람 음성 박테리아는 때때로 벽 없이 생존할 수 있습니다 ^4,5,6,7,8. 주변 조건이 파열을 방지할 수 있는 충분한 삼투압 보호를 제공하고 세포벽 표적 물질도 존재하는 경우 박테리아는 L-form ^4,5,6,7,8이라고 하는 벽이 없는 상태로 전환될 수 있습니다.

수많은 보고서에 따르면 L자형 상태로 전환했다가 다시 벽으로 둘러싸인 상태로 전환하는 것은 숙주 면역 체계의 공격과 세포벽 표적 항생제 치료에서 박테리아가 살아남을 수 있는 메커니즘으로 생체 내에서 중요할 수 있습니다 9,10,11,12,13,14,15. 이러한 전이는 잠재적으로 세균 감염의 재발에 대한 강력한 전략을 제공할 수 있습니다 9,10,11,12,13,14,15. L형 박테리아의 기본 생물학과 숙주와의 상호 작용을 이해하는 것은 발병기전에서 L형 박테리아의 역할을 해독하는 데 매우 중요합니다. 그러나 L자형 박테리아를 처리하는 것은 쉽지 않습니다.

첫째, 세포벽이 없기 때문에 L형 박테리아는 삼투압의 변화에 반응하여 파열되기 쉽습니다. 또한, L-form은 매우 불규칙한 방식으로 분열하고, 예측할 수 없는 성장 패턴을 가지며(일반적으로 벽으로 둘러싸인 것보다 훨씬 느림) 변형률에 따라 고체 또는 액체 매체보다 반액체에서 더 잘 전파될 수 있습니다. 위의 모든 고려 사항은 성장률의 정량화 및 비교를 어렵게 만듭니다. 다양한 박테리아 종(또는 균주)은 L-form 전환 및 성장에 대한 다양한 대사 요구 사항을 가지고 있습니다. 예를 들어, 호기성 호흡에 의존하는 특정 그람 양성 박테리아의 L-형태는 벽으로 둘러싸인 박테리아보다 활성 산소 종에 더 민감합니다¹⁶.

실험실 조건 및 숙주에서 L-형태의 유도는 일반적으로 항생제 및 라이소자임⁹과 같은 세포벽 표적 물질에 의해 주도됩니다. 이러한 처리는 부분적인 세포벽 손실만 초래할 수 있으므로 일부 벽(또는 부분적으로 벽)된 박테리아가 샘플에 존재할 수 있으므로 관찰된 실험 결과가 L-형태 또는 벽으로 둘러싸인 형태의 박테리아의 존재로 인한 것인지 구별하기 어렵습니다. in vivo에서 유도되는 L-form의 빈도는 낮은 경향이 있는데, 이는 발견 및 분리가 어려울 수 있음을 의미합니다. 마지막으로, 다형성 형태학으로 인해 L-형태는 자가사멸체 또는 다양한 과립과 같은 진핵 기원 구조와 현장에서 쉽게 혼동될 수 있습니다.

1935¹⁷ 년에 발견 된 이래로 실험실에서 L 형을 처리하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 이들 중 대부분은 성장 배지에 삼투압 보호제를 첨가하는 데 의존합니다. 보통 설탕 또는 소금 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. 위에서 언급했듯이 L-form은 환자 샘플에서 벽으로 둘러싸인 박테리아와 나란히 발생하는 경우가 많으며 두 집단을 분리하는 것은 어려울 수 있습니다. 그러나 벽으로 둘러싸인 박테리아와 달리 L-form은 유연성과 다양한 크기로 인해 0.45μm 필터를 통과할 수 있음이 입증되었습니다. 이러한 필터를 사용하는 방법은 소변에서 L 형태를 분리하기 위해 사용되었습니다 ^10,19,20,21.

여기에서는 여과 방법을 사용하여 소변에서 L형 박테리아를 분리하는 프로토콜을 제시합니다(그림 1). L-형태 배지의 준비, L-형태의 현미경 관찰 및 시험관 내 L-형태의 유도를 위한 보완적인 프로토콜도 설명됩니다.

프로토콜

1. L-form medium(LM)의 제조

1. 원하는 배지 부피의 두 배 크기의 유리병에 자당(최종 농도 0.58M을 달성하기 위해 조정된 양), MgSO₄ (최종 농도 8mM) 및 뇌 심장 주입(BHI)(공급업체에서 권장하는 양)을 계량합니다. 배지 0.5L를 준비하려면 자당 100g, MgSO₄ 1g 및 BHI 18.5g의 무게를 측정하고 1L 유리병에 넣습니다. 이렇게 하면 고압증기멸균 전에 성분을 더 쉽게 재현할 수 있습니다.
2. 고체 또는 반고체 매체가 필요한 경우 원하는 양의 한천을 추가하십시오. 고체 매체의 경우 5g의 한천을 첨가하여 0.5L의 배지에서 1%의 최종 농도를 달성합니다. 반고체 매체의 경우 1g의 한천을 첨가하여 0.5L의 배지에서 0.2%의 최종 농도를 달성합니다.
3. 원하는 최종 부피까지 탈이온수(DI)를 채웁니다.
4. 병을 닫고 흔들어 잘 섞는다. 재료를 완전히 다시 매달아 놓을 필요는 없으며 병 바닥에 뭉치지 않도록 하십시오. 민감한 매체 주기(115분 동안 115°C)에서 캡과 오토클레이브를 풉니다. 고압증기멸균 전에 성분을 혼합하고 민감한 매체 사이클을 사용하는 것은 성분의 응집과 자당 캐러멜화를 방지하기 위해 권장됩니다.
5. 오토클레이빙 후 매체를 육안으로 검사합니다. 덩어리가 없어야 하며 매체는 호박색이어야 합니다(그림 2A).
6. 오토클레이브 후에는 배지를 손으로 편안하게 잡을 수 있는 온도로 식히십시오.
7. L-형태의 유도에 배지가 필요한 경우, 이 시점에서 항생제 및/또는 용해제를 추가합니다(예: 최종 농도 400μg/mL의 포스포마이신, 200μg/mL의 페니실린 G, 400μg/mL의 D-시클로세린, 100μg/mL의 암피실린, 50μg/mL의 모에노마이신, 100μg/mL의 라이소자임 또는 5μg/mL의 리소스타핀). L-form 유도제(또는 둘 이상이 필요한 경우 제제)의 유형과 테스트된 각 박테리아 종에 대한 농도를 경험적으로 확립합니다.
8. 개별 부분 표본을 준비하려면 장갑을 착용하고 미생물 안전 캐비닛에서 작업하거나 분젠 버너를 사용하십시오. 배지는 장기간 배양이 필요할 수 있으며 불임이 가장 중요합니다.
   1. 고체 매체의 부분 표본을 준비하려면 25mL를 개별 92/16mm 페트리 접시에 옮기고 굳히십시오. 오염 위험을 줄이기 위해 플레이트를 직접 붓는 것보다 피펫터를 사용하는 것이 좋습니다. 플레이트를 과도하게 건조하지 마십시오.
   2. 반액체 부분 표본을 준비하려면 피펫터를 사용하여 5mL의 배지를 여러 개의 30mL 폴리스티렌 범용 용기에 옮기고 굳히게 합니다.
9. 미디어를 즉시 사용하거나 사용하기 전에 최대 일주일 동안 4°C에서 보관하십시오. 시간이 지남에 따라 화합물이 분해되기 때문에 농도가 감소할 수 있으므로 항생제가 포함된 배지를 보관하기 전에 제조업체 권장 사항을 확인하십시오.

2. 소변에서 L-form 분리

알림: 실험실 절차 중에는 장갑과 실험복을 착용하십시오. 미생물 안전 캐비닛에서 작업하거나 분젠 버너를 사용하십시오. 여과하는 동안 안전 구글을 착용하십시오.

1. 소변 샘플이 도착할 것으로 예상되기 최소 1시간 전에 작업 영역을 70% 에탄올로 닦고 필요한 반액체 LM 배지 부분 표본 수를 표시합니다.
   참고: 실험실에서 인간의 소변 샘플이 아닌 액체 LM 배지로 유도된 E. coli ST144¹⁰ L-forms의 현탁액이 프로토콜을 입증하는 데 사용됩니다.
2. 샘플을 처리하기 전에 70% 에탄올로 작업 영역을 다시 닦으십시오. 벤치의 한쪽에 원하는 수의 0.45μL 차단 필터, 20mL 주사기 및 시료 수와 동일한 여러 개의 빈 멸균 30mL 폴리스티렌 범용 용기를 배치합니다. 일부 샘플을 처리하는 데 하나 이상의 필터가 필요한 경우를 대비하여 예상되는 소변 샘플 수 외에 여러 개의 예비 필터를 추가합니다. LM 배지 부분 표본과 빈 멸균 30mL 폴리스티렌 범용 용기를 벤치 중앙의 안정적인 랙에 놓습니다. 현미경 검사를 병행하여 수행해야 하는 경우 유리 현미경 슬라이드, 22 x 22mm 커버슬립, 2μL 및 1mL 피펫, 멸균 10μL 및 1mL 팁, 멸균 1.5mL 튜브를 준비하고 벤치 마이크로 원심분리기를 사용할 수 있는지 확인하십시오.
3. 기증 후 가능한 한 빨리 기증자의 소변 샘플을 실험실로 운반하여 샘플에서 L자형 박테리아의 잠재적인 악화를 방지하십시오.
4. 장갑과 고글을 착용하고 안전 백에서 소변 샘플을 꺼내 에탄올을 뿌린 다음 닦아서 LM 배지 부분 표본과 멸균 예비 30mL 폴리스티렌 용기 근처의 랙에 놓습니다. 이 시점부터 한 번에 하나의 샘플을 처리합니다.
5. LM 배지, 여분의 폴리스티렌 범용 용기 및 소변이 들어 있는 튜브가 들어 있는 튜브의 뚜껑을 풉니다.
6. 패키지에서 주사기를 제거하고 플런저를 제거한 다음 오른쪽에 놓습니다.
7. 필터 패키지 뒷면에서 안전 용지를 당겨 주사기를 필터에 단단히 부착합니다(개별 제조업체 플라스틱 홀더에서 필터를 아래로 향하게 하여 멸균 상태를 유지하도록 합니다).
8. 빠르지만 조심스럽게 작업하여 LM 매체의 튜브에서 캡을 제거하고 버리고 주사기가 있는 필터를 튜브 위에 놓습니다.
9. 소변 샘플에서 캡을 제거하고 주사기에 ~10mL를 부드럽게 붓고(2mL만 걸러지지만 과도한 부피는 튀는 것을 방지함) 현미경 검사를 위해 1mL 이상이 남아 있는지 확인합니다. 0.5mL만 사용되지만 여과를 수행하는 동안 이러한 부피를 정확하게 측정하는 것은 비현실적이므로 대략적인 초과 부피가 유지됩니다.
10. 플런저를 주사기 뒤쪽에 매우 조심스럽게 놓습니다. 플런저가 완전히 작동 위치에 놓이기 전에 소량의 저항을 느낄 수 있으며 이 지점을 지나서 샘플을 쉽게 흘릴 수 있습니다. 소변 샘플을 처리하기 전에 물을 사용하여 여러 번 연습하십시오.
11. 플런저를 부드럽게 누르고 저항이 증가할 때까지 필터를 통해 소변 2mL를 통과시킵니다. s를 방지하기 위해 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의하십시오.ample이 쏟아지고 필터가 파손되는 것을 방지합니다. 샘플이 특히 조밀하고 너무 많은 저항을 생성하는 경우 샘플을 하나의 필터를 통과시키지 말고 여러 개의 필터를 통과시킵니다.
12. LM 매체가 들어 있는 튜브에 필터를 부드럽게 두드려 남아 있는 여과된 샘플을 제거하고, 필터와 주사기를 들어 올린 다음 예비 30mL 폴리스티렌 범용 용기의 캡을 LM 배지 및 여과된 소변이 들어 있는 튜브에 빠르게 놓고 튜브 내부와 캡 가장자리를 만지지 않도록 합니다. 필터, 주사기 및 예비 폴리스티렌 용기를 안전하게 폐기하십시오.
13. 최대 1개월 동안 30°C의 고정된 위치에서 샘플을 배양합니다. 이렇게 하면 필터를 통과한 L자형이 벽을 재생하고 벽으로 둘러싸인 박테리아로 성장하기 시작할 수 있습니다.
14. 성장의 증거를 찾기 위해 매일 샘플을 관찰하고 여과된 샘플이 들어 있는 튜브를 광원에 대고 관찰합니다. 양성 샘플의 경우 성장은 일반적으로 3-7일 이내에 나타납니다.
15. 성장이 감지되면 샘플을 미생물 안전 캐비닛 또는 분젠 버너 근처로 옮깁니다. 샘플을 열고 성장 영역을 목표로 5μL 플라스틱 루프에 조심스럽게 담근 다음 단일 콜로니²²를 얻기 위해 삼투압 보호 없이 표준 고체 BHI 배지에 샘플을 줄무늬를 만듭니다.
16. 동시에 3단계에서 설명한 대로 소량의 시료와 반액체 매체(~5μL)의 분획을 현미경으로 검사합니다. 샘플을 매체와 함께 미세한 슬라이드로 옮기면 샘플에 여전히 존재할 수 있는 L-형이 파열되지 않고 검출될 수 있습니다. 그러나 이 시점에서 대부분의 박테리아는 벽으로 둘러싸인 형태로 되돌아가 일반 막대 또는 구균으로 나타날 것으로 예상됩니다.
17. BHI 플레이트에 줄무늬가 있는 샘플을 37°C의 정지 위치에서 밤새 배양합니다.
18. 성장 증거를 검사하고, 5μL 루프를 사용하여 각 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 5mL의 액체 BHI를 접종합니다. 37 °C에서 밤새 흔들면서 배양합니다.
19. 하룻밤 배양을 사용하여 글리세롤 스톡을 준비하거나 선호하는 방법(예: Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit)을 사용하여 종 식별을 위해 DNA를 분리할 수 있습니다.

3. 위상차 현미경 검사에 의한 L-형태의 존재 여부에 대한 소변 샘플 검사

1. 남은 0.5mL의 소변 샘플을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 벤치 마이크로 원심분리기에서 8,000 x g 으로 1분 동안 회전합니다.
2. 상층액을 부드럽게 제거하고 약 20μL를 남기고 위아래로 부드럽게 3회 피펫팅하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
3. 유리 현미경 슬라이드에 1μL를 놓고 22 x 22mm 커버슬립으로 덮습니다(5μL 샘플을 검사하려면(2.16단계 참조) 22 x 50mm 커버슬립을 사용하여 커버슬립이 슬라이드에 잘 부착되는지 확인). 멸균 면모 패드를 사용하여 커버슬립을 부드럽게 눌러 밀봉을 만들고 커버 슬립이 움직일 수 없는지 확인합니다. 면봉 패드는 버리십시오.
4. 100x 위상차 대물렌즈가 장착된 현미경을 사용하여 L형과 유사한 구조의 존재 여부를 검사합니다(그림 3).
   참고: 환자 샘플에서 L-form-like structure의 박테리아 기원을 확인하려면 박테리아 염기서열^10,23에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 FISH(Fluorescent in situ hybridisation)로 샘플을 검사하는 것이 좋습니다.

4. in vitro에서 L-form 유도

1. 비삼투압 보호 매체(예: BHI)가 포함된 플레이트에 단일 콜로니²² 에 선택한 줄무늬 벽 박테리아를 넣고 37°C에서 밤새 정지 배양합니다.
2. 다음날, 1단계에서 설명한 대로 선택한 L-form 유도제를 포함하는 방투압 LM 배지를 준비합니다. 고체 매체로 원하는 수의 플레이트를 준비합니다.
3. 멸균 5μL 플라스틱 루프 또는 이쑤시개를 사용하여 전날 밤에 배양한 비삼투압 BHI 플레이트에서 넉넉한 양(~4-5콜로니 분)을 선택합니다.
4. 루프의 평평한 표면(가장자리가 아닌)을 사용하여 LM 플레이트에 박테리아를 줄무늬 표시하십시오. 플레이트 가장자리에서 한 번의 연속 동작으로 박테리아를 줄무늬 표시한 다음 플레이트를 90° 돌립니다. 루프를 첫 번째 줄무늬의 가장자리에 대고 연속적인 동작으로 줄무늬를 플레이트의 사분면에 펴고 여러 개의 겹치는 줄무늬로 박테리아를 점차적으로 희석합니다(원하는 경우 전체 플레이트를 사용할 수 있음). 플레이트의 사분면만 사용하는 경우 다른 사분면은 다중 유도에 사용할 수 있습니다.
   참고: 그림 4A 는 줄무늬의 방향을 개략적으로 보여줍니다. 여기서의 목표는 단일 군체가 아닌 가능한 한 많은 순수한 L-형태를 포함하는 성장 영역을 얻는 것입니다. 따라서 줄무늬 사이의 루프를 변경할 필요가 없습니다. L-형태의 단일 군체는 얻기가 매우 어려울 수 있으며 너무 적은 수의 박테리아를 사용하면 L-형태가 전혀 성장하지 않을 수 있습니다. 반면에, 유도에 너무 많은 벽으로 둘러싸인 박테리아가 사용된 경우 모든 박테리아가 스위치를 거치는 것은 아니며 일부는 여전히 벽을 유지할 수 있습니다. 가장 좋은 L-형태 성장 영역은 일반적으로 줄무늬의 중간에서 감지할 수 있습니다.
5. 플레이트를 비닐 봉지나 다른 용기에 넣어 건조되지 않도록 하고 30°C에서 배양합니다(일부 박테리아 종의 L-형태는 혐기성 조건에서 더 잘 자랄 수 있으므로 보다 효율적인 L-형태 성장을 위해 혐기성 챔버를 테스트할 수 있음). 매일 성장의 증거가 있는지 접시를 검사하십시오. 이것은 일반적으로 3-7일 이내에 나타납니다. 성장량은 변형에 따라 다릅니다. L-형태 성장의 예가 그림 4B에 나와 있습니다.
6. 현미경을 사용하여 L-form의 존재 여부를 확인합니다. 2μL LM 배지 방울을 현미경 슬라이드에 놓고 피펫 팁을 사용하여 줄무늬 중간에서 소량의 세포를 선택하고 방울에 다시 현탁시킵니다.
   1. 22 x 22mm 커버슬립으로 덮고 100x 위상차 대물렌즈가 있는 현미경을 사용하여 L-형의 존재 여부를 검사합니다. 대표적인 예가 그림 4C에서 찾을 수 있습니다.

결과

자당을 함유하는 L-form 배지는 오토클레이빙 후 다양한 정도의 캐러멜화를 거칠 수 있으며, 이는 색상 변화와 관련이 있습니다. 그림 2 는 자당을 함유한 고압멸균 매체의 대표적인 결과를 보여줍니다. 그림 2A 는 오토클레이빙 후 주황색으로 변한 LM 매체의 일반적인 예를 보여줍니다. 그림 2B 는 오토클레이빙 후 1.16M 자당 용액(LM 매체를 만드는 데 필요한 2배 농도)의 일반적인 예를 보여줍니다. 때때로, LM 배지 또는 슈크로스는 오토클레이빙 중에 광범위한 캐러멜화를 거칠 수 있으며, 이러한 경우 배지를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 도 2C 는 과-캐러멜화된 슈크로스 배지의 예를 나타낸다.

L-form 박테리아는 매우 이질적일 수 있으며 그림 3은 환자의 소변 샘플에서 관찰할 수 있는 L-form-like structure의 예를 보여줍니다. 소변 샘플에서 발견되는 L-form-like structure의 박테리아 기원을 확인하기 위해 박테리아 염기서열을 표적으로 하는 형광 프로브가 있는 FISH가 권장됩니다^10,23.

실험실 조건에서 유도된 L-형태의 성장 수준은 균주에 따라 다릅니다. 그림 4B 는 Bacillus subtilis L-형태 성장의 예를 보여주고, 그림 4C 는 그림 4B에서 유도된 L-form의 미시적 외관을 보여줍니다.

그림 1: 여과 방법을 사용한 L-형태의 분리 – 개략도. 소변 샘플은 0.45μm 필터를 통해 0.2% 한천이 보충된 삼투압 보호 LM 배지가 포함된 폴리스티렌 범용 용기에 통과합니다. 그런 다음 샘플을 30°C의 정지 위치에서 최대 한 달 동안 배양하고 성장 증거가 있는지 매일 육안으로 확인합니다. 이 잠복기를 통해 샘플에 존재하는 모든 L-형이 세포벽을 재생할 수 있습니다. 성장이 감지되면 박테리아를 규칙적이고 단단하며 삼투압이 없는 배지(예: 영양 한천 또는 뇌-심장 주입)가 포함된 플레이트에 다시 줄무늬를 만들어 단일 집락을 분리한 다음 DNA 추출 및 염기서열분석을 수행하여 분리된 박테리아 종을 식별할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: L형 미디어. (A) 오토클레이빙 후 LM 매체. (B) 오토클레이빙 후 1.16M 자당(2 x 농도). (C) 광범위하게 캐러멜화된 LM 배지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 위상차 현미경 검사로 재발성 요로감염 환자의 소변에서 관찰할 수 있는 L-형태 유사 구조의 예. (A,B) 소변에 부유하는 박테리아 L-형을 분열하는 전형적인 구조. (씨,디) 진핵 세포와 관련된 박테리아 L-형태를 분열하는 전형적인 구조. (E,F) 그람 음의 L-형태(빨간색 화살표)에 대한 초승달 모양의 구조 특성. (여,지) 벽으로 둘러싸인 세포와 L-형태 사이의 중간 전이 단계에 전형적인 구조( G의 빨간색 화살표). (H) 큰 L-형태에 전형적인 세포 내 소포체. 눈금 막대 = 5μm. 이 수치는¹⁰에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 고체 매체에서 L-형태의 유도를 위한 줄무늬 플레이트 기술. (A) L-형태의 유도를 위해 플레이트의 1/4을 사용하는 줄무늬 박테리아의 개략적 표현. 화살표는 박테리아가 줄무늬를 만드는 방향을 나타냅니다. (B) 30°C에서 3일 배양 후 (A)에 표시된 바와 같이 줄무늬 후 Bacillus subtilis L-형태 성장의 예. (C) 위상차 현미경으로 시각화된 (B)에서 유도된 L-형태. 스케일 바 = 5μm. 패널 B와 C는¹⁶에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 원고에 기술된 프로토콜은 일반적으로 요로감염과 관련이 있는 E. coli, Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterococcus 및 Enterobacter spp를 포함한 다양한 박테리아 종의 L-form을 인간의 소변에서 분리하고 처리하는 데 사용되었으며, 이들 모두는 일반적으로 UTI와 관련이 있습니다^10,24. 그러나 한 실험실에서 확립된 L-form 처리 방법은 다른 실험실에서 즉시 작동하지 않을 수 있으며 한 박테리아 균주에 대해 작동하는 방법이 다른 실험실에서는 작동하지 않을 수 있습니다. 따라서 여기에 설명된 프로토콜은 여러 번의 시도와 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. 특히, 영양 요구 사항, 산소 가용성, 삼투압 보호제 농도 및 배지의 유동성을 테스트해야 할 수 있습니다. L-형태의 전이 및 성장에 최적화된 조건은 동일한 종의 벽으로 둘러싸인 형태의 성장에 최적화된 조건과 다를 수 있습니다. 또한 프로토콜을 시도할 때 몇 가지 기술적 문제가 발생할 수 있습니다.

L-form media의 준비와 관련된 일반적인 문제는 오토클레이빙 후 자당 캐러멜화입니다. 매체가 짙은 갈색으로 변하면 폐기하고 새로운 배치를 준비해야 합니다. 한 병에 담긴 물에 자당을 넣고 다른 병에 남은 성분을 2배 농도로 준비해야 할 수도 있습니다. 그런 다음 2x 농축 용액을 고압증기멸균 후 1:1 비율로 결합하여 원하는 최종 농도를 달성할 수 있습니다. 별도로 오토클레이브된 자당은 색상이 약간 황색으로 변할 수 있지만(그림 2B), 이는 허용되지만 짙은 갈색으로 변하는 경우(그림 2C) 실험에 사용해서는 안 됩니다. 오토클레이빙 주기의 길이와 온도를 조정하는 것은 자당 캐러멜화를 완화하기 위해 필요할 수 있습니다. 조정된 오토클레이브 사이클을 사용하여 준비된 배지의 무균 상태를 테스트하고, 37°C에서 최소 3일 동안 각 배지의 부분 표본을 배양하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 캐러멜화(caramelization) 문제가 지속될 경우 소금과 같은 대체 삼투보호제를 시험해 볼 필요가 있을 수 있다¹⁸.

환자 샘플에서 L-form을 분리하는 동안에도 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 프로토콜에서 언급했듯이 샘플에 존재하는 L-형태는 잠재적으로 악화될 수 있습니다. 따라서 기증 후 가능한 한 빨리 샘플을 실험실로 운송하는 것이 중요합니다. 같은 이유로, 샘플을 저온에서 보관하거나 샘플 조성을 수정(예: PBS 첨가)하는 것은 강력히 권장되지 않습니다.

여과 방법 자체에는 한계가 있습니다. 일부 L-형은 필터를 통한 매체의 흐름에 의해 생성된 전단력으로 인해 찢어질 수 있습니다. Mickiewicz 등의 연구에서, 실험실에서 유도된 대장균 L-form을 포함하는 대조군 샘플의 L-form 중 41%만이 필터¹⁰을 통과했습니다. 이는 여과 방법이 양성 샘플의 수를 과소 평가할 수 있으며 정량 연구에는 권장되지 않는다는 것을 보여줍니다.

매우 드문 경우지만, 여과 후 다음 날 L-형태 분리에 사용되는 반액체 매체 부분 표본에서 상당한 성장이 관찰될 수 있습니다. 이는 프로토콜 중에 필터가 파손되어 벽으로 둘러싸인 박테리아가 통과할 수 있게 되었거나 샘플이 오염되었다는 표시일 수 있습니다. 이러한 샘플을 버리거나 최소한 주의해서 다루는 것이 좋습니다. 샘플에 대한 일일 육안 검사는 거짓 양성을 방지하는 데 중요합니다. 여과로 소변 샘플을 처리하기 전에 실험실에서 유도한 L-형태, 벽으로 둘러싸인 박테리아 및 멸균 매체의 여러 샘플을 선택한 필터를 통해 통과시켜 L-형태 분리의 효율성, 필터 파손으로 인한 벽으로 둘러싸인 박테리아의 잠재적 통과를 제어하고 사용된 멸균 기술이 잘 작동하는지 확인하는 것이 좋습니다.

드문 경우지만 안정적인 L-형은 현미경으로 감지할 수 있는 벽으로 둘러싸인 형태 없이 여과에 의해 분리될 수 있습니다. 생존 가능한 L-form 박테리아를 유지하려면 생식 효율에 따라 새로운 반액체 LM 배지가 들어 있는 튜브로 샘플을 여러 개 옮기거나 고체 삼투압 보호 배지를 다시 사용하는 것이 좋습니다. 여러 번의 계대 후에 벽으로 둘러싸인 형태가 나타나지 않으면 -80 ° C에서 40 % 글리세롤로 샘플을 동결하여 분리물을 보존하려고 시도 할 수 있습니다. 그러나 일부 L 형은 이러한 절차를 잘 견디지 못할 수 있습니다.

한계에도 불구하고 여과 방법은 환자 샘플에서 L-form과 walled form을 분리하는 데 지금까지 사용된 유일한 방법입니다. 이를 통해 in vivo에서 L-form 전환이 가능한 박테리아 균주를 식별할 수 있습니다. 다른 유형의 인간 또는 환경 샘플(예: 혈액 또는 식물)에서 L-form을 분리하기 위한 여과 방법을 개발하고 적용할 수 있는 잠재력이 있습니다.

위의 모든 고려 사항을 고려하여, 이 원고에 요약된 프로토콜은 엄격한 지침이 아닌 개별 실험실에서 맞춤형 L-form 프로토콜을 개발하기 위한 좋은 출발점으로 권장됩니다. L-form으로 작업하려면 세심한 주의, 헌신 및 인내가 필요하지만 연습을 통해 매우 보람 있는 일이 될 수 있습니다. 우리는 이 원고에 요약된 지침이 L-form 프로토콜 개발의 기준이 되기를 희망하며, 더 많은 기초 및 임상 연구 그룹이 이러한 매혹적인 박테리아 형태를 조사하도록 장려하기를 바랍니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µL cut off filters	Sarstedt	83.1826
20 mL syringes	Fisher	17955460
30 mL polystyrene universal tubes	Starlab	E1412-3010
92 x 16 mm Petri Dishes	Starstedt	82.1473
Agar	Oxoid	LP0011
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135
Cover slips (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)	VWR	631-0137/-0125
D-cycloserine	Sigma-Aldrich	C6880
Glass microscope slides	VWR	631-1550P
Lysostaphin	Sigma-Aldrich	L7386
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L4919
MgSO4	VWR	25165.26
Moenomycin	Sigma-Aldrich	32404
Penicillin G	Sigma-Aldrich	13752
Phosphomycin	Sigma-Aldrich	P5396
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100