Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف إجراءات عزل البويضات المتنامية من بصيلات المبيض في المراحل المبكرة من التطور ، وكذلك إعداد نظام ثقافة في المختبر يمكن أن يدعم النمو والتمايز حتى المرحلة الكاملة النمو.

Abstract

يمثل الاحتياطي المحدود من البويضات الناضجة القابلة للتخصيب عائقاً رئيسياً أمام نجاح التكاثر المساعد في الثدييات. وبالنظر إلى أنه خلال فترة الحياة الإنجابية فقط حوالي 1٪ من البويضات في المبيض الناضجة والاباضة، وقد تم تطوير العديد من التقنيات لزيادة استغلال احتياطي المبيض لأعداد متزايدة من بصيلات غير مبيضة. وقد سمحت هذه التكنولوجيات بالتدخل في مجال المحافظة على الخصوبة، وبرامج الاختيار في الثروة الحيوانية، وحفظ الأنواع المهددة بالانقراض. ومع ذلك، فإن الإمكانات الهائلة لاحتياطي المبيض لا تزال غير مستغلة إلى حد كبير. ففي الأبقار، على سبيل المثال، بذلت بعض المحاولات لدعم الثقافة المختبرية للبويضات في مراحل نمو محددة، ولكن لم يتم بعد وضع بروتوكولات فعالة وموثوقة. هنا نحن وصف نظام الثقافة التي تستنسخ الظروف الفسيولوجية للمرحلة المسامية المقابلة، التي تعرف لتطوير في المختبر تزايد البويضات التي تم جمعها من بصيلات الأنطلية الأبقار في وقت مبكر إلى مرحلة نمت بالكامل، المقابلة لبصيلات النمل المتوسطة في الجسم الحي. تم استخدام مزيج من الهرمونات ومثبط phosphodiesterase 3 لمنع استئناف meiotic في وقت غير مناسب وتوجيه التمايز البويض.

Introduction

خلال فترة الحياة الإنجابية، يتم إطلاق جزء ضئيل فقط من البويضات الموجودة في المبيض الناضج، في قناة فالوب عند الإباضة، وتتوفر للتخصبات والتطور إلى جنين قابل للحياة1. من ناحية أخرى، فإن معظم البويضات داخل المبيض تخضع للضجر ولا يتم الإباضة أبداً. في المختبر إنتاج الجنين (IVP) التكنولوجيات قد حاولت زيادة استغلال احتياطي المبيض2,3. وقد سمحت هذه التكنولوجيات حتى الآن بالتدخل في مجال المحافظة على الخصوبة، وبرامج الاختيار في الثروة الحيوانية، وحفظ الأنواع المهددة بالانقراض. ومع ذلك، فإن معظم البروتوكولات تستخدم البويضات التي أكملت أساسا مرحلة النمو داخل بصيلات المبيض الأنتال، وبالتالي يشار إليها على أنها البويضات المزروعة بالكامل. في الماشية، حيث تستخدم تقنيات IVP على نطاق واسع، البويضات المزروعة بالكامل تصل إلى قطرها النهائي من حوالي 120 ميكرومتر ويتم جمعها من بصيلات التي تمتد من 2 إلى 8 ملم في القطر (بصيلات النمل المتوسط)1. عند العزل من بصيلات، والبويضات مثل في المختبر نضجت وتخصيب. ثم يتم استزراع الزيجوت حتى مرحلة الكيسة الأرومية ونقلها إما إلى مستلم أو إلى المبرد. في الماشية، وكذلك في العديد من الأنواع الأخرى، على الرغم من الإمكانات التي تقدمها IVP، لم يتحسن عدد الجنين في المختبر لكل بقرة بشكل كبير على مدى السنوات ال 40 الماضية. ويرجع ذلك جزئيا إلى العدد المحدود من البويضات المزروعة بالكامل التي تملأ المبيض في وقت معين والتي يمكن استردادها وإخضاعها لتقنيات IVP القياسية4،5،6.

البويضات المغلقة داخل بصيلات النملية المبكرة، أي تلك الجريبات التي تقل عن 2 مم في القطر، تمثل مصدراً محتملاً لاستخدامها في برامج الحفاظ على الخصوبة7 ، كما يحتوي المبيض تقريباً على 10 مرات أكثر من بصيلات الأنترال المبكرة من متوسطة8. ومع ذلك، هذه البويضات لا تزال في مرحلة النمو ولم تصل بعد المرحلة نمت بالكامل9. على هذا النحو، فإنها لا تزال نشطة النسخي، وإنتاج mRNAs التي سيتم تخزينها للخطوات التنموية في وقت لاحق، ولم تخضع بعد كل عملية التمايز المطلوبة لمنح البويضات مع القدرة على استئناف تلقائيا واستكمال meiosis أنا معزولة مرة واحدة من المقصورة الجريبي10،11. ولذلك، لا يمكن تقديمها مباشرة إلى بروتوكولات النضج في المختبر القياسي (IVM)، ولكنها تتطلب فترة إضافية من الثقافة تسمح لهم بإكمال مرحلة النمو والتمييز بشكل صحيح.

الانتقال من مرحلة النمو إلى مرحلة كاملة النمو، والتي تحدث في الماشية عندما يتطور الجريبات من أوائل النمل إلى المرحلة الأنرال المتوسطة، هي واحدة من الخطوات الحاسمة خلال التنمية البويضية. في الماشية، حاولت عدة دراسات لتكبيل هذه الأحداث في المختبر2،12،13،14،15،16،17،18،19. بيد أنه لم يتم حتى الآن وضع بروتوكولات موثوقة ولم يُبلّغ عن سوى نجاح محدود. وفقا للدراسات السابقة20, هذه البويضات المتنامية تشكل سكان متجانس. بالإضافة إلى كونها نشطة بشكل نسخي ، يتم تفريق chromatin في vesicle الجرثومي (GV) ، في تكوين يسمى GV02،21. وعلى العكس من ذلك، فإن عدد البويضات المزروعة بالكامل التي تم الحصول عليها من بصيلات النمل المتوسطة أكثر تجانساً، وهي حالة تعكسها درجات مختلفة من ضغط الكروماتين (GV1 وGV2 وGV3) التي يمكن ملاحظتها20. من بين هذه البيانات السابقة أظهرت أن GV2 وGV3 بويضات تتميز عموما من نوعية أفضل وأعلى كفاءة النمو الجنينية20,21,22,23,24.

بدءا من الملاحظات المذكورة أعلاه، هنا نحن وصف نظام ثقافة طويلة 5 أيام من البويضات (L-IVCO) التي تسمح للتمايز من البويضات معزولة كمجمعات الزلق cumulus-oocyte (COCs) من بصيلات الانطلية المبكرة. وقد تطورت هذه الاستراتيجية ثقافة من 10 سنوات دراسات طويلة أجريت في مختبرنا وجذور أرضها على تطوير سابقا 24-48 ساعة في ثقافة البويضات في المختبر (IVCO)2, نظم الخداج23,,25 والزنك خلال ثقافة البويض. مزيج من هرمون تحفيز بصيلات (FSH) و phosphodiesterase-3 (PDE3) المانع, قادرة على تعزيز cumulus-بويضة الاتصال2, منع استئناف meiotic في وقت غير مناسب2, ودعم نمو البويضات2 تم استخدامها.

Protocol

تم جمع المبيضين من 4 إلى 8 سنوات من العمر هولشتاين الأبقار الحلوب تعافى في المسلخ المحلية (INALCA S.p.A. ، أوسبيداليتو لودجيانو ، LO ، IT 2270M CE ، إيطاليا).

1- إعداد وسائط الإعلام

ملاحظة: يجب أن تكون كافة الوسائط تحضير أربع ساعات على الأقل قبل الاستخدام. يتم احتضان الوسائط الاحتياطية بيكربونات الصوديوم في 38.5 درجة مئوية و 5٪ CO2 في الهواء، والرطوبة القصوى. يتم الحفاظ على وسائل الإعلام التي تعمل بالتخزين المؤقت للـ HEPES عند 38.5 درجة مئوية في فرن الحرارة.

  1. ثقافة طويلة في المختبر من البويضات (L-IVCO) المتوسطة
    1. إعداد 15 مل من المتوسط الأساسية للثقافة (M199-B): ملحق M199 مع 2 mM الجلوتامين، 0.4٪ الأحماض الدهنية الحرة الأحماض البوفين المصل الألبومين (BSA)، 0.2 mM بيروفات الصوديوم، 25 mM بيكربونات الصوديوم، 0.1 mM سيثيمين، 21.3 ميكروغرام / مل من الفينول الأحمر، 75 ميكروغرام / مل من كاناميسين و 4٪ بولي فينيلبييروجليدون (PVP؛ 360 ك الوزن الجزيئي).
    2. إعداد 3 مل من المتوسط عقد (M199-H): إلى M199-B إضافة 5 μM cilostamide وصبه في طبق بيتري 35 ملم.
    3. إعداد متوسط L-IVCO (M199-L): ملحق M199-B مع 0.15 ميكروغرام / مل زن كبريتات، 10-4 وحدة دولية / مل FSH، 10 نانوغرام / مل استراديول، 50 نانوغرام / مل التستوستيرون، 50 نانوغرام / مل البروجسترون و 5 ميكروم Cilostamide.
    4. ضع 200 ميكرولتر من M199-L المتوسطة في كل بئر من 96 لوحة مغلفة بشكل جيد. ملء الآبار في الحواف الأربعة من لوحة مع المياه الثقافة العقيمة للتعويض عن التبخر والحفاظ على الرطوبة المناسبة أثناء الثقافة.
    5. احتضان لوحة 96 بئر ومتوسطة M199-H في الحاضنة عند 38.5 درجة مئوية و 5٪ CO2 في الهواء، والرطوبة القصوى.
  2. تشريح المتوسطة
    1. إعداد وسيلة تشريح (M199-D): ملحق M199 مع 0.4٪ BSA الكسر الخامس، 0.164 mM البنسلين، 0.048 mM ستريبتوميسين، 1790 وحدة/ L الهيبارين. M199-D يمكن أن تكون مستعدة بكميات كبيرة، وصرفها في 20 مل aliquots وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 6 أشهر. عند الحاجة، دافئة وتكملة 1 aliquot.
    2. إعداد 20 مل من M199-D تكملة مع 5 μM cilostamide (M199-D cilostamide).

2. جمع المبيض ومعالجته

ملاحظة: تجري جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة (26 درجة مئوية) ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. استرداد المبيضين في المسلخ من الأبقار.
  2. ضع المبيضين في ملح ملحي معقّم (NaCl, 9 g/L) في 26 – 28 درجة مئوية مضافة مع البنسلين 100 U/mL وstreptomycin 0.1 ملغ/مل.
  3. نقل الأعضاء إلى المختبر في المالحة المعقمة الدافئة في غضون 4 ساعات.
  4. اغسل المبيضين 4x في محلول ملحي معقمة يتم الحفاظ عليه عند 26 درجة مئوية.
  5. إزالة جميع بصيلات النمل المتوسطة إلى الكبيرة عن طريق التعرق جميع بصيلات أكثر من 2 ملم في القطر باستخدام إبرة 18 G متصلة بمضخة طموح مع ضغط فراغ تعيين في -28 مم زئبق ووضع المبيضين المستنشق في beaker مع المالحة العقيمة في 26 درجة مئوية.
    ملاحظة: إزالة محتوى الجريبات > 2 ملم هي خطوة حاسمة لإزالة أكبر قدر ممكن من مصدر البويضات المزروعة بالكامل التي من شأنها أن "تلوث" التجربة.
  6. تحت غطاء تدفق الفقار الأفقي، ضع مبيض واحد في ذلك الوقت على لوحة تقطيع ثلاثية الفلورو العقيمة. باستخدام شفرة جراحية رقم 22 مثبتة على مقبض مشرط، وقطع شرائح من قشرة المبيض (الجزء الخارجي من المبيض، الذي يحتوي على بصيلات)، 1.5 – 2 مم سميكة ومتوازية مع المحور الرئيسي للجهاز.
  7. ضع شرائح قشرة المبيض في طبق بيتري زجاجي معقمة مغطى بتشريح المتوسطة على طبق دافئ عند 38.5 درجة مئوية.
    ملاحظة: من الآن فصاعدا يتم تنفيذ جميع الإجراءات في 38.5 درجة مئوية باستخدام لوحة دافئة.

3- اختيار الحويصلات وعزلها واسترجاعها

  1. ضع شريحة قشرة المبيض في طبق بيتري زجاجي 60 مم مع 2-3 مل من M199-D.
  2. باستخدام مجهر تشريح، حدد الجريبات بين 0.5 – 2 مم باستخدام العدسة المجهزة بالميك ميكرومتر.
  3. تحديد بصيلات صحية غير اترتيك تحت منظار الميكروسكوب. تقييم اتريسية بصيلات عن طريق مراقبة المعلمات المورفولوجية، مثل مظهر شفاف واضح جدا، مع COC الظلام داخل. تجاهل بصيلات الاترتيك ومعالجة جميع الآخرين.
  4. باستخدام شفرة جراحية رقم 22 مثبتة على مقبض مشرط إزالة أنسجة المبيض المحيطة بصيلات على جانب واحد حتى يتم كشف الجريبات على حافة واحدة.
  5. باستخدام إبرة 26G التي شنت على حقنة، وجعل بعناية شق في جدار المسام المكشوفة. هذا الإجراء سوف الافراج عن محتوى الجريبي، التي تتألف من COC، السائل الجريب وكتل من الخلايا.
  6. تحديد COC تحت المجهر وفحص سلامة الركام، وسلامة زونا pellucida والتجانس من السيتوبلازم. إذا تم استيفاء هذه المعايير، استلهم COC باستخدام ماصة P20.
  7. ضع COC المعزول في سيلوستاميد M199-D.
  8. مواصلة إجراء العزل لمدة 30 دقيقة.

4- اختيار اللجان المشتركة التي ستخضع للثقافة في المختبر

  1. تحت مجهر التشريح، حدد COCs صحية استناداً إلى المعايير في الخطوة 3.6.
  2. في طبق بيتري 60 مم، إعداد 16 قطرات من 20 ميكرولتر من سيلوستاميد M199-D ووضع واحد COC صحية لكل قطرة(الشكل 1A).
  3. باستخدام مجهر مقلوب تعلق على الكاميرا قياس قطر البويضة، باستثناء pellucida زونا، وذلك باستخدام البرنامج المقدمة مع الكاميرا.
  4. مع تصور واضح من البويضة، وجعل اثنين من القياسات عمودي باستثناء pellucida زونا (الشكل 1B).
  5. التأكد من ما إذا كان متوسط قياس البويضة اثنين، باستثناء pellucida زونا، هو ضمن نطاق 100 - 110 ميكرومتر. تجاهل COCs مع بويضة غير مدورة على شكل أو مع البويضات التي لا يمكن قياسها.
  6. نقل COCs المختارة في طبق 35 مم يحتوي على متوسط M199-H والاحتفاظ بها في الحاضنة عند 38.5 درجة مئوية و 5٪ CO2 في الهواء، والرطوبة القصوى حتى الخطوة 5.1.
  7. كرر الخطوتين 3 و4 حتى 4x. يجب ألا يتجاوز إجمالي وقت العمل 2 ساعة.

5. ثقافة طويلة في المختبر من البويضات (L-IVCO)

  1. نقل COC واحد في بئر في وسط بئر من 96 بئر لوحة ليتم إعدادها في الخطوة 1.1.5.
  2. احتضان لوحة لمدة 5 أيام في 38.5 درجة مئوية و 5٪ CO2 في الهواء، والرطوبة القصوى.
  3. كل يومين (يومين و 4) تحضير M199-L الطازجة كما هو موضح في الخطوة 1.
  4. تجديد نصف المتوسط عن طريق إزالة 100 ميكرولتر من المتوسط واستبدالها بـ 100 ميكرولتر من M199-L الطازجة. قم بإجراء التجديد المتوسط تحت منظار الميكروكروسكوب وتجنب تحريك الـ COCs إلى البئر.

6. تصنيف COC بعد الثقافة

  1. في نهاية L-IVCO، تحليل مورفولوجيا COCs تحت مجهر تشريح.
  2. تصنيف كما هو مبين في الشكل 2.
    1. تصنيف الفئة 1 إذا COCs إظهار الاستثمار خلية cumulus مضغوط مع أي علامة على التوسع cumulus وانحطاط الخلية.
    2. تصنيف الفئة 2 إذا COCs إظهار الاستثمار خلية cumulus المدمجة مع عدم وجود علامة على التوسع وانحطاط الخلايا والخلايا مع تشكيل يشبه antrum في كتلة cumulus.
    3. تصنيف الفئة 3 إذا COCs تظهر عدة طبقات من خلية الكومبلوس مع عدم وجود علامة على التوسع cumulus وبعض الخلايا المصنفة في الطبقة الخارجية من خلايا الكامولو ولا تشكيل يشبه النوب.
    4. تصنيف الفئة 4 إذا COCs يظهر فقدان وفير من الخلايا الركام تمتد لأكثر من 50٪ من سطح البويضة، وعلامات انحطاط الخلية والحطام الخلية.

7. تقييم التطور الميوتي بعد الثقافة

  1. بويضة البويضات
    1. ضع كل COC في بئر واحد من لوحة رباعية الآبار تحتوي على 400 ميكرولتر من 199D لكل بئر.
    2. تحت مجهر تشريح بلطف إزالة خلايا الركام ميكانيكيا عن طريق الأنابيب المتكررة باستخدام ماصة تعيين في 130-140 μL.
    3. مرة واحدة البويضات خالية من الاستثمار cumulus، ونقلها إلى بئر آخر يحتوي على 199D.
    4. كرر العملية حتى يتم اغراس جميع البويضات تماما.
  2. بويضة نووية
    ملاحظة: من الآن فصاعدا يتم تنفيذ جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة. الكواشف في درجة حرارة الغرفة.
    1. إصلاح البويضات في paraformaldehyde 4٪ في المالحة العازلة الفوسفات (PBS) لمدة 1 ساعة.
      تنبيه: ارتداء معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع شبه الأشكال والتخلص من المواد الملوثة وفقًا للمبادئ التوجيهية للتخلص من النفايات الخطرة.
    2. غسل البويضات 3x لمدة 5 دقائق كل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ بولي فينيللكوهول (PVA).
      ملاحظة: يمكن معالجة العينات على الفور أو تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة أقصاها أسبوع واحد.
    3. ضع البويضات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ تريتون X لمدة 10 دقيقة.
    4. غسل البويضات 3x لمدة 5 دقائق كل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ PVA.
    5. وضع البويضات بشكل فريد في قطرات من 5 ميكرولتر من antifade المتوسطة تكمل مع 4'، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) dilactate (1 ميكروغرام / مل) على شريحة.
    6. ضع شريطين من الشريط على الوجهين على طول الجانبين الطويلين للشريحة، لتجنب التسطيح المفرط للبويضات عند وضع زلة الغطاء على القمة.
    7. ضع زلة الغطاء على القمة ، وجعلها تلتزم الشريط والاحتفاظ بها في الظلام أثناء معالجة جميع العينات.
    8. تحليل البويضات باستخدام المجهر epifluorescence التقليدية مجهزة مرشحات DAPI (الإثارة / الانبعاث: 358/461) لتقييم التقدم meiotic من البويضات.
    9. تصنيف البويضات وفقا لتقدمها meiotic: GV - البويضات مع درجات مختلفة من التكثيف الكروماتين داخل GV; MI – البويضات من GV كسر وصولا الى ميتافاسي I; ومنحط – البويضات التي لا يمكن تحديدها على أنها في أي من المراحل السابقة.

النتائج

في نهاية L-IVCO، تغير التشكل الإجمالي لCOCS وتم تحديد 4 فئات بناءً على مظهر خلايا الركام، كما هو موضح في الشكل 2. استنادا إلى المعايير المورفولوجية التي اعتمدت عادة لاختيار COCs صحية11,26,,27, الفئة 1, 2 و 3 واعتبرت صحية, في حين أن الفئة 4...

Discussion

هنا نحن وصف نظام ثقافة لزبد البويضات المتنامية التي تعزز التنمية بويضات لمدة 5 أيام من خلال دعم قدرتها على البقاء ومنع استئناف meiotic. هذا الجانب الأخير هو من أهم أهمية للسماح للنمو المستمر والتمايز اللازمة لمنح البويضة مع الكفاءة التنموية meiotic والجنينية2,20, ا?...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 و UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-well dishesNunclon179830
96-well dishBecton Dickinson Biosciences356649BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)SigmaA8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V)SigmaA3311
Cell culture waterSigmaW3500
CilostamideSigmaC7971
CysteamineSigmaM9768
Digital cameraNikon CorpCamera DS-5M
Disodium phosphateSigmaS5136
EstradiolSigmaE2758
Glutamax SupplementThermo Fisher Scientific35050061
Gonal FMerck Serono
HeparinSigmaH3149
HepesSigmaH3784
Vacuum pumpCook-IVF
IncubatorSanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticusSigmaK1377
Medium 199SigmaM3769Powder for hepes-buffered TCM199
Medium 199SigmaM2520Powder for M199-D
MicroscopeNikon CorpNikon Diaphot
MicroscopeNikon CorpEclipse E 600
Monopotassium phosphateSigmaP5655
ParaformaldehydeSigma158127
PenicilinSigmaP3032
Phenol RedSigmaP5530
Polyvinyl alcoholSigmaP8137
PolyvinylpyrrolidoneSigmaP5288360k molecular weight
Potassium chlorideSigmaP5405
ProgesteroneSigmaP8783
Sodium bicarbonateSigmaS5761
Sodium chorideSigmaP5886
Sodium pyruvateSigmaP4562
StreptomycinSigmaS9137
TestosteroneSigma86500
Triton XSigmaT9284
Vectashield with DAPIVector LaboratoriesH1200
WaterSigmaW3500
Zinc sulfate heptahydrateSigmaZ0251

References

  1. Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
  2. Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
  3. McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  4. Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
  5. Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
  6. Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
  7. Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
  8. Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
  9. Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
  10. Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
  11. Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
  12. Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
  13. Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
  14. Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
  15. Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
  16. Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
  17. Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
  18. Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
  19. Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
  20. Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
  21. Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
  22. Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
  23. Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
  24. Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
  25. Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
  26. Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
  27. Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
  28. Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
  29. Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  30. Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
  31. Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
  32. Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
  33. Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
  34. Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
  35. Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
  36. Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
  37. Gordon, I. . Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).
  38. Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
  39. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
  40. Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

161 IVP FSH

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved