Estratégia de Cultura In Vitro para Oócitos do Folículo Antral Primitivo em Bovinos

Resumo

Descrevemos os procedimentos para o isolamento dos oócitos em crescimento dos folículos ovarianos nos estágios iniciais de desenvolvimento, bem como a criação de um sistema de cultura in vitro que possa apoiar o crescimento e a diferenciação até o estágio totalmente crescido.

Resumo

A reserva limitada de oócitos maduros e fertilizantes representa uma grande barreira para o sucesso da reprodução assistida em mamíferos. Considerando que durante a vida reprodutiva apenas cerca de 1% dos oócitos em um ovário maduro e ovulado, várias técnicas foram desenvolvidas para aumentar a exploração da reserva ovariana para a crescente população de folículos não ovulatórios. Tais tecnologias permitiram intervenções de preservação da fertilidade, programas de seleção na pecuária e conservação de espécies ameaçadas de extinção. No entanto, o vasto potencial da reserva ovariana ainda é em grande parte inexplorado. Nas vacas, por exemplo, algumas tentativas foram feitas para apoiar a cultura in vitro de oócitos em estágios específicos de desenvolvimento, mas protocolos eficientes e confiáveis ainda não foram desenvolvidos. Aqui descrevemos um sistema cultural que reproduz as condições fisiológicas do estágio folicular correspondente, definido para desenvolver oócitos in vitro de crescimento coletados de folículos antral bovinos precoces para o estágio totalmente crescido, correspondente ao folículo antral médio in vivo. Uma combinação de hormônios e um inibidor de fosfodiesterase 3 foi usada para evitar a retomada meiotica prematura e para orientar a diferenciação do oócito.

Introdução

Durante a vida reprodutiva, apenas uma fração mínima dos oócitos que estão presentes em um ovário maduro, são liberados nos tubos de falópio após a ovulação, e estão disponíveis para serem fertilizados e se desenvolverem em um embrião viável¹. Por outro lado, a maioria dos oócitos dentro de um ovário sofre atresia e nunca são ovulados. As tecnologias de produção de embriões in vitro (IVP) têm tentado aumentar a exploração da reserva ovariana^2,3. Até agora, tais tecnologias permitiram intervenções de preservação da fertilidade, programas de seleção na pecuária e conservação de espécies ameaçadas de extinção. No entanto, a maioria dos protocolos usa oócitos que basicamente completaram a fase de crescimento dentro do folículo ovariano antral, e, portanto, são referidos como oócitos totalmente cultivados. No gado, onde as tecnologias IVP são amplamente utilizadas, os oócitos totalmente cultivados atingem um diâmetro final de aproximadamente 120 μm e são coletados de folículos que se estendem de 2 a 8 mm de diâmetro (folículos antral médios)¹. Após o isolamento dos folículos, tais oócitos são in vitro amadurecidos e fertilizados. Os zigotes são então cultivados até o estágio blastocisto e ou transferidos para um destinatário ou criopreservados. No gado, assim como em muitas outras espécies, apesar do potencial oferecido pelo IVP, o número de embriões produzidos in vitro por vaca não melhorou em grande parte nos últimos 40 anos. Isso se deve, em parte, ao número limitado de oócitos totalmente cultivados que povoam um ovário em um determinado momento que pode ser recuperado e submetido às técnicas padrão IVP^4,,5,,6.

Os oócitos fechados dentro dos folículos antrais primitivos, ou seja, aqueles folículos com menos de 2 mm de diâmetro, representam uma fonte potencial a ser usada nos programas de preservação da fertilidade^7, pois um ovário contém aproximadamente 10 vezes mais folículos antral mais precoces do que os antral^{médios 8}. No entanto, esses oócitos ainda estão em fase de crescimento e ainda não atingiram o estágio⁹completo . Como tal, eles ainda estão transcricionalmente ativos, produzindo mRNAs que serão armazenados para etapas posteriores de desenvolvimento, e ainda não passaram por todo o processo de diferenciação necessário para conferir aos oócitos a capacidade de retomar e completar espontaneamente a meiose que uma vez isolei do compartimento folicular^10,11. Portanto, eles não podem ser submetidos diretamente a protocolos de maturação in vitro padrão (IVM), mas exigem um período adicional de cultura que lhes permitiria completar a fase de crescimento e diferenciar adequadamente.

A transição do crescimento para o estágio totalmente cultivado, que no gado ocorre quando o folículo se desenvolve desde o início da antral até a fase antral média, é um dos passos críticos durante o desenvolvimento do oócito. No gado, diversos estudos tentaram recapitular esses eventos in vitro^{2,12,13,14,15,16,17,18,19}. No entanto, até o momento nenhum protocolo confiável foi desenvolvido e apenas o sucesso limitado foi relatado. De acordo com estudos anteriores²⁰, esses oócitos em crescimento constituem uma população homogênea. Além de ser transcriticamente ativo, sua cromatina é dispersada na vesícula germinal (GV), em uma configuração chamada GV0^2,21. Por outro lado, a população de oócitos totalmente cultivados obtidos a partir de folículos antrais médios é mais heterogênea, condição espelhada pelos diversos graus de compactação de cromatina (GV1, GV2 e GV3) que podem ser observados²⁰. Entre estes, dados anteriores mostraram que os oócitos GV2 e GV3 são, em^geral,caracterizados por uma melhor qualidade e maior competência de desenvolvimento embrionário^{20,21,,22,,23},²⁴.

A partir das observações acima, descrevemos aqui um sistema cultural de 5 dias de duração de oócitos (L-IVCO) que permite a diferenciação de oócitos isolados como complexos cumulus-oócitos (COCs) dos folículos antral primitivos. Essa estratégia cultural evoluiu a partir de 10 anos de estudos realizados em nosso laboratório e enraiza seu terreno na cultura oócida in vitro (IVCO)², sistemas de prematuração^23,,25 e suplementação de zinco durante a cultura oócito. Uma combinação de hormônio estimulante folículo (FSH) e um inibidor de fosfodiesterase-3 (PDE3), capaz de melhorar a comunicação cumulus-oocyte^2,prevenir a retomada meiotic intempescional², e apoiar o crescimento do oócito² foi usado.

Protocolo

Os ovários foram coletados de vacas leiteiras Holstein de 4 a 8 anos recuperadas no matadouro local (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, TI 2270M CE, Itália).

1. Preparação da mídia

NOTA: Todos os meios de comunicação devem ser preparados pelo menos quatro horas antes do uso. As mídias tamponadas de bicarbonato de sódio são incubadas a 38,5 °C e 5% de CO₂ no ar, umidade máxima. As mídias tamponadas com HEPES são mantidas a 38,5 °C em forno termostático.

1. Longa cultura in vitro de oócitos (L-IVCO) média
   1. Preparar 15 mL do meio de cultura básica (M199-B): Suplemento M199 com glutamina de 2 mM, 0,4% de gárbio bovino livre de ácido graxo albumina (BSA), piruvato de sódio de 0,2 mM, 25 mM de bicarbonato de sódio, 0,1 mM de cisteamina, 21,3 μg/mL de vermelho fenol, 75 μg/mL de kanamicina e 4% polivinylpyrrolidone (PVP; 360 mil peso molecular).
   2. Prepare 3 mL do meio de retenção (M199-H): Para M199-B adicione 5 μM de cilostamida e despeje-o em uma placa de Petri de 35 mm.
   3. Prepare o meio L-IVCO (M199-L): Suplemento M199-B com 0,15 μg/mL Zn sulfato, 10^-4 UI/mL FSH, 10 ng/mL estradiol, 50 ng/mL testosterona, 50 ng/mL progesterona e 5 μM Cilostiloamide.
   4. Coloque 200 μL de M199-L médio em cada poço da placa 96 bem revestida. Encha os poços nas quatro bordas da placa com água de cultura estéril para compensar a evaporação e manter a umidade adequada durante a cultura.
   5. Incubar a placa 96 e o m199-H médio na incubadora a 38,5 °C e 5% de CO₂ no ar, umidade máxima.
2. Meio de dissecação
   1. Preparar o meio de dissecção (M199-D): Suplemento M199 com 0,4% fração BSA V, penicilina de 0,164 mM, estreptomicina de 0,048 mM, 1790 unidades/L heparina. M199-D pode ser preparado a granel, dispensado em alíquotas de 20 mL e armazenado a 4 °C por 6 meses. Quando necessário, aqueça e suplemente 1 aliquot.
   2. Prepare 20 mL de M199-D suplementado com cilostamida de 5 μM (Cilostamida M199-D).

2. Coleta e processamento de ovários

NOTA: Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente (26 °C) a menos que indicado de outra forma.

1. Recupere os ovários do matadouro das vacas.
2. Coloque os ovários em soro fisiológico estéril (NaCl, 9 g/L) a 26 – 28 °C adicionados com penicilina 100 U/mL e estreptomicina 0,1 mg/mL.
3. Transporte os órgãos para o laboratório em soro fisiológico quente estéril dentro de 4h.
4. Lave os ovários 4x em soro fisiológico estéril mantido a 26 °C.
5. Remova todos os folículos antrais médios a grandes aspirando todos os folículos com mais de 2 mm de diâmetro usando uma agulha de 18 G conectada a uma bomba de aspiração com conjunto de pressão de vácuo a -28 mmHg e coloque os ovários aspirados em um béquer com soro fisiológico estéril a 26 °C.
   NOTA: A remoção do conteúdo dos folículos > 2 mm é um passo crítico para remover, tanto quanto possível, a fonte de oócitos totalmente cultivados que "contaminariam" o experimento.
6. Sob uma capa de fluxo laminar horizontal, coloque um ovário no momento em uma placa de corte de politefluoroetileno estéril. Utilizando uma lâmina cirúrgica nº 22 montada em uma alça de bisturi, corte fatias de córtex ovariano (a porção externa do ovário, que contém os folículos), 1,5 – 2 mm de espessura e paralela ao eixo principal do órgão.
7. Coloque as fatias do córtex ovariano em uma placa de vidro estéril de Petri coberta com meio de dissecação em uma placa quente a 38,5 °C.
   NOTA: A partir de agora todos os procedimentos são realizados a 38,5 °C usando uma placa quente.

3. Seleção e isolamento dos folículos e recuperação dos COCs

1. Coloque uma fatia de córtex ovariano em uma placa de Petri de vidro de 60 mm com 2-3 mL de M199-D.
2. Usando um microscópio de dissecção, selecione os folículos entre 0,5 e 2 mm usando uma ocular equipada com micrômetros.
3. Identifique os folículos saudáveis e não atreóticos sob o estereóscópio. Avalie a atresia folículo observando parâmetros morfológicos, como aparência translúcida muito clara, com um COC escuro dentro. Descarte os folículos atreóticos e processe todos os outros.
4. Usando uma lâmina cirúrgica nº 22 montada em uma alça de bisturi, remova o tecido ovariano ao redor do folículo de um lado até que o folículo seja exposto em uma borda.
5. Usando uma agulha 26G montada em uma seringa, faça cuidadosamente uma fenda na parede do folículo exposto. Esta ação liberará o conteúdo folicular, compreendendo o COC, fluido folicular e aglomerados de células.
6. Identifique o COC sob o microscópio e examine para integridade cumulus, integridade zona pellucida e homogeneidade do citoplasma. Se esses critérios forem preenchidos, aspire o COC usando uma pipeta P20.
7. Coloque o COC isolado em Cilostamida M199-D.
8. Continue o procedimento de isolamento por 30 minutos.

4. Seleção de COCs a serem submetidos à cultura in vitro

1. Sob o microscópio de dissecção, selecione COCs saudáveis com base nos critérios da etapa 3.6.
2. Em uma placa de Petri de 60 mm, prepare 16 gotas de 20 μL de cilostamida M199-D e coloque um COC saudável por gota(Figura 1A).
3. Utilizando um microscópio invertido ligado a uma câmera medida o diâmetro do oócito, excluindo a zona pellucida, utilizando o software fornecido com a câmera.
4. Com uma visualização clara do oócito, faça duas medições perpendiculares excluindo a zona pellucida (Figura 1B).
5. Assegurar se a média da medição dos dois oócitos, excluindo a zona pellucida, está dentro de uma faixa de 100 a 110 μm. Descarte COCs com oócito em forma não arredondada ou com oócitos que não sejam mensuráveis.
6. Transfira os COCs selecionados em um prato de 35 mm contendo m199-H médio e mantenha-os na incubadora a 38,5 °C e 5% de CO₂ no ar, umidade máxima até o passo 5.1.
7. Repita as etapas 3 e 4 até 4x. O tempo de trabalho total não deve exceder 2 h.

5. Longa cultura in vitro dos oócitos (L-IVCO)

1. Transfira um COC por poço no centro de um poço da placa 96 para ser preparado na etapa 1.1.5.
2. Incubar a placa por 5 dias a 38,5 °C e 5% de CO₂ no ar, umidade máxima.
3. Dia sim, dia 2 e dia 4) prepare m199-L fresco como descrito na etapa 1.
4. Renove metade do meio removendo 100 μL de médio e substituindo por 100 μL de M199-L recém-preparado. Realize a renovação média sob o estereóscópio e evite mover os COCs para o poço.

6. Classificação coc após a cultura

1. No final do L-IVCO, analise a morfologia dos COCs sob o microscópio de dissecção.
2. Classifique como descrito na Figura 2.
   1. Class 1 se os COCs mostrarem um investimento compacto de células cumulus sem nenhum sinal de expansão cumulus e degeneração celular.
   2. Class 2 se os COCs mostrarem um investimento compacto de células cumulus sem sinal de expansão cumulus e degeneração celular e com formação semelhante a antrum na massa cumulus.
   3. Class 3 se os COCs mostrarem várias camadas de célula cumulus sem sinal de expansão cumulus e algumas células desagregadas na camada externa de células cumulus e nenhuma formação semelhante a anão.
   4. Classificar como Classe 4 se os COCs mostrarem perda abundante de células cumulus estendendo-se por mais de 50% da superfície oócito, e sinais de degeneração celular e detritos celulares.

7. Avaliação da progressão meiotic após cultura

1. Desnudação de oócito
   1. Coloque cada COC em um único poço de uma placa de quatro poços contendo 400 μL de 199D por poço.
   2. Sob um microscópio de dissecção, remova suavemente as células cumulus mecanicamente por pipetação repetida usando um conjunto de pipeta a 130-140 μL.
   3. Uma vez que os oócitos estejam livres do investimento cumulus, transfira-os para outro poço contendo 199D.
   4. Repita o processo até que todos os oócitos estejam completamente desnudos.
2. Oócito mancha nuclear
   NOTA: A partir de agora todos os procedimentos são realizados em temperatura ambiente. Os reagentes estão em temperatura ambiente.
   1. Fixar os oócitos em paraformaldeído 4% em soro fisiológico tampão fosfato (PBS) por 1 h.
      ATENÇÃO: Use equipamentos de proteção individual ao manusear paraformaldeído e descarte de materiais contaminados de acordo com as diretrizes de descarte de resíduos perigosos.
   2. Lave os oócitos 3x por 5 min cada em PBS contendo 1% de polivinalcohol (PVA).
      NOTA: As amostras podem ser processadas imediatamente ou armazenadas a 4 °C durante o máximo de uma semana.
   3. Coloque os oócitos em PBS contendo 0,1% Triton X por 10 min.
   4. Lave os oócitos 3x por 5 min cada em PBS contendo 1% de PVA.
   5. Coloque os oócitos singularmente em gotas de 5 μL de antifado médio suplementado com dilatato de 4',6-diamidino-2-fenilôle (DAPI) (1 μg/mL) sobre um slide.
   6. Coloque duas tiras de fita dupla face ao longo das laterais longas do slide, para evitar o achatamento excessivo dos oócitos ao colocar o deslizamento da tampa em cima.
   7. Coloque o deslizamento da tampa em cima, faça com que adera à fita e mantenha no escuro enquanto processa todas as amostras.
   8. Analise os oócitos utilizando um microscópio de epifluorescência convencional equipado com filtros DAPI (Excitação/Emissão: 358⁄461) para avaliar a progressão meiotic dos oócitos.
   9. Classificar os oócitos de acordo com sua progressão meiotic: GV - oócitos com diferentes graus de condensação de cromatina dentro do GV; MI – oócitos de GV quebrando para metafase I; e degenerados – oócitos que não poderiam ser identificados como estando em qualquer uma das etapas anteriores.

Resultados

Ao final do L-IVCO, a morfologia bruta dos COCs mudou e 4 classes foram identificadas com base no aparecimento das células cumulus, como mostra a Figura 2. Com base nos critérios morfológicos comumente adotados para selecionar COCs saudáveis^11,,26,,27, as classes 1, 2 e 3 foram julgadas saudáveis, enquanto a classe 4, que apresentava sinais claros de degeneração, como a ausência de camadas c...

Discussão

Aqui descrevemos um sistema cultural para o crescimento de oócitos que promove o desenvolvimento de oócitos por 5 dias, apoiando sua viabilidade e impedindo a retomada do meiotico. Este último aspecto é de extrema importância para permitir o crescimento contínuo e a diferenciação necessários para conferir o oócito com competência de desenvolvimento meiotic e embrionário^2,20, que seria bloqueado de outra forma por uma retomada prematura da divisão mei...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well dishes	Nunclon	179830
96-well dish	Becton Dickinson Biosciences	356649	BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)	Sigma	A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Sigma	A3311
Cell culture water	Sigma	W3500
Cilostamide	Sigma	C7971
Cysteamine	Sigma	M9768
Digital camera	Nikon Corp	Camera DS-5M
Disodium phosphate	Sigma	S5136
Estradiol	Sigma	E2758
Glutamax Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
Gonal F	Merck Serono
Heparin	Sigma	H3149
Hepes	Sigma	H3784
Vacuum pump	Cook-IVF
Incubator	Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma	K1377
Medium 199	Sigma	M3769	Powder for hepes-buffered TCM199
Medium 199	Sigma	M2520	Powder for M199-D
Microscope	Nikon Corp	Nikon Diaphot
Microscope	Nikon Corp	Eclipse E 600
Monopotassium phosphate	Sigma	P5655
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicilin	Sigma	P3032
Phenol Red	Sigma	P5530
Polyvinyl alcohol	Sigma	P8137
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	P5288	360k molecular weight
Potassium chloride	Sigma	P5405
Progesterone	Sigma	P8783
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium choride	Sigma	P5886
Sodium pyruvate	Sigma	P4562
Streptomycin	Sigma	S9137
Testosterone	Sigma	86500
Triton X	Sigma	T9284
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Water	Sigma	W3500
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	Z0251