In Vitro Kulturstrategie für Oozyten aus dem frühen Antralfollikel bei Rindern

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Verfahren zur Isolierung wachsender Eizellen von Eierstockfollikel in frühen Entwicklungsstadien sowie den Aufbau eines In-vitro-Kultursystems, das das Wachstum und die Differenzierung bis in die ausgewachsene Phase unterstützen kann.

Zusammenfassung

Die begrenzte Reserve an reifen, befruchtbaren Eizellen stellt ein großes Hindernis für den Erfolg der assistierten Fortpflanzung bei Säugetieren dar. Wenn man bedenkt, dass während der Fortpflanzungszeit nur etwa 1% der Eizellen in einem Eierstock reifen und Eizellen entwickelt wurden, wurden mehrere Techniken entwickelt, um die Ausbeutung der Eierstockreserve für die wachsende Bevölkerung von nicht-ovulatorischen Follikel zu erhöhen. Solche Technologien haben Eingriffe in die Fruchtbarkeitserhaltung, Selektionsprogramme in Nutztieren und die Erhaltung gefährdeter Arten ermöglicht. Das enorme Potenzial der Eierstockreserve ist jedoch noch weitgehend ungenutzt. Bei Kühen wurden beispielsweise einige Versuche unternommen, die In-vitro-Kultur der Eizellen in bestimmten Entwicklungsstadien zu unterstützen, aber es wurden noch keine effizienten und zuverlässigen Protokolle entwickelt. Hier beschreiben wir ein Kultursystem, das die physiologischen Bedingungen des entsprechenden Follikelstadiums reproduziert, definiert, um in vitro wachsende Eizellen zu entwickeln, die aus rinderfrühen Antralenfollikel gesammelt werden, bis zum ausgewachsenen Stadium, das dem medium antralen Follikel in vivo entspricht. Eine Kombination von Hormonen und einem Phosphodiesterase-3-Hemmer wurde verwendet, um eine vorzeitige meiotische Wiederaufnahme zu verhindern und die Differenzierung der Oozyten zu steuern.

Einleitung

Während der Fortpflanzungsdauer wird nur ein minimaler Bruchteil der Eizellen, die in einem Eierstock reifen, in den Eileitern nach dem Eisprung freigesetzt und zur Befruchtung zur Verfügung gestellt und zu einem lebensfähigen Embryo¹entwickelt. Auf der anderen Seite, die meisten der Eizellen innerhalb eines Eierstocks unterziehen Atresie und werden nie eigewellt. In-vitro-Embryoproduktion (IVP) Technologien haben versucht, die Ausbeutung der Eierstockreserve zu erhöhen^2,3. Bisher haben solche Technologien Eingriffe in die Fruchtbarkeitserhaltung, Selektionsprogramme bei Nutztieren und die Erhaltung gefährdeter Arten ermöglicht. Dennoch verwenden die meisten Protokolle Eizellen, die im Grunde die Wachstumsphase innerhalb des antralen Ovarialfollikels abgeschlossen haben, und werden daher als ausgewachsene Eizellen bezeichnet. Bei Rindern, bei denen IVP-Technologien weit verbreitet sind, erreichen ausgewachsene Eizellen einen Enddurchmesser von ca. 120 m und werden aus Follikel mit einem Durchmesser von 2 bis 8 mm (mittlere Antraline)¹gesammelt. Nach Isolierung von den Follikel werden solche Eizellen in vitro gereift und befruchtet. Die Zygoten werden dann bis zum Blastozystenstadium kultiviert und entweder in einen Empfänger übertragen oder kryokonserviert. Bei Rindern wie auch bei vielen anderen Arten hat sich die Zahl der in vitro produzierten Embryonen pro Kuh in den letzten 40 Jahren trotz des Potenzials von IVP nicht wesentlich verbessert. Dies ist zum Teil auf die begrenzte Anzahl ausgewachsener Eizellen zurückzuführen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt einen Eierstock bevölkern, der abgerufen und den Standard-IVP-Techniken^4,5,6unterzogen werden kann.

Die in frühen Antradenfollikel eingeschlossenen Eizellen, d.h. die Follikel mit einem Durchmesser von weniger als 2 mm, stellen eine potentielle Quelle dar, die in Fruchtbarkeitserhaltungsprogrammen⁷ verwendet werden kann, da ein Eierstock etwa 10-mal mehr frühe Anralfollikel enthält als mittlere Antral8 .⁸ Diese Eizellen befinden sich jedoch noch in der Wachstumsphase und haben noch nicht die ausgewachsene Stufe⁹erreicht. Als solche sind sie immer noch transkriptional aktiv, produzieren mRNAs, die für spätere Entwicklungsschritte gespeichert werden, und haben noch nicht alle Differenzierungsprozess erforderlich, um die Eizellen mit der Fähigkeit der spontanen Wiederaufnahme und Vervollständigung der Meiose ich einmal isoliert aus dem Follikulärfach^10,11. Daher können sie nicht direkt den Standard-In-vitro-Reifungsprotokollen (IVM) unterzogen werden, aber sie erfordern eine zusätzliche Kulturperiode, die es ihnen ermöglichen würde, die Wachstumsphase abzuschließen und richtig zu differenzieren.

Der Übergang vom Anbau zum ausgewachsenen Stadium, der bei Rindern auftritt, wenn sich der Follikel vom frühen Antrale zum mittleren antralen Stadium entwickelt, ist einer der kritischen Schritte während der Eizellenentwicklung. Bei Rindern versuchten mehrere Studien, diese Ereignisse in vitro^{2,12,13,14,15,16,17,18,19}zu rekapitulieren. Bisher wurden jedoch keine zuverlässigen Protokolle entwickelt und nur begrenzter Erfolg gemeldet. Nach früheren Studien²⁰bilden diese wachsenden Eizellen eine homogene Population. Neben der Transkriptionsaktivität wird ihr Chromatin im Keimbläschen (GV) in einer Konfiguration mit dem Namen GV0^2,21verteilt. Umgekehrt ist die Population ausgewachsener Eizellen, die aus mittleren Antralenfolliken gewonnen werden, heterogener, ein Zustand, der sich in den verschiedenen Graden der Chromatinverdichtung (GV1, GV2 und GV3) widerspiegelt, die beobachtet werden können²⁰. Unter diesen haben frühere Daten gezeigt, dass GV2 und GV3 Oozyten insgesamt durch eine bessere Qualität und höhere embryonale Entwicklungskompetenz gekennzeichnet sind^{20,21,22,23,24}.

Ausgehend von den obigen Beobachtungen beschreiben wir hier ein 5 Tage langes Kultursystem von Eizellen (L-IVCO), das die Differenzierung von Eizellen ermöglicht, die als Cumulus-Oozytenkomplexe (COCs) von frühen antralen Follikel isoliert sind. Diese Kulturstrategie hat sich aus 10 Jahren langen Studien in unserem Labor entwickelt und wurzelt ihren Grund auf der zuvor entwickelten 24-48 Stunden In-vitro-Oozytenkultur (IVCO)², Prämaturationssysteme^23,25 und Zink-Supplementierung während der Oozytenkultur . Eine Kombination aus Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) und einem Phosphodiesterase-3 (PDE3)-Hemmer, der in der Lage ist, die Cumulus-Oozyten-Kommunikation zu verbessern², eine vorzeitige meiotische Wiederaufnahme zu verhindern², und das Oozytenwachstum² zu unterstützen, wurde verwendet.

Protokoll

Eierstöcke wurden von 4 bis 8 Jahre alten Holsteiner Milchkühen gesammelt, die im örtlichen Schlachthof geborgen wurden (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italien).

1. Medienvorbereitung

HINWEIS: Alle Medien müssen mindestens vier Stunden vor Gebrauch vorbereitet werden. Natriumbicarbonat-gepufferte Medien werden bei 38,5 °C und 5%_CO2 in der Luft, maximale Luftfeuchtigkeit, inkubiert. HEPES-gepufferte Medien werden im Thermostatofen bei 38,5 °C gehalten.

1. Lange In-vitro-Kultur von Eizellen (L-IVCO) Medium
   1. 15 ml des Grundkulturmediums vorbereiten (M199-B): Ergänzung M199 mit 2 mM Glutamin, 0,4% fettsäurefreies Rinderserumalbumin (BSA), 0,2 mM Natriumpyruvat, 25 mM Natriumbicarbonat, 0,1 mM Cysteamin, 21,3 g/ml Phenolrot, 75 g/ml Kanamycin und 4% Polyvinylpyrrolidon (PVP; 360 k Molekulargewicht).
   2. 3 ml des Haltemediums (M199-H) vorbereiten: Zu M199-B 5 m Cilostamid hinzufügen und in eine 35 mm Petrischale gießen.
   3. L-IVCO-Medium (M199-L) vorbereiten: Ergänzung M199-B mit 0,15 g/ml ZnSulfat, 10^-4 I.E./ml FSH, 10 ng/ml Estradiol, 50 ng/ml Testosteron, 50 ng/ml Progesteron und 5 mM Cilostamid.
   4. Legen Sie 200 l M199-L Medium in jeden Brunnen der 96 gut beschichteten Platte. Füllen Sie die Brunnen in den vier Rändern der Platte mit sterilem Kulturwasser, um die Verdunstung zu kompensieren und eine angemessene Luftfeuchtigkeit während der Kultur zu erhalten.
   5. Inkubieren Sie die 96-Wellplatte und das M199-H-Medium im Inkubator bei 38,5 °C und 5%_CO2 in luftiger Luft, maximale Luftfeuchtigkeit.
2. Dissektionsmedium
   1. Vorbereiten des Dissektionsmediums (M199-D): Ergänzung M199 mit 0,4% BSA-Fraktion V, 0,164 mM Penicillin, 0,048 mM Streptomycin, 1790 Einheiten/L Heparin. M199-D kann in loser Schüttung hergestellt, in 20 ml Aliquots abgegeben und 6 Monate bei 4 °C gelagert werden. Bei Bedarf warm und ergänzen 1 aliquot.
   2. Bereiten Sie 20 ml M199-D vor, ergänzt durch 5 M Cilostamid (M199-D Cilostamid).

2. Ovarialsammlung und -verarbeitung

HINWEIS: Alle Eingriffe werden bei Raumtemperatur (26 °C) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

1. Die Eierstöcke im Schlachthof von Kühen wiederherstellen.
2. Die Eierstöcke in steriler Salin (NaCl, 9 g/L) bei 26 – 28 °C mit Penicillin 100 U/mL und Streptomycin 0,1 mg/ml einzusetzen.
3. Transportieren Sie die Organe in warmesterile Saline innerhalb von 4 h ins Labor.
4. Waschen Sie die Eierstöcke 4x in steriler Salin, die bei 26 °C gehalten wird.
5. Entfernen Sie alle mittelgroßen Antalfollikel, indem Sie alle Follikel mit einem Durchmesser von mehr als 2 mm mit einer 18 G Nadel, die mit einer Aspirationspumpe verbunden ist, mit einem Vakuumdruck von -28 mmHg anheben, und legen Sie die angesaugten Eierstöcke in einen Becher mit steriler Kochsaline bei 26 °C.
   ANMERKUNG: Die Entfernung des Follikelgehalts > 2 mm ist ein entscheidender Schritt, um die Quelle ausgewachsener Eizellen, die das Experiment "kontaminieren" würden, so weit wie möglich zu entfernen.
6. Unter einer horizontalen laminaren Strömungshaube einen Eierstock auf ein steriles Polytetrafluorethylen-Schneidbrett legen. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Klinge Nr. 22, die auf einem Skalpellgriff montiert ist, Scheiben des Eierstockhirns (den äußeren Teil des Eierstocks, der die Follikel enthält), 1,5 – 2 mm dick und parallel zur Hauptachse des Organs.
7. Die Scheiben des Eierstock-Kortex in eine sterile Glas-Petrischale mit Seziermedium auf eine warme Platte bei 38,5 °C legen.
   HINWEIS: Ab sofort werden alle Verfahren bei 38,5 °C mit einer warmen Platte durchgeführt.

3. Auswahl und Isolierung der Follikel und Abruf der COCs

1. Legen Sie eine Eierstock-Kortex-Scheibe in eine 60 mm Glas Petrischale mit 2-3 ml M199-D.
2. Wählen Sie mit einem Seziermikroskop die Follikel zwischen 0,5 – 2 mm mit einem mit Mikrometern ausgestatteten Okular aus.
3. Identifizieren Sie die gesunden, nicht-atretischen Follikel unter dem Stereomikroskop. Beurteilen Sie die Follikelatresie, indem Sie morphologische Parameter, wie z. B. ein sehr klares transluzentes Erscheinungsbild, mit einem dunklen COC im Inneren beobachten. Entsorgen Sie die atretischen Follikel und verarbeiten Sie alle anderen.
4. Mit einer chirurgischen Klinge Nr. 22 auf einem Skalpellgriff montiert entfernen Sie das Eierstockgewebe um den Follikel auf einer Seite, bis der Follikel auf einer Kante ausgesetzt ist.
5. Mit einer 26G-Nadel, die auf einer Spritze montiert ist, stellen Sie vorsichtig einen Schlitz in der freiliegenden Follikelwand her. Diese Aktion wird den Follikelgehalt freisetzen, der die COC, Follikelflüssigkeit und Zellklumpen umfasst.
6. Identifizieren Sie das COC unter dem Mikroskop und untersuchen Sie auf Cumulusintegrität, Zona-Pellucida-Integrität und Homogenität des Zytoplasmas. Wenn diese Kriterien erfüllt sind, aspirieren Sie den COC mit einer P20-Pipette.
7. Legen Sie das isolierte COC in M199-D Cilostamid.
8. Fahren Sie mit dem Isolationsverfahren für 30 min fort.

4. Auswahl der COCs, die der In-vitro-Kultur unterzogen werden sollen

1. Wählen Sie unter dem Seziermikroskop gesunde COCs nach den Kriterien in Schritt 3.6 aus.
2. In einer 60 mm Petrischale 16 Tropfen von 20 l M199-D Cilostamid zubereiten und einen gesunden COC pro Tropfen platzieren (Abbildung 1A).
3. Mit Hilfe eines invertierten Mikroskops, das an einer Kamera befestigt ist, messen Sie den Oozytendurchmesser, mit Ausnahme der Zona pellucida, mit der software, die mit der Kamera geliefert wird.
4. Mit einer klaren Visualisierung der Eizelle, machen Sie zwei senkrechte Messungen ohne die Zona pellucida (Abbildung 1B).
5. Stellen Sie sicher, dass der Mittelwert der Messung der beiden Eizellen, mit Ausnahme der Zona pellucida, in einem Bereich von 100 – 110 m liegt. Entsorgen Sie COCs mit nicht gerundeblich geformter Oozyte oder mit nicht messbaren Eizellen.
6. Übertragen Sie die ausgewählten COCs in eine 35-mm-Schale mit M199-H-Medium und bewahren Sie sie im Inkubator bei 38,5 °C und 5 %_CO2 in der Luft auf, maximale Luftfeuchtigkeit bis Schritt 5.1.
7. Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4 bis 4x. Die Gesamtarbeitszeit darf 2 h nicht überschreiten.

5. Lange In-vitro-Kultur der Eizellen (L-IVCO)

1. Übertragen Sie einen COC pro Brunnen in der Mitte eines Brunnens der 96 Brunnenplatte, die in Schritt 1.1.5 vorbereitet werden soll.
2. Inkubieren Sie die Platte für 5 Tage bei 38,5 °C und 5%_CO2 in der Luft, maximale Luftfeuchtigkeit.
3. Jeden zweiten Tag (Tag 2 und Tag 4) frische M199-L vorbereiten, wie in Schritt 1 beschrieben.
4. Erneuern Sie die Hälfte des Mediums, indem Sie 100 l Medium entfernen und durch 100 l frisch zubereitetes M199-L ersetzen. Führen Sie die mittlere Erneuerung unter dem Stereomikroskop durch und vermeiden Sie, die COCs in den Brunnen zu verschieben.

6. COC-Klassifizierung nach der Kultur

1. Analysieren Sie am Ende des L-IVCO die Morphologie der COCs unter dem Seziermikroskop.
2. Klassifizieren, wie in Abbildung 2dargestellt.
   1. Klassifizieren Sie als Klasse 1, wenn COCs eine kompakte Cumuluszelleninvestition ohne Anzeichen von Cumulusexpansion und Zelldegeneration aufweisen.
   2. Klassifizieren Sie als Klasse 2, wenn COCs eine kompakte Cumuluszellinvestition ohne Anzeichen von Cumulusexpansion und Zelldegeneration und mit antrumähnlicher Bildung in der Cumulusmasse aufweisen.
   3. Klassifizieren Sie als Klasse 3, wenn COCs mehrere Schichten von Cumuluszellen ohne Anzeichen einer Cumulusexpansion und einige disaggregierte Zellen in der äußeren Schicht von Cumuluszellen und keine antrumartige Bildung aufweisen.
   4. Klassifizieren Sie als Klasse 4, wenn COCs einen reichlichen Verlust von Cumuluszellen aufweisen, die sich über mehr als 50 % der Eizellenoberfläche erstrecken, sowie Anzeichen einer Zelldegeneration und Zellablagerungen.

7. Bewertung der meiotischen Progression nach der Kultur

1. Oocyte Denudation
   1. Legen Sie jeden COC in einen einzigen Brunnen einer Vier-Brunnen-Platte, die 400 l 199D pro Brunnen enthält.
   2. Entfernen Sie unter einem Seziermikroskop die Cumuluszellen vorsichtig mechanisch durch wiederholtePipettierung mit einer Pipette, die auf 130-140 l eingestellt ist.
   3. Sobald die Eizellen frei von der Cumulus-Investition sind, übertragen Sie sie in einen anderen Brunnen, der 199D enthält.
   4. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Eizellen vollständig denuded sind.
2. Oocyte-Atomfärbung
   HINWEIS: Von nun an werden alle Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt. Reagenzien sind bei Raumtemperatur.
   1. Fixieren Sie die Eizellen in Paraformaldehyd 4% in Phosphatpuffer-Saline (PBS) für 1 h.
      VORSICHT: Tragen Sie persönliche Schutzausrüstungen beim Umgang mit Paraformaldehyd und entsorgen Sie kontaminierte Materialien gemäß den Richtlinien für die Entsorgung gefährlicher Abfälle.
   2. Waschen Sie die Eizellen 3x für je 5 min in PBS mit 1% Polyvinylalkohol (PVA).
      HINWEIS: Die Proben können sofort verarbeitet oder bei 4 °C für maximal eine Woche gelagert werden.
   3. Legen Sie die Eizellen 10 min in PBS mit 0,1% Triton X.
   4. Waschen Sie die Eizellen 3x für je 5 min in PBS mit 1% PVA.
   5. Legen Sie die Eizellen einzeln in Tropfen von 5 l Antifade-Medium, ergänzt mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Dilaktat (1 g/ml) über eine Rutsche.
   6. Legen Sie zwei Streifen doppelseitiges Klebeband entlang der langen Seiten der Rutsche, um eine übermäßige Abflachung der Eizellen zu vermeiden, wenn Sie den Deckelschlupf oben aufsetzen.
   7. Legen Sie den Deckelschlupf oben, lassen Sie es auf dem Band haften und halten Sie im Dunkeln, während die Verarbeitung aller Proben.
   8. Analysieren Sie die Eizellen mit einem herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskop, das mit DAPI-Filtern (Erregung/Emission: 358/461) ausgestattet ist, um die meiotische Progression der Eizellen zu bewerten.
   9. Klassifizieren Sie die Eizellen nach ihrer meiotischen Progression: GV - Eizellen mit unterschiedlichen Graden der Chromatinkondensation innerhalb des GV; MI – Eizellen von GV, die in Metaphase I zerfallen; und degenerieren – Eizellen, die in keiner der vorherigen Stadien identifiziert werden konnten.

Ergebnisse

Am Ende des L-IVCO änderte sich die Bruttomorphologie der COCs und 4 Klassen wurden anhand des Aussehens der Cumuluszellen identifiziert, wie in Abbildung 2dargestellt. Basierend auf den morphologischen Kriterien, die üblicherweise zur Auswahl gesunder COCs^11,26,27, der Klasse 1, 2 und 3 gewählt wurden, wurden die Klasse 4, die deutliche Anzeichen einer Degeneration wie das Fehlen vollständiger ...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Kultursystem für wachsende Eizellen, das die Eizellenentwicklung für 5 Tage fördert, indem es ihre Lebensfähigkeit unterstützt und die meiotische Wiederaufnahme verhindert. Dieser letztgenannte Aspekt ist von größter Bedeutung, um das kontinuierliche Wachstum und die Differenzierung zu ermöglichen, die notwendig sind, um die Eizelle mit meiotischer und embryonaler Entwicklungskompetenz^2,20zu verleihen, die andernfalls durch eine v...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well dishes	Nunclon	179830
96-well dish	Becton Dickinson Biosciences	356649	BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)	Sigma	A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Sigma	A3311
Cell culture water	Sigma	W3500
Cilostamide	Sigma	C7971
Cysteamine	Sigma	M9768
Digital camera	Nikon Corp	Camera DS-5M
Disodium phosphate	Sigma	S5136
Estradiol	Sigma	E2758
Glutamax Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
Gonal F	Merck Serono
Heparin	Sigma	H3149
HEPES	Sigma	H3784
Vacuum pump	Cook-IVF	KMAR-5100
Incubator	Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma	K1377
Medium 199	Sigma	M3769	Powder for bicarbonate-buffered media
Medium 199	Sigma	M2520	Powder for HEPES-buffered media
Microscope	Nikon Corp	Nikon Diaphot
Microscope	Nikon Corp	Eclipse E 600
Monopotassium phosphate	Sigma	P5655
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicilin	Sigma	P3032
Phenol Red	Sigma	P5530
Polyvinyl alcohol	Sigma	P8137
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	P5288	360k molecular weight
Potassium chloride	Sigma	P5405
Progesterone	Sigma	P8783
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium choride	Sigma	P5886
Sodium pyruvate	Sigma	P4562
Streptomycin	Sigma	S9137
Testosterone	Sigma	86500
Triton X	Sigma	T9284
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Water	Sigma	W3500
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	Z0251