Strategia di coltura in vitro per oociti dal follicolo antralico precoce nel bestiame

Riepilogo

Descriviamo le procedure per l'isolamento degli ovociti di crescita dai follicoli ovaiosi nelle prime fasi di sviluppo, nonché l'installazione di un sistema di coltura in vitro in grado di sostenere la crescita e la differenziazione fino allo stadio completamente cresciuto.

Abstract

La riserva limitata di oociti maturi e fertilizzanti rappresenta una grande barriera per il successo della riproduzione assistita nei mammiferi. Considerando che durante la durata della vita riproduttiva solo circa l'1% degli ovociti in un ovaio maturo e ovulato, sono state sviluppate diverse tecniche per aumentare lo sfruttamento della riserva ovarica alla crescente popolazione di follicoli non ovulatori. Tali tecnologie hanno permesso interventi di conservazione della fertilità, programmi di selezione nel bestiame e conservazione delle specie in via di estinzione. Tuttavia, il vasto potenziale della riserva ovarica è ancora in gran parte non sfruttato. Nelle mucche, ad esempio, sono stati fatti alcuni tentativi di sostenere la coltura in vitro degli ociociti in fasi di sviluppo specifiche, ma non sono ancora stati sviluppati protocolli efficienti e affidabili. Qui descriviamo un sistema di coltura che riproduce le condizioni fisiologiche del corrispondente stadio follicolare, definito per sviluppare ovociti di crescita in vitro raccolti dai follicoli antrali primi bovini allo stadio completamente cresciuto, corrispondente al follicolo antralco medio in vivo. Una combinazione di ormoni e un inibitore fosfodiesterase 3 è stato utilizzato per prevenire la ripresa meiotica intempestivo e per guidare la differenziazione degli ovociti.

Introduzione

Durante la durata della vita riproduttiva, solo una frazione minima degli oociti che sono presenti in un maturo ovarico, vengono rilasciati nelle tube di Falloppio dopo l'ovulazione e sono disponibili per essere fecondati e svilupparsi in un embrione^{vitale 1}. D'altra parte, la maggior parte degli oociti all'interno di un'ovaia subiscono atresia e non sono mai ovulati. Le tecnologie di produzione di embrioni in vitro (IVP) hanno tentato di aumentare lo sfruttamento della riserva^{ovarica 2,3}. Finora, tali tecnologie hanno permesso interventi di conservazione della fertilità, programmi di selezione nel bestiame e conservazione delle specie in via di estinzione. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli utilizza oociti che hanno fondamentalmente completato la fase di crescita all'interno del follicolo ovarico astrale, e quindi sono indicati come oociti completamente cresciuti. Nei bovini, dove le tecnologie IVP sono ampiamente utilizzate, gli ovociti completamente cresciuti raggiungono un diametro finale di circa 120 m e vengono raccolti da follicoli che si estendono da 2 a 8 mm di diametro (follicoli antrali medi)¹. Dopo l'isolamento dai follicoli, tali oociti sono in vitro maturati e fecondati. Gli zigoti vengono poi rilaccati fino alla fase di blastocisti e trasferiti in un destinatario o crioconservati. Nel bestiame, così come in molte altre specie, nonostante il potenziale offerto dall'IVP, il numero di embrioni prodotti in vitro per mucca non è migliorato in gran parte negli ultimi 40 anni. Ciò è in parte dovuto al numero limitato di ovociti completamente cresciuti che popolano un'ovaia in un dato momento che può essere recuperata e sottoposta a tecniche IVP standard^4,5,6.

Gli ovociti racchiusi all'interno dei primi follicoli antrali, cioè quei follicoli di diametro inferiore a 2 mm, rappresentano una potenziale fonte da utilizzare nei programmi di conservazione della^{fertilità 7} , poiché un'ovaia contiene approssimativamente 10 volte più follicoli antrali precoci rispetto al medio antral⁸. Tuttavia, questi oociti sono ancora in fase di crescita e non hanno ancora raggiunto la fase⁹completamente cresciuta . Come tale, sono ancora trascrizionalmente attivi, producendo mRNA che saranno conservati per fasi successive di sviluppo, e non hanno ancora subito tutto il processo di differenziazione necessario per conferire agli ovociti la capacità di riprendere e completare spontaneamente la meiosi che una volta isolato dal compartimento follicolare^10,11. Pertanto, non possono essere sottoposti direttamente ai protocolli standard di maturazione in vitro (IVM), ma richiedono un ulteriore periodo di coltura che permetta loro di completare la fase di crescita e differenziare correttamente.

La transizione dallo stadio di crescita a quello completamente cresciuto, che nel bestiame si verifica quando il follicolo si sviluppa dallo stadio astrale iniziale allo stadio astrale medio, è uno dei passaggi critici durante lo sviluppo degli ovociti. Nel bestiame, diversi studi hanno tentato di ricapitolare questi eventi in vitro^{2,12,13,14,15,16,17,18,19}. Tuttavia, ad oggi non sono stati sviluppati protocolli affidabili e sono stati segnalati solo un successo limitato. Secondo gli studi precedenti²⁰, questi ovociti in crescita costituiscono una popolazione omogenea. Oltre ad essere trascrizionalmente attivo, la loro cromatina è dispersa nel vescicolo germino (GV), in una configurazione denominata GV0^2,21. Al contrario, la popolazione di oociti completamente cresciuti ottenuti da follicoli antrali medi è più eterogenea, una condizione che si riflette con i vari gradi di compattazione della cromatina (GV1, GV2 e GV3) che possono essere osservati²⁰. Tra questi, i dati precedenti hanno dimostrato che gli oociti GV2 e GV3 sono complessivamente caratterizzati da una migliore qualità e una maggiore competenza dello sviluppo^{embrionale 20,21,22,23,24}.

A partire dalle osservazioni di cui sopra, qui descriviamo un sistema di coltura di 5 giorni di ovociti (L-IVCO) che permette la differenziazione degli ovociti isolati come complessi cumuli-oociti (COC) dai primi follicoli astrali. Questa strategia culturale si è evoluta da 10 anni di studi condotti nel nostro laboratorio e affonda le sue radici sulla 24-48 ore di coltura ociocita in vitro precedentemente sviluppata (IVCO)², sistemi di^{prematurazione 23,25} e il completamento dello zinco durante la coltura degli oocidi . Una combinazione di ormone stimolante follicolo (FSH) e un inibitore fosfodiesterase-3 (PDE3), in grado di migliorare la comunicazione cumulus-oocita², prevenire la ripresa meiotica intempese², e supporto crescita ovocita² è stato utilizzato.

Protocollo

Le ovaie sono state raccolte da 4 a 8 anni di vacche da latte Holstein recuperate presso il mattatoio locale (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italia).

1. Preparazione dei supporti

NOTA: tutti i supporti devono essere preparati almeno quattro ore prima dell'uso. I supporti tamponi di bicarbonato di sodio vengono incubati a 38,5 gradi centigradi e al 5% di CO₂ nell'aria, massima umidità. I supporti tamponati HEPES sono mantenuti a 38,5 gradi centigradi in forno termostatico.

1. Lunga coltura in vitro di oociti (L-IVCO) media
   1. Preparare 15 mL del mezzo di coltura di base (M199-B): Supplemento M199 con glutammina da 2 mM, 0,4% di albumina di siero bovino senza acido grasso (BSA), piruvato di sodio da 0,2 mM, 25 mM di bicarbonato di sodio, 0,1 mM di cistamina, 21,3 g/mL di rosso fenolo, 75 g/mL di kanamycin e 4% Polyvinylpyrrolidone (PVP; 360 k peso molecolare).
   2. Preparare 3 mL del supporto di tenuta (M199-H): per M199-B aggiungere 5 cilostamide di mM e versarlo in un piatto Petri da 35 mm.
   3. Preparare il mezzo L-IVCO (M199-L): Supplemento M199-B con 0,15 g/mL di solfato, 10^-4 IU/mL FSH, 10 ng/mL estradiolo, 50 ng/mL di testosterone, 50 ng/mL progesterone e 5 M .
   4. Mettere 200 L di M199-L in ogni pozzo della piastra ben rivestita 96. Riempire i pozzi nei quattro bordi del piatto con acqua di coltura sterile per compensare l'evaporazione e mantenere l'umidità appropriata durante la coltura.
   5. Incubare la piastra del pozzo 96 e il mezzo M199-H nell'incubatrice a 38,5 gradi centigradi e 5% di CO₂ in aria, umidità massima.
2. Media di dissezione
   1. Preparare il mezzo di dissezione (M199-D): Supplemento M199 con 0,4% BSA frazione V, 0,164 mM penicillina, 0,048 mM streptomicina, 1790 unità/L epaina. M199-D può essere preparato alla rinfusa, erogato in aliquots da 20 mL e conservato a 4 gradi centigradi per 6 mesi. Quando necessario, caldo e supplemento 1 aliquot.
   2. Preparare 20 mL di M199-D integrato con cilostamide 5 M (cilostamide M199-D).

2. Raccolta e lavorazione delle ovaie

NOTA: Tutte le procedure sono condotte a temperatura ambiente (26 gradi centigradi) se non diversamente indicato.

1. Recuperare le ovaie al mattatoio dalle mucche.
2. Mettere le ovaie in salina sterile (NaCl, 9 g/L) a 26 – 28 gradi centigradi aggiunti con penicillina 100 U/mL e streptomicina 0,1 mg/mL.
3. Trasportare gli organi in laboratorio in calda salina sterile entro 4 h.
4. Lavare le ovaie 4x in saline sterile mantenute a 26 gradi centigradi.
5. Rimuovere tutti i follicoli astrali medio-grandi aspirando tutti i follicoli di diametro superiore a 2 mm utilizzando un ago da 18 G collegato a una pompa di aspirazione con pressione sottovuoto fissata a -28 mmHg e posizionare le ovaie aspirate in un becher con salina sterile a 26 gradi centigradi.
   NOTA: La rimozione del contenuto dei follicoli > 2 mm è un passo fondamentale per rimuovere il più possibile la fonte di ovociti completamente cresciuti che "contaminano" l'esperimento.
6. Sotto un cappuccio a flusso laminare orizzontale, posizionare un'ovaia al momento su un tagliere sterile di politetrafluoroetilene. Utilizzando una lama chirurgica n. 22 montata su una maniglia del bisturi, tagliare fette di corteccia ovarica (la parte esterna dell'ovaio, che contiene i follicoli), spessa 1,5 – 2 mm e parallela all'asse maggiore dell'organo.
7. Mettere le fette di corteccia ovarica in un piatto Petri di vetro sterile coperto con mezzo di sezionazione su un piatto caldo a 38,5 gradi centigradi.
   NOTA: D'ora in tempo in tempo in tempo in su tutte le procedure vengono eseguite a 38,5 gradi centigradi utilizzando una piastra calda.

3. Selezione e isolamento dei follicoli e recupero dei COC

1. Mettere una sezione di corteccia ovarica in un piatto Petri di vetro da 60 mm con 2-3 mL di M199-D.
2. Utilizzando un microscopio di dissezione, selezionare i follicoli tra 0,5 e 2 mm utilizzando un oculare dotato di micrometro.
3. Identificare i follicoli sani e non atretici sotto lo stereomicroscopio. Valutare l'atresia follicola osservando parametri morfologici, come un aspetto traslucido molto chiaro, con un COC scuro all'interno. Scartare i follicoli atretici ed elaborare tutti gli altri.
4. Utilizzando una lama chirurgica n. 22 montata su una maniglia del bisturi rimuovere il tessuto ovarico che circonda il follicolo su un lato fino a quando il follicolo è esposto su un bordo.
5. Utilizzando un ago 26G montato su una siringa, fare con attenzione una fessura nella parete del follicolo esposto. Questa azione rilascerà il contenuto follicolare, che comprende il COC, il liquido follicolare e i grumi di cellule.
6. Identificare il COC al microscopio ed esaminare l'integrità del cumulo, l'integrità della zona pellucida e l'omogeneità del citoplasma. Se questi criteri sono soddisfatti, aspirare il COC utilizzando una pipetta P20.
7. Posizionare il COC isolato in cilostamide M199-D.
8. Continuare la procedura di isolamento per 30 min.

4. Selezione di COC da sottopose alla coltura in vitro

1. Sotto il microscopio di dissezione, selezionare COC sani in base ai criteri al punto 3.6.
2. In un piatto Petri da 60 mm, preparare 16 gocce di 20 L di cilostamide M199-D e inserire un COC sano per goccia (Figura 1A).
3. Utilizzando un microscopio invertito collegato a una telecamera misurare il diametro degli ovociti, escludendo la zona pellucida, utilizzando il software fornito con la fotocamera.
4. Con una chiara visualizzazione dell'ovocita, effettuare due misurazioni perpendicolari escludendo la zona pellucida (Figura 1B).
5. Assicurarsi se la media della misura dei due ovociti, esclusa la zona pellucida, è compresa in un intervallo di 100 – 110 m. Scartare i COC con ovocita a forma non arrotondata o con ovociti non misurabili.
6. Trasferire i COC selezionati in un piatto da 35 mm contenente il mezzo M199-H e conservarli nell'incubatrice a 38,5 gradi centigradi e al 5% di CO₂ nell'aria, umidità massima fino al punto 5.1.
7. Ripetere i passaggi 3 e 4 fino a 4x. L'orario di lavoro complessivo non deve superare i 2 h.

5. Lunga coltura in vitro degli oociti (L-IVCO)

1. Trasferire un COC per pozzo al centro di un pozzo della piastra del pozzo 96 da preparare al punto 1.1.5.
2. Incubare la piastra per 5 giorni a 38,5 gradi centigradi e 5% CO₂ in aria, umidità massima.
3. Ogni due giorni (giorno 2 e giorno 4) preparare M199-L fresco come descritto nel passaggio 1.
4. Rinnovare metà del mezzo rimuovendo 100 L di media e sostituendo con 100 L di M199-L appena preparato. Eseguire il rinnovo medio sotto lo stereomicroscopio ed evitare di spostare i COC nel pozzo.

6. Classificazione COC dopo la cultura

1. Alla fine del L-IVCO, analizzare la morfologia dei COC sotto il microscopio di dissezione.
2. Classificare come illustrato nella Figura 2.
   1. Classificare come Classe 1 se i COC mostrano un investimento compatto nelle cellule cumulo senza alcun segno di espansione del cumulo e degenerazione cellulare.
   2. Classificare come Classe 2 se i COC mostrano un investimento compatto delle cellule cumulo senza alcun segno di espansione cumulo e degenerazione cellulare e con formazione simile ad antrum nella massa cumulo.
   3. Classificare come classe 3 se i COC mostrano diversi strati di cellule cumuli senza alcun segno di espansione del cumulo e alcune cellule disaggrede nello strato esterno delle cellule cumuli e nessuna formazione simile a un antrum.
   4. Classificare come classe 4 se i COC mostrano un'abbondante perdita di cellule cumuli che si estendono per oltre il 50% della superficie degli oocici e segni di degenerazione cellulare e detriti cellulari.

7. Valutazione della progressione meiotica dopo la cultura

1. Denudazione oocita
   1. Mettere ogni COC in un unico pozzo di una piastra a quattro po ' contenente 400 L di 199D per pozzo.
   2. Sotto un microscopio di dissezione rimuovere delicatamente le cellule cumuli meccanicamente ripetendo pipetta utilizzando una pipetta impostata a 130-140 L.
   3. Una volta che gli oociti sono liberi dall'investimento cumulo, trasferirli in un altro pozzo contenente 199D.
   4. Ripetere il processo fino a quando tutti gli ovociti sono completamente denudati.
2. Colorazione nucleare di Oocite
   NOTA: D'ora in tempo in tempo in tempo in su tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente. I reagenti sono a temperatura ambiente.
   1. Fissare gli oociti in paraformaldeide 4% in fosfato tampone salina (PBS) per 1 h.
      CAUTION: Indossare dispositivi di protezione personale durante la movimentazione della paraformaldeide e smaltire i materiali contaminati in conformità con le linee guida per lo smaltimento dei rifiuti pericolosi.
   2. Lavare gli ovociti 3x per 5 minuti ciascuno in PBS contenenti 1% polivinilalcoolo (PVA).
      NOTA: I campioni possono essere elaborati immediatamente o conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana.
   3. Inserire gli oociti in PBS contenenti 0,1% Triton X per 10 min.
   4. Lavare gli ovociti 3x per 5 minuti ciascuno in PBS contenenti 1% PVA.
   5. Posizionare singolarmente gli ovociti in gocce di 5 L di mezzo antifade integrato con 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilacato (1 g/mL) su uno scivolo.
   6. Posizionare due strisce di nastro adesivo su due lati lungo i lati lunghi dello scivolo, per evitare un'eccessiva appiattimento degli oociti quando si mette la slitta di copertura sulla parte superiore.
   7. Posizionare il coperchio sulla parte superiore, farlo aderire al nastro e tenere al buio durante l'elaborazione di tutti i campioni.
   8. Analizzare gli oociti utilizzando un microscopio epifluorescenza convenzionale dotato di filtri DAPI (Eccitazione/Emissione: 358-461) per valutare la progressione meiotica degli oociti.
   9. Classificare gli oociti in base alla loro progressione meiotica: GV - oociti con diversi gradi di condensazione della cromatina all'interno del GV; MI – ovociti da GV che si rompono alla metafazione I; e degenerati – oociti che non potevano essere identificati come in nessuna delle fasi precedenti.

Risultati

Alla fine del L-IVCO, la morfologia lorda dei COC è cambiata e 4 classi sono state identificate in base all'aspetto delle cellule cumuli, come mostrato nella Figura 2. Sulla base dei criteri morfologici comunemente adottati per selezionare i COC^{sani 11,26,27}, le classi 1, 2 e 3 sono state giudicate sane, mentre la classe 4, che mostrava chiari segni di degenerazione come l'assenza di strati complet...

Discussione

Qui descriviamo un sistema culturale per la crescita degli ovociti che promuove lo sviluppo degli ovociti per 5 giorni sostenendone la vitalità e prevenendo la ripresa meiotica. Quest'ultimo aspetto è di estrema importanza per consentire la continua crescita e differenziazione necessaria per conferire all'ovocita la competenza dello sviluppo meiotico ed embrionale^2,20, che sarebbe altrimenti bloccata da una ripresa prematura della divisione meiotica.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well dishes	Nunclon	179830
96-well dish	Becton Dickinson Biosciences	356649	BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)	Sigma	A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Sigma	A3311
Cell culture water	Sigma	W3500
Cilostamide	Sigma	C7971
Cysteamine	Sigma	M9768
Digital camera	Nikon Corp	Camera DS-5M
Disodium phosphate	Sigma	S5136
Estradiol	Sigma	E2758
Glutamax Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
Gonal F	Merck Serono
Heparin	Sigma	H3149
HEPES	Sigma	H3784
Vacuum pump	Cook-IVF	KMAR-5100
Incubator	Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma	K1377
Medium 199	Sigma	M3769	Powder for bicarbonate-buffered media
Medium 199	Sigma	M2520	Powder for HEPES-buffered media
Microscope	Nikon Corp	Nikon Diaphot
Microscope	Nikon Corp	Eclipse E 600
Monopotassium phosphate	Sigma	P5655
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicilin	Sigma	P3032
Phenol Red	Sigma	P5530
Polyvinyl alcohol	Sigma	P8137
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	P5288	360k molecular weight
Potassium chloride	Sigma	P5405
Progesterone	Sigma	P8783
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium choride	Sigma	P5886
Sodium pyruvate	Sigma	P4562
Streptomycin	Sigma	S9137
Testosterone	Sigma	86500
Triton X	Sigma	T9284
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Water	Sigma	W3500
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	Z0251