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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo le procedure per l'isolamento degli ovociti di crescita dai follicoli ovaiosi nelle prime fasi di sviluppo, nonché l'installazione di un sistema di coltura in vitro in grado di sostenere la crescita e la differenziazione fino allo stadio completamente cresciuto.

Abstract

La riserva limitata di oociti maturi e fertilizzanti rappresenta una grande barriera per il successo della riproduzione assistita nei mammiferi. Considerando che durante la durata della vita riproduttiva solo circa l'1% degli ovociti in un ovaio maturo e ovulato, sono state sviluppate diverse tecniche per aumentare lo sfruttamento della riserva ovarica alla crescente popolazione di follicoli non ovulatori. Tali tecnologie hanno permesso interventi di conservazione della fertilità, programmi di selezione nel bestiame e conservazione delle specie in via di estinzione. Tuttavia, il vasto potenziale della riserva ovarica è ancora in gran parte non sfruttato. Nelle mucche, ad esempio, sono stati fatti alcuni tentativi di sostenere la coltura in vitro degli ociociti in fasi di sviluppo specifiche, ma non sono ancora stati sviluppati protocolli efficienti e affidabili. Qui descriviamo un sistema di coltura che riproduce le condizioni fisiologiche del corrispondente stadio follicolare, definito per sviluppare ovociti di crescita in vitro raccolti dai follicoli antrali primi bovini allo stadio completamente cresciuto, corrispondente al follicolo antralco medio in vivo. Una combinazione di ormoni e un inibitore fosfodiesterase 3 è stato utilizzato per prevenire la ripresa meiotica intempestivo e per guidare la differenziazione degli ovociti.

Introduzione

Durante la durata della vita riproduttiva, solo una frazione minima degli oociti che sono presenti in un maturo ovarico, vengono rilasciati nelle tube di Falloppio dopo l'ovulazione e sono disponibili per essere fecondati e svilupparsi in un embrionevitale 1. D'altra parte, la maggior parte degli oociti all'interno di un'ovaia subiscono atresia e non sono mai ovulati. Le tecnologie di produzione di embrioni in vitro (IVP) hanno tentato di aumentare lo sfruttamento della riservaovarica 2,3. Finora, tali tecnologie hanno permesso interventi di conservazione della fertilità, programmi di selezione nel bestiame e conservazione delle specie in via di estinzione. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli utilizza oociti che hanno fondamentalmente completato la fase di crescita all'interno del follicolo ovarico astrale, e quindi sono indicati come oociti completamente cresciuti. Nei bovini, dove le tecnologie IVP sono ampiamente utilizzate, gli ovociti completamente cresciuti raggiungono un diametro finale di circa 120 m e vengono raccolti da follicoli che si estendono da 2 a 8 mm di diametro (follicoli antrali medi)1. Dopo l'isolamento dai follicoli, tali oociti sono in vitro maturati e fecondati. Gli zigoti vengono poi rilaccati fino alla fase di blastocisti e trasferiti in un destinatario o crioconservati. Nel bestiame, così come in molte altre specie, nonostante il potenziale offerto dall'IVP, il numero di embrioni prodotti in vitro per mucca non è migliorato in gran parte negli ultimi 40 anni. Ciò è in parte dovuto al numero limitato di ovociti completamente cresciuti che popolano un'ovaia in un dato momento che può essere recuperata e sottoposta a tecniche IVP standard4,5,6.

Gli ovociti racchiusi all'interno dei primi follicoli antrali, cioè quei follicoli di diametro inferiore a 2 mm, rappresentano una potenziale fonte da utilizzare nei programmi di conservazione dellafertilità 7 , poiché un'ovaia contiene approssimativamente 10 volte più follicoli antrali precoci rispetto al medio antral8. Tuttavia, questi oociti sono ancora in fase di crescita e non hanno ancora raggiunto la fase9completamente cresciuta . Come tale, sono ancora trascrizionalmente attivi, producendo mRNA che saranno conservati per fasi successive di sviluppo, e non hanno ancora subito tutto il processo di differenziazione necessario per conferire agli ovociti la capacità di riprendere e completare spontaneamente la meiosi che una volta isolato dal compartimento follicolare10,11. Pertanto, non possono essere sottoposti direttamente ai protocolli standard di maturazione in vitro (IVM), ma richiedono un ulteriore periodo di coltura che permetta loro di completare la fase di crescita e differenziare correttamente.

La transizione dallo stadio di crescita a quello completamente cresciuto, che nel bestiame si verifica quando il follicolo si sviluppa dallo stadio astrale iniziale allo stadio astrale medio, è uno dei passaggi critici durante lo sviluppo degli ovociti. Nel bestiame, diversi studi hanno tentato di ricapitolare questi eventi in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Tuttavia, ad oggi non sono stati sviluppati protocolli affidabili e sono stati segnalati solo un successo limitato. Secondo gli studi precedenti20, questi ovociti in crescita costituiscono una popolazione omogenea. Oltre ad essere trascrizionalmente attivo, la loro cromatina è dispersa nel vescicolo germino (GV), in una configurazione denominata GV02,21. Al contrario, la popolazione di oociti completamente cresciuti ottenuti da follicoli antrali medi è più eterogenea, una condizione che si riflette con i vari gradi di compattazione della cromatina (GV1, GV2 e GV3) che possono essere osservati20. Tra questi, i dati precedenti hanno dimostrato che gli oociti GV2 e GV3 sono complessivamente caratterizzati da una migliore qualità e una maggiore competenza dello sviluppoembrionale 20,21,22,23,24.

A partire dalle osservazioni di cui sopra, qui descriviamo un sistema di coltura di 5 giorni di ovociti (L-IVCO) che permette la differenziazione degli ovociti isolati come complessi cumuli-oociti (COC) dai primi follicoli astrali. Questa strategia culturale si è evoluta da 10 anni di studi condotti nel nostro laboratorio e affonda le sue radici sulla 24-48 ore di coltura ociocita in vitro precedentemente sviluppata (IVCO)2, sistemi diprematurazione 23,25 e il completamento dello zinco durante la coltura degli oocidi . Una combinazione di ormone stimolante follicolo (FSH) e un inibitore fosfodiesterase-3 (PDE3), in grado di migliorare la comunicazione cumulus-oocita2, prevenire la ripresa meiotica intempese2, e supporto crescita ovocita2 è stato utilizzato.

Protocollo

Le ovaie sono state raccolte da 4 a 8 anni di vacche da latte Holstein recuperate presso il mattatoio locale (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italia).

1. Preparazione dei supporti

NOTA: tutti i supporti devono essere preparati almeno quattro ore prima dell'uso. I supporti tamponi di bicarbonato di sodio vengono incubati a 38,5 gradi centigradi e al 5% di CO2 nell'aria, massima umidità. I supporti tamponati HEPES sono mantenuti a 38,5 gradi centigradi in forno termostatico.

  1. Lunga coltura in vitro di oociti (L-IVCO) media
    1. Preparare 15 mL del mezzo di coltura di base (M199-B): Supplemento M199 con glutammina da 2 mM, 0,4% di albumina di siero bovino senza acido grasso (BSA), piruvato di sodio da 0,2 mM, 25 mM di bicarbonato di sodio, 0,1 mM di cistamina, 21,3 g/mL di rosso fenolo, 75 g/mL di kanamycin e 4% Polyvinylpyrrolidone (PVP; 360 k peso molecolare).
    2. Preparare 3 mL del supporto di tenuta (M199-H): per M199-B aggiungere 5 cilostamide di mM e versarlo in un piatto Petri da 35 mm.
    3. Preparare il mezzo L-IVCO (M199-L): Supplemento M199-B con 0,15 g/mL di solfato, 10-4 IU/mL FSH, 10 ng/mL estradiolo, 50 ng/mL di testosterone, 50 ng/mL progesterone e 5 M .
    4. Mettere 200 L di M199-L in ogni pozzo della piastra ben rivestita 96. Riempire i pozzi nei quattro bordi del piatto con acqua di coltura sterile per compensare l'evaporazione e mantenere l'umidità appropriata durante la coltura.
    5. Incubare la piastra del pozzo 96 e il mezzo M199-H nell'incubatrice a 38,5 gradi centigradi e 5% di CO2 in aria, umidità massima.
  2. Media di dissezione
    1. Preparare il mezzo di dissezione (M199-D): Supplemento M199 con 0,4% BSA frazione V, 0,164 mM penicillina, 0,048 mM streptomicina, 1790 unità/L epaina. M199-D può essere preparato alla rinfusa, erogato in aliquots da 20 mL e conservato a 4 gradi centigradi per 6 mesi. Quando necessario, caldo e supplemento 1 aliquot.
    2. Preparare 20 mL di M199-D integrato con cilostamide 5 M (cilostamide M199-D).

2. Raccolta e lavorazione delle ovaie

NOTA: Tutte le procedure sono condotte a temperatura ambiente (26 gradi centigradi) se non diversamente indicato.

  1. Recuperare le ovaie al mattatoio dalle mucche.
  2. Mettere le ovaie in salina sterile (NaCl, 9 g/L) a 26 – 28 gradi centigradi aggiunti con penicillina 100 U/mL e streptomicina 0,1 mg/mL.
  3. Trasportare gli organi in laboratorio in calda salina sterile entro 4 h.
  4. Lavare le ovaie 4x in saline sterile mantenute a 26 gradi centigradi.
  5. Rimuovere tutti i follicoli astrali medio-grandi aspirando tutti i follicoli di diametro superiore a 2 mm utilizzando un ago da 18 G collegato a una pompa di aspirazione con pressione sottovuoto fissata a -28 mmHg e posizionare le ovaie aspirate in un becher con salina sterile a 26 gradi centigradi.
    NOTA: La rimozione del contenuto dei follicoli > 2 mm è un passo fondamentale per rimuovere il più possibile la fonte di ovociti completamente cresciuti che "contaminano" l'esperimento.
  6. Sotto un cappuccio a flusso laminare orizzontale, posizionare un'ovaia al momento su un tagliere sterile di politetrafluoroetilene. Utilizzando una lama chirurgica n. 22 montata su una maniglia del bisturi, tagliare fette di corteccia ovarica (la parte esterna dell'ovaio, che contiene i follicoli), spessa 1,5 – 2 mm e parallela all'asse maggiore dell'organo.
  7. Mettere le fette di corteccia ovarica in un piatto Petri di vetro sterile coperto con mezzo di sezionazione su un piatto caldo a 38,5 gradi centigradi.
    NOTA: D'ora in tempo in tempo in tempo in su tutte le procedure vengono eseguite a 38,5 gradi centigradi utilizzando una piastra calda.

3. Selezione e isolamento dei follicoli e recupero dei COC

  1. Mettere una sezione di corteccia ovarica in un piatto Petri di vetro da 60 mm con 2-3 mL di M199-D.
  2. Utilizzando un microscopio di dissezione, selezionare i follicoli tra 0,5 e 2 mm utilizzando un oculare dotato di micrometro.
  3. Identificare i follicoli sani e non atretici sotto lo stereomicroscopio. Valutare l'atresia follicola osservando parametri morfologici, come un aspetto traslucido molto chiaro, con un COC scuro all'interno. Scartare i follicoli atretici ed elaborare tutti gli altri.
  4. Utilizzando una lama chirurgica n. 22 montata su una maniglia del bisturi rimuovere il tessuto ovarico che circonda il follicolo su un lato fino a quando il follicolo è esposto su un bordo.
  5. Utilizzando un ago 26G montato su una siringa, fare con attenzione una fessura nella parete del follicolo esposto. Questa azione rilascerà il contenuto follicolare, che comprende il COC, il liquido follicolare e i grumi di cellule.
  6. Identificare il COC al microscopio ed esaminare l'integrità del cumulo, l'integrità della zona pellucida e l'omogeneità del citoplasma. Se questi criteri sono soddisfatti, aspirare il COC utilizzando una pipetta P20.
  7. Posizionare il COC isolato in cilostamide M199-D.
  8. Continuare la procedura di isolamento per 30 min.

4. Selezione di COC da sottopose alla coltura in vitro

  1. Sotto il microscopio di dissezione, selezionare COC sani in base ai criteri al punto 3.6.
  2. In un piatto Petri da 60 mm, preparare 16 gocce di 20 L di cilostamide M199-D e inserire un COC sano per goccia (Figura 1A).
  3. Utilizzando un microscopio invertito collegato a una telecamera misurare il diametro degli ovociti, escludendo la zona pellucida, utilizzando il software fornito con la fotocamera.
  4. Con una chiara visualizzazione dell'ovocita, effettuare due misurazioni perpendicolari escludendo la zona pellucida (Figura 1B).
  5. Assicurarsi se la media della misura dei due ovociti, esclusa la zona pellucida, è compresa in un intervallo di 100 – 110 m. Scartare i COC con ovocita a forma non arrotondata o con ovociti non misurabili.
  6. Trasferire i COC selezionati in un piatto da 35 mm contenente il mezzo M199-H e conservarli nell'incubatrice a 38,5 gradi centigradi e al 5% di CO2 nell'aria, umidità massima fino al punto 5.1.
  7. Ripetere i passaggi 3 e 4 fino a 4x. L'orario di lavoro complessivo non deve superare i 2 h.

5. Lunga coltura in vitro degli oociti (L-IVCO)

  1. Trasferire un COC per pozzo al centro di un pozzo della piastra del pozzo 96 da preparare al punto 1.1.5.
  2. Incubare la piastra per 5 giorni a 38,5 gradi centigradi e 5% CO2 in aria, umidità massima.
  3. Ogni due giorni (giorno 2 e giorno 4) preparare M199-L fresco come descritto nel passaggio 1.
  4. Rinnovare metà del mezzo rimuovendo 100 L di media e sostituendo con 100 L di M199-L appena preparato. Eseguire il rinnovo medio sotto lo stereomicroscopio ed evitare di spostare i COC nel pozzo.

6. Classificazione COC dopo la cultura

  1. Alla fine del L-IVCO, analizzare la morfologia dei COC sotto il microscopio di dissezione.
  2. Classificare come illustrato nella Figura 2.
    1. Classificare come Classe 1 se i COC mostrano un investimento compatto nelle cellule cumulo senza alcun segno di espansione del cumulo e degenerazione cellulare.
    2. Classificare come Classe 2 se i COC mostrano un investimento compatto delle cellule cumulo senza alcun segno di espansione cumulo e degenerazione cellulare e con formazione simile ad antrum nella massa cumulo.
    3. Classificare come classe 3 se i COC mostrano diversi strati di cellule cumuli senza alcun segno di espansione del cumulo e alcune cellule disaggrede nello strato esterno delle cellule cumuli e nessuna formazione simile a un antrum.
    4. Classificare come classe 4 se i COC mostrano un'abbondante perdita di cellule cumuli che si estendono per oltre il 50% della superficie degli oocici e segni di degenerazione cellulare e detriti cellulari.

7. Valutazione della progressione meiotica dopo la cultura

  1. Denudazione oocita
    1. Mettere ogni COC in un unico pozzo di una piastra a quattro po ' contenente 400 L di 199D per pozzo.
    2. Sotto un microscopio di dissezione rimuovere delicatamente le cellule cumuli meccanicamente ripetendo pipetta utilizzando una pipetta impostata a 130-140 L.
    3. Una volta che gli oociti sono liberi dall'investimento cumulo, trasferirli in un altro pozzo contenente 199D.
    4. Ripetere il processo fino a quando tutti gli ovociti sono completamente denudati.
  2. Colorazione nucleare di Oocite
    NOTA: D'ora in tempo in tempo in tempo in su tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente. I reagenti sono a temperatura ambiente.
    1. Fissare gli oociti in paraformaldeide 4% in fosfato tampone salina (PBS) per 1 h.
      CAUTION: Indossare dispositivi di protezione personale durante la movimentazione della paraformaldeide e smaltire i materiali contaminati in conformità con le linee guida per lo smaltimento dei rifiuti pericolosi.
    2. Lavare gli ovociti 3x per 5 minuti ciascuno in PBS contenenti 1% polivinilalcoolo (PVA).
      NOTA: I campioni possono essere elaborati immediatamente o conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana.
    3. Inserire gli oociti in PBS contenenti 0,1% Triton X per 10 min.
    4. Lavare gli ovociti 3x per 5 minuti ciascuno in PBS contenenti 1% PVA.
    5. Posizionare singolarmente gli ovociti in gocce di 5 L di mezzo antifade integrato con 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilacato (1 g/mL) su uno scivolo.
    6. Posizionare due strisce di nastro adesivo su due lati lungo i lati lunghi dello scivolo, per evitare un'eccessiva appiattimento degli oociti quando si mette la slitta di copertura sulla parte superiore.
    7. Posizionare il coperchio sulla parte superiore, farlo aderire al nastro e tenere al buio durante l'elaborazione di tutti i campioni.
    8. Analizzare gli oociti utilizzando un microscopio epifluorescenza convenzionale dotato di filtri DAPI (Eccitazione/Emissione: 358-461) per valutare la progressione meiotica degli oociti.
    9. Classificare gli oociti in base alla loro progressione meiotica: GV - oociti con diversi gradi di condensazione della cromatina all'interno del GV; MI – ovociti da GV che si rompono alla metafazione I; e degenerati – oociti che non potevano essere identificati come in nessuna delle fasi precedenti.

Risultati

Alla fine del L-IVCO, la morfologia lorda dei COC è cambiata e 4 classi sono state identificate in base all'aspetto delle cellule cumuli, come mostrato nella Figura 2. Sulla base dei criteri morfologici comunemente adottati per selezionare i COCsani 11,26,27, le classi 1, 2 e 3 sono state giudicate sane, mentre la classe 4, che mostrava chiari segni di degenerazione come l'assenza di strati complet...

Discussione

Qui descriviamo un sistema culturale per la crescita degli ovociti che promuove lo sviluppo degli ovociti per 5 giorni sostenendone la vitalità e prevenendo la ripresa meiotica. Quest'ultimo aspetto è di estrema importanza per consentire la continua crescita e differenziazione necessaria per conferire all'ovocita la competenza dello sviluppo meiotico ed embrionale2,20, che sarebbe altrimenti bloccata da una ripresa prematura della divisione meiotica.

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 e UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
4-well dishesNunclon179830
96-well dishBecton Dickinson Biosciences356649BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)SigmaA8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V)SigmaA3311
Cell culture waterSigmaW3500
CilostamideSigmaC7971
CysteamineSigmaM9768
Digital cameraNikon CorpCamera DS-5M
Disodium phosphateSigmaS5136
EstradiolSigmaE2758
Glutamax SupplementThermo Fisher Scientific35050061
Gonal FMerck Serono
HeparinSigmaH3149
HepesSigmaH3784
Vacuum pumpCook-IVF
IncubatorSanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticusSigmaK1377
Medium 199SigmaM3769Powder for hepes-buffered TCM199
Medium 199SigmaM2520Powder for M199-D
MicroscopeNikon CorpNikon Diaphot
MicroscopeNikon CorpEclipse E 600
Monopotassium phosphateSigmaP5655
ParaformaldehydeSigma158127
PenicilinSigmaP3032
Phenol RedSigmaP5530
Polyvinyl alcoholSigmaP8137
PolyvinylpyrrolidoneSigmaP5288360k molecular weight
Potassium chlorideSigmaP5405
ProgesteroneSigmaP8783
Sodium bicarbonateSigmaS5761
Sodium chorideSigmaP5886
Sodium pyruvateSigmaP4562
StreptomycinSigmaS9137
TestosteroneSigma86500
Triton XSigmaT9284
Vectashield with DAPIVector LaboratoriesH1200
WaterSigmaW3500
Zinc sulfate heptahydrateSigmaZ0251

Riferimenti

  1. Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
  2. Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
  3. McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  4. Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
  5. Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
  6. Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
  7. Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
  8. Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
  9. Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
  10. Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
  11. Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
  12. Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
  13. Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
  14. Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
  15. Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
  16. Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
  17. Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
  18. Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
  19. Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
  20. Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
  21. Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
  22. Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
  23. Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
  24. Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
  25. Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
  26. Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
  27. Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
  28. Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
  29. Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  30. Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
  31. Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
  32. Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
  33. Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
  34. Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
  35. Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
  36. Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
  37. Gordon, I. . Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).
  38. Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
  39. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
  40. Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).

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