במבחנה תרבות אסטרטגיה עבור Oocytes מ זקיק אנטרל מוקדם בבקר

Summary

אנו מתארים את ההליכים לבידוד של גידול oocytes מזקיקי השחלות בשלבים מוקדמים של פיתוח, כמו גם את ההתקנה של מערכת תרבות מבחנה אשר יכול לתמוך בצמיחה ובידול עד לשלב הבוגר במלואו.

Abstract

העתודה המוגבלת של אוציטים בוגרים ותו לא מהווים מחסום מרכזי להצלחת הרבייה בסיוע ליונקים. בהתחשב בכך שבמהלך תוחלת החיים של הרבייה רק כ 1% של oocytes בשחלה בוגרת ומבייצת, מספר טכניקות פותחו כדי להגדיל את הניצול של שמורת השחלות לאוכלוסייה הגדלה של זקיקים שאינם מבייצים. טכנולוגיות כאלה אפשרו התערבויות של שימור פוריות, תוכניות בחירה במשק החי ושימור מינים בסכנת הכחדה. עם זאת, הפוטנציאל העצום של שמורת השחלות עדיין לא נופק ברובו. בפרות, למשל, נעשו כמה ניסיונות לתמוך בתרבות המבחנה של אוציטים בשלבים התפתחותיים ספציפיים, אך פרוטוקולים יעילים ואמינים עדיין לא פותחו. כאן אנו מתארים מערכת תרבות השוחזרת את התנאים הפיזיולוגיים של שלב הזקיקים המתאים, המוגדרת להתפתח במבחנה הגדלה oocytes שנאספו מזקיקי אנטרל מוקדם של צב ים לשלב הבוגר במלואו, המקביל זקיק אנתלי בינוני ב vivo. שילוב של הורמונים ופוספודיסטרז 3 מעכב שימש כדי למנוע חידוש מיוטי בטרם עת כדי להנחות את ההבידול של oocyte.

Introduction

במהלך תוחלת החיים של הרבייה, רק חלק קטן של oocytes הנוכחיים בשחלה בוגרת, משתחררים בחצוצרות בעת הביוץ, והם זמינים להיות מופרית ולפתח^{לעובר קיימא 1.} מצד שני, רוב האוציטים בתוך השחלה עוברים אטרזיה ולעולם לא מביצים. במבחנה עובר ייצור (IVP) טכנולוגיות ניסו להגדיל את הניצול של שמורת השחלות^2,,3. עד כה, טכנולוגיות כאלה אפשרו התערבויות של שימור פוריות, תוכניות בחירה במשק החי ושימור מינים בסכנת הכחדה. אף על פי כן, רוב הפרוטוקולים להשתמש oocytes כי בעצם השלימו את שלב הצמיחה בתוך זקיק השחלות antral, ולכן מכונים oocytes גדל במלואו. בבקר, שבו טכנולוגיות IVP נמצאות בשימוש נרחב, oocytes גדל באופן מלא להגיע קוטר סופי של כ 120 μm נאספים זקיקים המשתרעים מ 2 עד 8 מ"מ קוטר (זקיקי אנטרל בינוני)¹. עם הבידוד מהזקיקים, אוציטים כאלה הם במבחנה התבגרו ומופריים. הזיגוטים מתהתרבות לאחר מכן עד לשלב blastocyst או מועברים לנמען או cryopreserved. בבקר, כמו גם מינים רבים אחרים, למרות הפוטנציאל המוצע על ידי IVP, מספר העובר המיוצר במבחנה לכל פרה לא השתפר במידה רבה ב-40 השנים האחרונות. זאת בין היתר בשל המספר המוגבל של oocytes גדל באופן מלא המאכלסים שחלה בזמן נתון אשר ניתן לאחזר ולהיות נתון טכניקות IVP^{סטנדרטיות 4,5,6}.

oocytes המוקפים בתוך זקיקי antral מוקדם, כלומר, זקיקים אלה כי הם פחות מ 2 מ"מ קוטר, מייצגים מקור פוטנציאלי לשמש בתוכניות שימור פוריות⁷ , כמו שחלה בערך מכיל 10 פעמים זקיקים אנטראליים מוקדמים יותר מאשר נמלה^{בינונית 8}. עם זאת, oocytes אלה עדיין בשלב הצמיחה ועדיין לא הגיעו לשלב 9 גדל^במלואו. בתור שכזה, הם עדיין פעילים תעתיק, הפקת mRNAs כי יאוחסן עבור צעדים התפתחותיים מאוחרים יותר, ועדיין לא עברו את כל תהליך הבידול הנדרש כדי לתן את oocytes עם היכולת של באופן ספונטני התחדשות והשלמת meiosis אני פעם בודדתי מת תא^{זקיקים 10,,11}. לכן, הם לא יכולים להיות מוגשים ישירות לפרוטוקולי התבגרות חוץ-חוץ (IVM) סטנדרטיים, אבל הם דורשים תקופה נוספת של תרבות שתאפשר להם להשלים את שלב הצמיחה ולהבדיל כראוי.

המעבר מההגדלה לשלב הבוגר במלואו, אשר בבקר מתרחש כאשר הזקיק מתפתח מהעקבר המוקדם לשלב הנמלי הבינוני, הוא אחד הצעדים הקריטיים במהלך פיתוח oocyte. בבקר ניסו מספר מחקרים לסיכום אירועים אלה^{במבחנה 2,,12,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19}.^, עם זאת, עד כה לא פותחו פרוטוקולים אמינים ורק דווח על הצלחה מוגבלת. על פי מחקרים^{קודמים 20}, oocytes גדל אלה מהווים אוכלוסייה הומוגנית. מלבד היותם פעילים בתמלול, הכרומטין שלהם מפוזר בפסית הנבט (GV), בתצורה הנקראת GV0^2,21. לעומת זאת, האוכלוסייה של oocytes גדל באופן מלא המתקבל זקיקי אנטרל בינוני הוא הטרוגני יותר, מצב כי הוא שיקוף על ידי דרגות שונות של דחיסת כרומטין (GV1, GV2 ו GV3) שניתן^{לצפות 20.} בין אלה, נתונים קודמים הראו כי oocytes GV2 ו GV3 מאופיינים באופן כללי באיכות טובה יותר ויכולת התפתחותית עוברית גבוהה^{יותר 20,21,22,23,24}.

החל מהתצפיות לעיל, כאן אנו מתארים מערכת תרבות ארוכה של 5 ימים של oocytes (L-IVCO) המאפשרת בידול של oocytes מבודד כמו קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) מזקיקי אנטרל מוקדם. אסטרטגיית תרבות זו התפתחה מ 10 שנים מחקרים ארוכים שנערכו במעבדה שלנו שורשים הקרקע שלה על שפותחו בעבר 24-48 שעות בתרבות oocyte מבחנה (IVCO)^{2,מערכות טרום בגרות 23,,25} ותוספי אבץ במהלך תרבות oocyte. שילוב של הורמון מגרה זקיק (FSH) ו פוספודאסטראז-3 (PDE3) מעכב, מסוגל לשפר את התקשורת cumulus-oocyte^2,למנוע חידוש מיוטי^{בטרם עת 2, ותמיכה}צמיחה oocyte² שימש.

Protocol

השחלות נאספו בין 4 ל 8 שנים חולב הולשטיין פרות התאושש בבית המטבחיים המקומי (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M לסה"נ, איטליה).

1. הכנה לתקשורת

הערה: יש להכין את כל אמצעי המדיה לפחות ארבע שעות לפני השימוש. מדיה המאגרת נתרן ביקרבונט מדגירה ב 38.5 ° C ו 5% CO₂ באוויר, לחות מקסימלית. אמצעי המדיה המאגרים ב-HEPES מתוחזקים ב-38.5°C בתנור תרמוסטי.

1. ארוך בתרבות המבחנה של oocytes (L-IVCO) בינוני
   1. להכין 15 מ"ל של מדיום התרבות הבסיסית (M199-B): תוספת M199 עם 2 mM גלוטמין, 0.4% חומצת שומן חינם סרום חזיר אלבומין (BSA), 0.2 mM נתרן pyruvate, 25 m נתרן ביקרבונט, 0.1 mM ציסטאמין, 21.3 μg / מ"ל של פנול אדום, 75 μg / מ"ל של kanamycin ו 4% Polyvinylpyrrolidone (PVP; 360 k משקל מולקולרי).
   2. הכינו 3 מ"ל של מדיום ההחזקה (M199-H): ל-M199-B מוסיפים 5 μM cilostamide ושופכים אותו לצלחת פטרי 35 מ"מ.
   3. להכין את המדיום L-IVCO (M199-L): תוספת M199-B עם 0.15 μg /mL Zn סולפט, 10^-4 IU/mL FSH, 10 ng/mL אסטרדיול, 50 ng/mL טסטוסטרון, 50 ng/mL פרוגסטרון ו 5 μM Cilostamide.
   4. מניחים 200 μL של M199-L בינוני בכל באר של צלחת 96 מצופה היטב. מלאו את הבארים בארבעת הקצוות של הצלחת במים תרבותיים סטריליים כדי לפצות על אידוי ולשמור על לחות מתאימה במהלך התרבות.
   5. דגירה 96 צלחת גם ואת M199-H בינוני ב אינקובטור ב 38.5 ° C ו 5% CO₂ באוויר, לחות מקסימלית.
2. מדיום פירוק
   1. להכין את מדיום הניתור (M199-D): תוספת M199 עם 0.4% BSA שבר V, 0.164 mM פניצילין, 0.048 mM סטרפטומיצין, 1790 יחידות / L heparin. M199-D ניתן להכין בכמויות גדולות, מחולק 20 mL aliquots ומאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים. בעת הצורך, חם ותוספת 1 aliquot.
   2. להכין 20 מ"ל של M199-D בתוספת עם 5 μM cilostamide (M199-D cilostamide).

2. איסוף ועיבוד השחלות

הערה: כל ההליכים מתבצעים בטמפרטורת החדר (26°C) אלא אם צוין אחרת.

1. לשחזר את השחלות בבית המטבחיים מפרות.
2. מניחים את השחלות בתמיסת מלח סטרילית (NaCl, 9 גרם/ל' ב-26 – 28°C שנוספו עם פניצילין 100 U/mL וסטרפטומיצין 0.1 מ"ג/מ"ל.
3. להעביר את האיברים למעבדה בתמיסת מלח סטרילית חמה בתוך 4 שעות.
4. לשטוף את השחלות 4x בתמיסת מלח סטרילית מתוחזק ב 26 מעלות צלזיוס.
5. הסר את כל זקיקי הנמל מאמצע עד גדול על ידי שאיפה כל הזקיקים יותר מ 2 מ"מ קוטר באמצעות מחט 18 G מחובר משאבת שאיפה עם לחץ ואקום להגדיר -28 mmHg ולמקם את השחלות שאף בבקת עם תמיסת מלח סטרילית ב 26 מעלות צלזיוס.
   הערה: הסרת התוכן של זקיקים > 2 מ"מ הוא צעד קריטי כדי להסיר ככל האפשר את המקור של oocytes גדל במלואו כי יהיה 'לזהם' את הניסוי.
6. תחת מכסה מנוע זרימה למינאר אופקי, מניחים שחלה אחת באותו הזמן על קרש חיתוך פוליטרפלואורואתילן סטרילי. באמצעות להב כירורגי מס ' 22 רכוב על ידית אזמל, לחתוך פרוסות של קליפת השחלות (החלק החלק החלקי של השחלה, אשר מכיל את הזקיקים), 1.5 – 2 מ"מ עבה במקביל לציר העיקרי של האיבר.
7. מניחים את פרוסות קליפת השחלות בצלחת פטרי מזכוכית סטרילית מכוסה במדיום ניתוח על צלחת חמה ב-38.5°C.
   הערה: מעתה כל ההליכים מבוצעים ב- 38.5 °C באמצעות צלחת חמה.

3. בחירה ובידוד של הזקיקים ואחזור של COCs

1. מניחים פרוסת קליפת שחלות אחת בצלחת פטרי זכוכית 60 מ"מ עם 2-3 מ"ל של M199-D.
2. באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, בחר את הזקיקים בין 0.5 – 2 מ"מ באמצעות עינית מצויד מיקרומטר.
3. זהה את הזקיקים הבריאים, הלא-אקרטיים מתחת לסטריאומיקרוסקופ. להעריך אטרזיה זקיק על ידי התבוננות פרמטרים מורפולוגיים, כגון מראה שקוף מאוד ברור, עם COC כהה בפנים. זרוק את הזקיקים הירקתיים ועבד את כל האחרים.
4. באמצעות להב כירורגי מס ' 22 רכוב על ידית אזמל להסיר את רקמת השחלות המקיפה את הזקיק בצד אחד עד הזקיק נחשף בקצה אחד.
5. באמצעות מחט 26G רכוב על מזרק, בזהירות לעשות חתך בקיר הזקיק החשוף. פעולה זו תשחרר את התוכן הזקיק, הכולל COC, נוזל זקיקים וגוזלים של תאים.
6. זהה את ה-COC תחת המיקרוסקופ ובחן את שלמות הקומולוס, שלמות הזונה פלוצ'ידה והומוגניות של צטופלסמה. אם קריטריונים אלה מתקיימים, שאף את ה-COC באמצעות פיפטה P20.
7. מקם את ה-COC המבודד ב-M199-D cilostamide.
8. המשך בהליך הבידוד למשך 30 דקות.

4. מבחר של COCs להיות נתון בתרבות המבחנה

1. תחת מיקרוסקופ הפירוק, בחר COCs בריא בהתבסס על הקריטריונים בשלב 3.6.
2. בצלחת פטרי 60 מ"מ, להכין 16 טיפות של 20 μL של M199-D cilostamide ולהניח COC בריא אחד לכלירידה (איור 1A).
3. באמצעות מיקרוסקופ הפוך המחובר למצלמה למדוד את קוטר oocyte, לא כולל zona pellucida, באמצעות התוכנה שסופקה עם המצלמה.
4. עם הדמיה ברורה של oocyte, לעשות שתי מדידות ניצב למעט pellucida (איור 1B).
5. להבטיח אם ממוצע של שני המדידה של oocyte, למעט פלושה zona, הוא בטווח של 100 – 110 μm. בטל COCs עם oocyte בצורת לא מעוגל או עם oocytes אינם מדידים.
6. מעבירים את ה-COCs הנבחרים בצלחת של 35 מ"מ המכילה M199-H בינונית ולשמור אותם באינקובטור ב-38.5°C ו-5% CO₂ באוויר, לחות מרבית עד לשלב 5.1.
7. חזור על שלבים 3 ו- 4 עד 4x. זמן העבודה הכולל אינו יכול לחרוג מ- 2 שעות.

5. ארוך בתרבות המבחנה של oocytes (L-IVCO)

1. העבר COC אחד לכל באר במרכז באר של צלחת 96 היטב כדי להיות מוכן בשלב 1.1.5.
2. דגירה את הצלחת במשך 5 ימים ב 38.5 ° C ו 5% CO₂ באוויר, לחות מקסימלית.
3. כל יומיים (יום 2 ויום 4) להכין M199-L טרי כמתואר בשלב 1.
4. לחדש מחצית המדיום על ידי הסרת 100 μL של בינוני והחלפה עם 100 μL של M199-L מוכן טרי. בצע את החידוש הבינוני תחת הסטריאומיקרוסקופ והימנע מהעברת ה-COCs לבאר.

6. סיווג COC לאחר התרבות

1. בסוף L-IVCO, לנתח את המורפולוגיה של COCs תחת מיקרוסקופ הניתור.
2. סווג כמתואר באות 2.
   1. לסווג כמו Class 1 אם COCs להראות השקעה קומפקטית תא cumulus ללא סימן של הרחבת קומולוס ניוון תאים.
   2. לסווג כמו Class 2 אם COCs להראות השקעה קומפקטית תא cumulus ללא סימן של הרחבת קומולוס ניוון תאים עם היווצרות כמו antrum במסה cumulus.
   3. לסווג כמו מחלקה 3 אם COCs להראות כמה שכבות של תא cumulus ללא סימן של הרחבת קומולוס וכמה תאים מופרדים בשכבה החיצונית של תאי קומולוס ואין היווצרות כמו antrum.
   4. לסווג כמו מחלקה 4 אם COCs מראה אובדן בשפע של תאי קומולוס המשתרע עבור יותר מ 50% של פני השטח oocyte, וסימנים של ניוון תאים ופסולת תא.

7. הערכת ההתקדמות המיוטית לאחר התרבות

1. התרעה אוציטה
   1. מניחים כל COC בבאר אחת של צלחת ארבע באר המכילה 400 μL של 199D לכל באר.
   2. תחת מיקרוסקופ פירוק להסיר בעדינות את תאי cumulus מכנית על ידי pipetting חוזר באמצעות סט pipette ב 130-140 μL.
   3. ברגע שה-oocytes חופשיים מההשקעה בקומולוס, להעביר אותם לבאר אחרת המכילה 199D.
   4. חזור על התהליך עד שכל האוציטים יתנועו לחלוטין.
2. כתמים גרעיניים Oocyte
   הערה: מעתה כל ההליכים מבוצעים בטמפרטורת החדר. הריגנטים בטמפרטורת החדר.
   1. לתקן את oocytes paraformaldehyde 4% ב תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS) עבור 1 שעה.
      התראה: לבשו ציוד מגן אישי בעת טיפול בפרפורמלדהיד והישלמו מחומרים מזוהמים בהתאם להנחיות לסילוק פסולת מסוכנת.
   2. שוטפים את ה-oocytes 3x במשך 5 דקות כל אחד ב-PBS המכיל 1% פוליוינילקוהול (PVA).
      הערה: ניתן לעבד את הדגימות באופן אוטומטי או לאחסן אותה ב- 4 °C למשך שבוע אחד לכל היותר.
   3. מקם את האוציטים ב-PBS המכילים 0.1% Triton X למשך 10 דקות.
   4. יש לשטוף את האוציטים 3x במשך 5 דקות כל אחד ב- PBS המכיל 1% PVA.
   5. מניחים את oocytes באופן ייחודי בטיפות של 5 μL של אנטי-פיד בינוני בתוספת עם 4 ',6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) דילקט (1 μg /mL) על שקופית.
   6. מקם שני פסים של סרט הדבקה דו-צדדי לאורך הצדדים הארוכים של השקופית, כדי למנוע שיטוח מוגזם של האוציטים בעת הצבת החלק העליון של הכיסוי.
   7. מניחים את פתק הכיסוי למעלה, הפוך אותה לדבוק בקלטת ולשמור בחושך תוך עיבוד כל הדגימות.
   8. נתח את האוציטים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצינטי קונבנציונלי המצויד במסנני DAPI (Excitation/Emission: 358,461) כדי להעריך את ההתקדמות המיוטית של האוציטים.
   9. לסווג את oocytes על פי ההתקדמות meiotic שלהם: GV - oocytes עם דרגות שונות של עיבוד כרומטין בתוך GV; MI – oocytes מ GV פירוק מטה-פאזה I; ומנוון – oocytes שלא ניתן לזהות כלהיות בכל השלבים הקודמים.

תוצאות

בסוף ה-L-IVCO, המורפולוגיה הגולמית של COCs השתנתה ו-4 מחלקות זוהו בהתבסס על המראה של תאי קומולוס, כפי שמופף באות 2. בהתבסס על הקריטריונים המורפולוגיים שאומצו בדרך כלל כדי לבחור COCs^{בריאים 11,26,27}, כיתה 1, 2 ו 3 נשפטו בריאים, בעוד בכיתה 4, ...

Discussion

כאן אנו מתארים מערכת תרבות לגידול oocytes המקדמת פיתוח oocyte במשך 5 ימים על ידי תמיכה בכדאיות שלהם ומניעת חידוש מיוטי. היבט זה הוא בעל חשיבות עליונה כדי לאפשר את המשך הצמיחה והבידול הדרושים כדי לחולץ את האוציט עם יכולת התפתחותית מיוטית^{ועוברית 2,,20}, שאחרת היה נחסם ע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well dishes	Nunclon	179830
96-well dish	Becton Dickinson Biosciences	356649	BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)	Sigma	A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Sigma	A3311
Cell culture water	Sigma	W3500
Cilostamide	Sigma	C7971
Cysteamine	Sigma	M9768
Digital camera	Nikon Corp	Camera DS-5M
Disodium phosphate	Sigma	S5136
Estradiol	Sigma	E2758
Glutamax Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
Gonal F	Merck Serono
Heparin	Sigma	H3149
Hepes	Sigma	H3784
Vacuum pump	Cook-IVF
Incubator	Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma	K1377
Medium 199	Sigma	M3769	Powder for hepes-buffered TCM199
Medium 199	Sigma	M2520	Powder for M199-D
Microscope	Nikon Corp	Nikon Diaphot
Microscope	Nikon Corp	Eclipse E 600
Monopotassium phosphate	Sigma	P5655
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicilin	Sigma	P3032
Phenol Red	Sigma	P5530
Polyvinyl alcohol	Sigma	P8137
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	P5288	360k molecular weight
Potassium chloride	Sigma	P5405
Progesterone	Sigma	P8783
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium choride	Sigma	P5886
Sodium pyruvate	Sigma	P4562
Streptomycin	Sigma	S9137
Testosterone	Sigma	86500
Triton X	Sigma	T9284
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Water	Sigma	W3500
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	Z0251