Estrategia de cultivo In Vitro para ovocitos del folículo antral temprano en el ganado bovino

Resumen

Describimos los procedimientos para el aislamiento de ovocitos en crecimiento de los folículos ováricos en las primeras etapas de desarrollo, así como la instalación de un sistema de cultivo in vitro que puede apoyar el crecimiento y la diferenciación hasta la etapa completamente adulta.

Resumen

La reserva limitada de ovocitos maduros y fertilizables representa una barrera importante para el éxito de la reproducción asistida en mamíferos. Teniendo en cuenta que durante la vida reproductiva sólo alrededor del 1% de los ovocitos en un ovario maduro y ovulado, se han desarrollado varias técnicas para aumentar la explotación de la reserva ovárica a la creciente población de folículos no ovulatorios. Estas tecnologías han permitido intervenciones de preservación de la fertilidad, programas de selección en ganado y conservación de especies en peligro de extinción. Sin embargo, el enorme potencial de la reserva ovárica sigue siendo en gran medida sin explotar. En las vacas, por ejemplo, se han hecho algunos intentos de apoyar la cultura in vitro de ovocitos en etapas específicas del desarrollo, pero aún no se han desarrollado protocolos eficientes y fiables. Aquí describimos un sistema de cultivo que reproduce las condiciones fisiológicas de la etapa folicular correspondiente, definida para desarrollar ovocitos de crecimiento in vitro recogidos de los folículos antrales tempranos bovinos a la etapa completamente adulta, correspondiente al folículo antral medio in vivo. Se utilizó una combinación de hormonas y un inhibidor de la fosfodiesterasa 3 para prevenir la reanudación meótica prematuramente y para guiar la diferenciación de los ovocitos.

Introducción

Durante la vida reproductiva, sólo una fracción mínima de los ovocitos que están presentes en un ovario maduro, se liberan en las trompas de Falopio tras la ovulación, y están disponibles para ser fertilizados y se convierten en un embrión viable¹. Por otro lado, la mayoría de los ovocitos dentro de un ovario se someten a atresia y nunca se ovulan. Las tecnologías de producción in vitro de embriones (IVP) han intentado aumentar la explotación de la reserva ovárica^2,3. Hasta ahora, estas tecnologías han permitido intervenciones de preservación de la fertilidad, programas de selección en el ganado y conservación de especies en peligro de extinción. Sin embargo, la mayoría de los protocolos utilizan ovocitos que básicamente han completado la fase de crecimiento dentro del folículo ovárico antral, y por lo tanto se conocen como ovocitos completamente crecidos. En el ganado bovino, donde las tecnologías IVP son ampliamente utilizadas, los ovocitos completamente crecidos alcanzan un diámetro final de aproximadamente 120 m y se recogen de folículos que abarcan de 2 a 8 mm de diámetro (folículos antrales medios)¹. Tras el aislamiento de los folículos, estos ovocitos son in vitro madurados y fertilizados. Los cigotos se cultivan hasta la etapa del blastocisto y se transfieren a un receptor o crioconservados. En el ganado bovino, así como en muchas otras especies, a pesar del potencial que ofrecen IVP, el número de embriones producidos in vitro por vaca no mejoró en gran medida durante los últimos 40 años. Esto se debe en parte al número limitado de ovocitos completamente crecidos que pueblan un ovario en un momento dado que se puede recuperar y someter a las técnicas estándar de IVP^4,5,6.

Los ovocitos encerrados dentro de los folículos antrales tempranos, es decir, aquellos folículos de menos de 2 mm de diámetro, representan una fuente potencial que se utilizará en los programas de conservación de la fertilidad^7, ya que un ovario contiene aproximadamente 10 veces más folículos antrales tempranos que los folículos antrales medios^8. Sin embargo, estos ovocitos todavía están en fase de crecimiento y aún no han alcanzado la etapa⁹completamente cultivada. Como tal, todavía están transcripcionalmente activos, produciendo mRNAs que se almacenarán para pasos posteriores del desarrollo, y todavía no han sido sometidos a todo el proceso de diferenciación necesario para conferir a los ovocitos con la capacidad de reanudar y completar espontáneamente la meiosis que una vez aislado del compartimento folicular^10,,11. Por lo tanto, no pueden someterse directamente a los protocolos estándar de maduración in vitro (IVM), pero requieren un período adicional de cultivo que les permita completar la fase de crecimiento y diferenciarse adecuadamente.

La transición de la etapa de crecimiento a la etapa completamente cultivada, que en el ganado se produce cuando el folículo se desarrolla desde la etapa antral temprana a la etapa antral media, es uno de los pasos críticos durante el desarrollo de ovocitos. En bovinos, varios estudios intentaron recapitular estos eventos in vitro^{2,12,13,14,15,16,17,18,19}. Sin embargo, hasta la fecha no se han desarrollado protocolos fiables y sólo se ha informado de un éxito limitado. Según estudios anteriores²⁰, estos ovocitos en crecimiento constituyen una población homogénea. Además de ser transcripcionalmente activa, su cromatina se dispersa en la vesícula germinal (GV), en una configuración que se llama GV0^2,21. Por el contrario, la población de ovocitos totalmente crecidos obtenida a partir de folículos antrales medios es más heterogénea, una condición que se refleja en los diversos grados de compactación de la cromatina (GV1, GV2 y GV3) que se pueden observar²⁰. Entre ellos, datos anteriores han demostrado que los ovocitos GV2 y GV3 se caracterizan en general por una mejor calidad y una mayor competencia embrionaria de desarrollo^{20,,21,,22,,23,,24}.

Partiendo de las observaciones anteriores, aquí describimos un sistema de cultivo de 5 días de largo de ovocitos (L-IVCO) que permite la diferenciación de los ovocitos aislados como complejos cúmulos-ovocitos (COC) de los folículos antrales tempranos. Esta estrategia de cultivo ha evolucionado a partir de 10 años de estudios realizados en nuestro laboratorio y sus raíces su terreno sobre el cultivo de ovocitos in vitro (IVCO)^2,sistemas de^23,,25 y la suplementación de zinc durante el cultivo de ovocitos. Se utilizó una combinación de hormona estimulante del folículo (FSH) y un inhibidor de la fosfodiesterasa-3 (PDE3), capaz de mejorar la comunicación cúmulo- ovocitos^2,prevenir la reanudación meótica prematura²y apoyar el crecimiento de ovocitos^2.

Protocolo

Los ovarios se recogieron de vacas lecheras Holstein de 4 a 8 años recuperadas en el matadero local (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italia).

1. Preparación de medios

NOTA: Todos los medios deben estar preparados al menos cuatro horas antes de su uso. Los medios tamponados de bicarbonato de sodio se incuban a 38,5 oC y 5% de_CO2 en aire, humedad máxima. Los medios con amortiguación HEPES se mantienen a 38,5 oC en horno termostático.

1. Cultivo in vitro largo de ovocitos (L-IVCO) medio
   1. Preparar 15 mL del medio de cultivo básico (M199-B): Suplemento M199 con 2 mM de glutamina, 0,4% de albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos (BSA), 0,2 mM de piruvato sódico, bicarbonato sódico de 25 mM, cisteamina de 0,1 mM, 21,3 g/ml de rojo fenol, 75 g/ml de kanamicina y 4% de polivinpirrolidona (PVP; 360 k de peso molecular).
   2. Preparar 3 ml del medio de sujeción (M199-H): A M199-B añadir 5 m de cilostamida y verter en un plato de Petri de 35 mm.
   3. Preparar el medio L-IVCO (M199-L): Suplemento M199-B con sulfato de Zn de 0,15 g/ml, 10^UI/ml FSH, estradiol de 10 ng/ml, testosterona de 50 ng/ml, 50 ng/ml de progesterona y 5 mL de cilostamida.
   4. Colocar 200 l de medio M199-L en cada pocócil de la placa bien recubierta. Llenar los pozos en los cuatro bordes de la placa con agua de cultivo estéril para compensar la evaporación y mantener la humedad adecuada durante el cultivo.
   5. Incubar la placa de 96 pozos y el medio M199-H en la incubadora a 38,5oC y 5%_CO2 en aire, humedad máxima.
2. Medio de disección
   1. Preparar el medio de disección (M199-D): Suplemento M199 con 0,4% fracción BSA V, 0,164 mM de penicilina, 0,048 mM de estreptomicina, 1790 unidades/L heparina. M199-D se puede preparar a granel, dispensar en alícuotas de 20 ml y almacenarse a 4 oC durante 6 meses. Cuando sea necesario, caliente y suplemente 1 alícuota.
   2. Preparar 20 mL de M199-D complementado con cilostamida de 5 m (cilostamida M199-D).

2. Recolección y procesamiento de ovarios

NOTA: Todos los procedimientos se llevan a cabo a temperatura ambiente (26 oC) a menos que se indique lo contrario.

1. Recuperar los ovarios en el matadero de las vacas.
2. Colocar los ovarios en solución salina estéril (NaCl, 9 g/L) a 26 – 28 oC añadidos con penicilina 100 U/ml y estreptomicina 0,1 mg/ml.
3. Transportar los órganos al laboratorio en solución salina estéril caliente dentro de 4 h.
4. Lavar los ovarios 4x en solución salina estéril mantenida a 26oC.
5. Retire todos los folículos antrales de tamaño medio a grande aspirando todos los folículos de más de 2 mm de diámetro utilizando una aguja de 18 G conectada a una bomba de aspiración con presión de vacío establecida en -28 mmHg y coloque los ovarios aspirados en un vaso de precipitados con solución salina estéril a 26 oC.
   NOTA: La eliminación del contenido de los folículos > 2 mm es un paso crítico para eliminar en la medida de lo posible la fuente de ovocitos completamente crecidos que 'contaminarían' el experimento.
6. Bajo una campana de flujo laminar horizontal, coloque un ovario en ese momento en una tabla de cortar de politetrafluoroetileno estéril. Usando una cuchilla quirúrgica No. 22 montada en un mango de bisturí, corte las rodajas de corteza ovárica (la parte externa del ovario, que contiene los folículos), 1,5 – 2 mm de espesor y paralela al eje principal del órgano.
7. Colocar las rodajas de corteza ovárica en un plato de petri de vidrio estéril cubierto con medio diseccionante sobre un plato caliente a 38,5 oC.
   NOTA: A partir de ahora todos los procedimientos se realizan a 38,5 oC utilizando una placa caliente.

3. Selección y aislamiento de los folículos y recuperación de los COC

1. Coloque una rodaja de corteza ovárica en un plato petri de vidrio de 60 mm con 2-3 ml de M199-D.
2. Con un microscopio de disección, seleccione los folículos entre 0,5 y 2 mm utilizando un ocular equipado con micrómetros.
3. Identifique los folículos sanos y no atériticos debajo del estereomicroscopio. Evaluar la atresia del folículo mediante la observación de parámetros morfológicos, como la apariencia translúcida muy clara, con un COC oscuro en el interior. Deseche los folículos atériticos y procese todos los demás.
4. Usando una cuchilla quirúrgica No. 22 montada en un mango de bisturí, retire el tejido ovárico que rodea el folículo en un lado hasta que el folículo se exponga en un borde.
5. Con una aguja 26G montada en una jeringa, haga cuidadosamente una hendidura en la pared del folículo expuesto. Esta acción liberará el contenido folicular, que comprende el COC, el líquido folicular y los grupos de células.
6. Identificar el COC bajo el microscopio y examinar la integridad del cúmulo, la integridad de la zona pellucida y la homogeneidad del citoplasma. Si se cumplen estos criterios, aspire el COC utilizando una pipeta P20.
7. Coloque el COC aislado en cilostamida M199-D.
8. Continúe el procedimiento de aislamiento durante 30 min.

4. Selección de COCs a someter a cultivo in vitro

1. Bajo el microscopio de disección, seleccione COCs saludables en función de los criterios del paso 3.6.
2. En un plato de Petri de 60 mm, prepare 16 gotas de 20 ml de cilostamida M199-D y coloque un COC saludable por gota (Figura 1A).
3. El uso de un microscopio invertido conectado a una cámara mide el diámetro de los ovocitos, excluyendo la zona pellucida, utilizando el software proporcionado con la cámara.
4. Con una visualización clara del ócito, realice dos mediciones perpendiculares excluyendo la zona pellucida (Figura 1B).
5. Asegurar si la media de la medida de los dos ovocitos, excluyendo la zona pellucida, está dentro de un rango de 100 – 110 m. Deseche los COC con ovocitos de forma no redondeada o con ovocitos que no sean medibles.
6. Transfiera los COC seleccionados en un plato de 35 mm que contenga el medio M199-H y manténgalos en la incubadora a 38,5 oC y 5%_CO2 en aire, humedad máxima hasta el paso 5.1.
7. Repita los pasos 3 y 4 hasta 4x. El tiempo de trabajo total no debe exceder 2 h.

5. Cultivo in vitro largo de los ovocitos (L-IVCO)

1. Transfiera un COC por pozo en el centro de un pozo de la placa de 96 pozos que se preparará en el paso 1.1.5.
2. Incubar la placa durante 5 días a 38,5oC y 5% de CO₂ en aire, humedad máxima.
3. Cada dos días (día 2 y día 4) preparar M199-L fresco como se describe en el paso 1.
4. Renovar la mitad del medio retirando 100 ml de medio y sustituyéndose por 100 l de M199-L recién preparado. Realice la renovación media bajo el estereomicroscopio y evite mover los COC al pozo.

6. Clasificación de COC después del cultivo

1. Al final de la L-IVCO, analice la morfología de los COC bajo el microscopio de disección.
2. Clasificar como se muestra en la figura 2.
   1. Clasificar como Clase 1 si los COC muestran una inversión de células cúmulos compactas sin signos de expansión cúmulo y degeneración celular.
   2. Clasificar como Clase 2 si los COC muestran una inversión celular compacta de cúmulo sin signos de expansión cúmulo y degeneración celular y con formación similar a un raso en la masa cúmulo.
   3. Clasificar como Clase 3 si los COC muestran varias capas de célula cúmulo sin signo de expansión cúmulo y algunas células desagregadas en la capa externa de las células cúmulos y sin formación similar a un antrum.
   4. Clasificar como Clase 4 si los COC muestran una pérdida abundante de células cúmulos que se extienden por más del 50% de la superficie de ovocitos, y signos de degeneración celular y desechos celulares.

7. Evaluación de la progresión meótica después de la cultura

1. Denudación de ovocitos
   1. Coloque cada COC en un solo pocó bien de una placa de cuatro pocillos que contenga 400 l de 199D por pocócil.
   2. Bajo un microscopio de disección, retire suavemente las células cúmulos mecánicamente mediante pipeteo repetido utilizando una pipeta establecida en 130-140 l.
   3. Una vez que los ovocitos estén libres de la inversión cúmulo, transfieralos a otro pozo que contenga 199D.
   4. Repita el proceso hasta que todos los ovocitos estén completamente denudados.
2. Tinción nuclear de ovocitos
   NOTA: A partir de ahora todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente. Los reactivos están a temperatura ambiente.
   1. Fijar los ovocitos en paraformaldehído 4% en solución salina tampón de fosfato (PBS) durante 1 h.
      ADVERTENCIA: Use equipo de protección personal al manipular paraformaldehído y deseche los materiales contaminados de acuerdo con las pautas de eliminación de residuos peligrosos.
   2. Lavar los ovocitos 3x durante 5 minutos cada uno en PBS que contenga 1% de polivinilalcohol (PVA).
      NOTA: Las muestras se pueden procesar de inmediato o almacenarse a 4 oC durante un máximo de una semana.
   3. Coloque los ovocitos en PBS que contengan 0,1% Tritón X durante 10 min.
   4. Lavar los ovocitos 3x durante 5 minutos cada uno en PBS que contenga 1% de PVA.
   5. Colocar los ovocitos singularmente en gotas de 5 ml de medio antifada complementados con 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) dilactato (1 g/ml) sobre un portaobjeto.
   6. Coloque dos tiras de cinta adhesiva de doble cara a lo largo de los lados largos de la corredera, para evitar el aplanamiento excesivo de los ovocitos al colocar el resbalón de la cubierta en la parte superior.
   7. Coloque el resguardo de la cubierta en la parte superior, hála adherirse a la cinta y manténgala en la oscuridad mientras procesa todas las muestras.
   8. Analizar los ovocitos utilizando un microscopio de epifluorescencia convencional equipado con filtros DAPI (Excitación/Emisión: 358-461) para evaluar la progresión meótica de los ovocitos.
   9. Clasificar los ovocitos según su progresión meótica: GV - ovocitos con diferentes grados de condensación de cromatina dentro del GV; MI – ovocitos de GV descomponiendo a metafase I; y degenerados – ovocitos que no podrían ser identificados como estar en cualquiera de las etapas anteriores.

Resultados

Al final de la L-IVCO, la morfología bruta de los COC cambió y 4 clases se identificaron en función de la aparición de las células cúmulos, como se muestra en la Figura 2. Sobre la base de los criterios morfológicos comúnmente adoptados para seleccionar COCs sanos^11,26,27, las clases 1, 2 y 3 fueron juzgados sanos, mientras que la clase 4, que mostraba signos claros de degeneración como la ...

Discusión

Aquí describimos un sistema de cultivo para el cultivo de ovocitos que promueve el desarrollo de ovocitos durante 5 días apoyando su viabilidad y previniendo la reanudación meótica. Este último aspecto es de suma importancia para permitir el crecimiento y la diferenciación continuos necesarios para conferir el ócito con competencia de desarrollo meótica y embrionaria^2,20, que de otro modo quedaría bloqueada por una reanudación prematura de la división ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well dishes	Nunclon	179830
96-well dish	Becton Dickinson Biosciences	356649	BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)	Sigma	A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Sigma	A3311
Cell culture water	Sigma	W3500
Cilostamide	Sigma	C7971
Cysteamine	Sigma	M9768
Digital camera	Nikon Corp	Camera DS-5M
Disodium phosphate	Sigma	S5136
Estradiol	Sigma	E2758
Glutamax Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
Gonal F	Merck Serono
Heparin	Sigma	H3149
Hepes	Sigma	H3784
Vacuum pump	Cook-IVF
Incubator	Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma	K1377
Medium 199	Sigma	M3769	Powder for hepes-buffered TCM199
Medium 199	Sigma	M2520	Powder for M199-D
Microscope	Nikon Corp	Nikon Diaphot
Microscope	Nikon Corp	Eclipse E 600
Monopotassium phosphate	Sigma	P5655
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicilin	Sigma	P3032
Phenol Red	Sigma	P5530
Polyvinyl alcohol	Sigma	P8137
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	P5288	360k molecular weight
Potassium chloride	Sigma	P5405
Progesterone	Sigma	P8783
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium choride	Sigma	P5886
Sodium pyruvate	Sigma	P4562
Streptomycin	Sigma	S9137
Testosterone	Sigma	86500
Triton X	Sigma	T9284
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Water	Sigma	W3500
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	Z0251