牛早期蚁卵泡卵母细胞的体外培养策略

摘要

我们描述了在发育的早期阶段从卵巢卵泡分离生长的卵母细胞的过程，以及建立体外培养系统，该系统可以支持生长和分化，一次，一次，一次，一个发育阶段。

摘要

成熟、可受精的卵母细胞的有限储备是哺乳动物辅助生殖成功的主要障碍。考虑到在生殖寿命期间，卵巢成熟和排卵中只有约1%的卵母细胞，已开发出若干技术，以增加卵巢储备对越来越多的非卵巢卵泡种群的利用。这些技术允许对生育保护、牲畜选择方案以及濒危物种的保护进行干预。然而，卵巢储备的巨大潜力在很大程度上仍未开发。例如，在奶牛中，已经尝试在特定的发育阶段支持卵母细胞的体外培养，但尚未制定有效和可靠的方案。在这里，我们描述了一个培养系统，它再现了相应卵泡阶段的生理条件，被定义为从牛早期蚁卵泡中收集到完全生长的卵母细胞，与体内的中蚂蚁卵泡相对应。激素和磷酸二酯酶3抑制剂的组合被用来防止不合时宜的美的恢复，并指导卵母细胞的分化。

引言

在生殖寿命期间，卵巢成熟中存在的卵母细胞中，只有极小部分在排卵管中排卵，并可用于受精和发育成可行的胚胎^1。另一方面，卵巢内大多数卵母细胞都经过卵巢，从不排卵。体外胚胎生产（IVP）技术试图增加卵巢储备^{2，3,的利用}。迄今为止，这些技术允许对生育保护、牲畜选择方案以及保护濒危物种进行干预。然而，大多数协议使用已基本完成在蚁卵巢卵泡内生长阶段的卵母细胞，因此被称为完全生长的卵母细胞。在广泛采用 IVP 技术的牛中，完全生长的卵母细胞的最终直径约为 120 μm，从直径为 2 至 8 mm 的卵泡（中等蚂蚁卵泡^{）1 中采集}。与卵泡分离后，这种卵母细胞在体外成熟和受精。然后，酶被培养到囊肿阶段，或转移到接受者或冷冻保存。在牛和许多其他物种中，尽管 IVP 提供了潜力，但每头牛的体外胚胎数量过去 40 年并没有大有改善。这部分是由于在给定时间填充卵巢的完全生长的卵母细胞数量有限，可以检索并接受标准 IVP 技术^{4、,5、6。}

封闭在早期蚁卵泡内的卵母细胞，即直径小于2毫米的卵泡，是生育保全计划^{7中的潜在}来源，因为卵巢中大约含有比中蚂蚁8多10倍的早期蚁卵^泡。然而，这些卵母细胞仍处于生长阶段，尚未达到完全生长阶段^9。因此，他们仍然具有转录活性，产生mRNA，将储存为以后的发展步骤，尚未经历所需的所有分化过程，赋予卵母细胞的能力，自发地恢复和完成美病我曾经从卵泡舱^{10，11,分离}。因此，它们不能直接提交到标准体外成熟 （IVM） 协议，但它们需要额外的培养期，以便它们能够完成生长阶段并正确区分。

从生长阶段到完全生长阶段的过渡，在牛中，当毛囊从早期的蚁体发展到中蚁体阶段时，是卵母细胞发育的关键步骤之一。在牛中，多项研究试图在体^,外^,,2、12、13、14、15、16、17、18、19^{2,12,13,1416,1718中重新}概括^这些事件。¹⁵然而，迄今尚未制定可靠的议定书，只报告了有限的成功。根据先前的研究^20，这些生长的卵母细胞构成一个同质种群。除了转录活性外，它们的染色质还分散在细菌囊泡（GV）中，其配置名为GV0^2，21。,21相反，从中等蚂蚁卵泡中获得的完全生长的卵母细胞的种群是更异质的，这种条件由不同程度的染色质压实（GV1、GV2和GV3）所反映，^{可以观察到20。}其中，此前的数据表明，GV2和GV3卵母细胞总体具有较好的品质和较高的胚胎发育能力20、21、22、23、24。^{20,21,22,23,24}

从上述观察开始，我们在此描述了一个5天长的卵母细胞培养系统（L-IVCO），它允许从早期的蚁卵泡中分离出分离为积细胞-卵母细胞复合物（COCs）的卵母细胞。这种培养策略是从我们实验室进行的10年长期研究演变而来的，其基础是先前开发的体外卵母细胞培养^{（IVCO）2，}早产系统^23，25,25和卵母细胞培养期间的锌补充。卵泡刺激激素（FSH）和磷酸二酯酶-3（PDE3）抑制剂的组合，能够增强积糖-卵母细胞传播^2，防止不合时宜的美异恢复^2，并支持^{卵母细胞生长2}被使用。

研究方案

在当地屠宰场（INALCA S.p.A.，奥斯佩达莱托·洛迪迪亚诺，LO，IT 2270M CE，意大利）回收的4至8岁的荷尔斯泰因奶牛。

1. 媒体准备

注:所有介质在使用前必须至少准备四小时。碳酸氢钠缓冲介质在38.5°C和5%CO2空气中孵育，最大湿度。₂HEPES 缓冲介质在恒温烤箱中保持在 38.5 °C。

1. 卵母细胞（L-IVCO）介质的长体外培养
   1. 准备15 mL的基本培养基（M199-B）:补充M199与2mM谷氨酰胺， 0.4% 无脂肪酸牛血清白蛋白 （BSA）， 0.2 mM 丙酮钠， 25 mM 碳酸氢钠， 0.1 mM 环胺， 21.3 μg/mL 苯酚红， 75 μg/mL 的卡纳米霉素和 4% 聚氯霉素 （PVP; 360 k 分子量）.
   2. 准备 3 mL 的保持介质 （M199-H）: 到 M199-B 加入 5 μM 西托米，倒入 35 mm 培养皿中。
   3. 准备L-IVCO介质（M199-L）:补充M199-B与0.15μg/mL Zn硫酸盐^，10-4 IU/mL FSH，10纳克/mL雌二醇，50纳克/mL睾酮，50纳克/mL黄体酮和5μM西洛桑胺。
   4. 将 200 μL 的 M199-L 介质放在 96 涂层板的每个井中。用无菌培养水填充板四边的水井，以补偿蒸发，并在培养过程中保持适当的湿度。
   5. 在38.5°C和5%CO₂ 的空气中孵育96井板和M199-H培养基，最大湿度。
2. 解剖介质
   1. 准备解剖介质（M199-D）:补充M199与0.4%BSA分数V，0.164 mM青霉素，0.048 mM链霉素，1790单位/L肝素。M199-D 可批量准备，以 20 mL 等分配方式分配，并在 4°C 中储存 6 个月。需要时，加热并补充1等分。
   2. 制备 20 mL 的 M199-D，并辅以 5 μM 西罗酰胺（M199-D 西罗酰胺）。

2. 卵巢收集和处理

注:除非另有说明，否则所有程序在室温 （26 °C） 下进行。

1. 从奶牛身上恢复屠宰场的卵巢。
2. 将卵巢放在无菌盐水（NaCl，9 g/L）中，加入青霉素100 U/mL和链霉素0.1mg/mL，在26~28°C。
3. 在4小时内将器官用热无菌盐水运送到实验室。
4. 在无菌盐水中清洗卵巢4倍，维持在26°C。
5. 使用连接到真空压力设置为 -28 mmHg 的吸气泵的 18 G 针，将吸气卵巢放在无菌盐水为 26 °C 的烧杯中，清除所有直径超过 2 mm 的中大蚂蚁卵泡。
   注:去除卵泡含量 > 2 mm 是尽可能去除完全生长的卵母细胞的来源的关键步骤，这些卵母细胞会"污染"实验。
6. 在水平层流罩下，将一个卵巢放在无菌聚四氟乙烯切割板上。使用安装在手术刀手柄上的22号手术刀片，切割卵巢皮层（卵巢的外侧，包含卵泡）的切片，1.5 ~2毫米厚，与器官主轴平行。
7. 将卵巢皮层片放在无菌玻璃培养皿中，在38.5°C的加热盘中用解剖介质覆盖。
   注:从现在起，所有程序都使用加热板在38.5 °C下完成。

3. 卵泡的选择和隔离以及COC的检索

1. 将一个卵巢皮层片放在一个 60 毫米玻璃培养皿中，其 M199-D 的 2-3 mL。
2. 使用解剖显微镜，使用微米配备的目镜选择 0.5 ~ 2 mm 之间的卵泡。
3. 在立体显微镜下识别健康、非抗性毛囊。通过观察形态参数（如非常清晰的半透明外观）评估卵泡，内部有深色 COC。丢弃阿克雷特毛囊，处理所有其他。
4. 使用安装在手术刀手柄上的 22 号手术刀片去除一侧毛囊周围的卵巢组织，直到毛囊暴露在一侧。
5. 使用安装在注射器上的 26G 针，小心地在暴露的毛囊壁上打一个缝。此操作将释放卵泡含量，包括COC、卵泡液和细胞团。
6. 在显微镜下识别COC，并检查细胞质的积原完整性、佐纳佩图西达完整性和同质性。如果符合这些标准，则使用 P20 移液器吸气 COC。
7. 将隔离的 COC 放在 M199-D 西罗塔米德中。
8. 继续隔离过程 30 分钟。

4. 选择进行体外培养的COC

1. 在解剖显微镜下，根据步骤3.6中的标准选择健康的COC。
2. 在 60 mm 培养皿中，制备 16 滴 20 μL 的 M199-D 西洛酰胺，每滴放置一个健康的 COC（图 1A）。
3. 使用连接到相机的倒置显微镜使用相机随附的软件测量卵母细胞直径（不包括 zona pellucida）。
4. 通过卵母细胞的清晰可视化，进行两个垂直测量，不包括佐纳佩普图西达（图1B）。
5. 确保两个卵母细胞的测量均值（不包括佐纳佩图西达）是否在 100 ~ 110 μm 的范围内。丢弃非圆形卵母细胞或无法测量的卵母细胞的 COC。
6. 将选定的COC在含有M199-H介质的35毫米培养皿中转移，并在38.5°C和空气中的5%CO2下放在培养箱_中 ，最大湿度，直到步骤5.1。
7. 重复步骤 3 和 4 至 4 倍。总工作时间不得超过2小时。

5. 卵母细胞的长体外培养（L-IVCO）

1. 在步骤 1.1.5 中，在 96 井板的井中心转移每井一个 COC。
2. 在38.5°C和5%CO2空气中孵育板₅ 天，最大湿度。
3. 每隔一天（第 2 天和第 4 天）准备新的 M199-L，如步骤 1 中所述。
4. 通过去除 100 μL 的介质，用 100 μL 新鲜制备的 M199-L 更换，更新介质的一半。在立体显微镜下进行介质更新，避免将 COC 移动到井中。

6. 培养后 COC 分类

1. 在L-IVCO结束时，在解剖显微镜下分析COC的形态。
2. 分类如下图 2所示。
   1. 如果 COC 显示紧凑的积子细胞投资，且无积分膨胀和细胞退化的迹象，将其分类为 1 类。
   2. 如果 COC 显示紧凑的积子细胞投资，且无积分膨胀和细胞退化的迹象，且在积率质量中形成蚂蚁状，那么将其归类为 2 类。
   3. 如果 COC 显示几层积子细胞，没有积分膨胀的迹象，并且在积子细胞的外层中显示一些分解细胞，并且没有蚂蚁状的形成，那么将其分类为 3 类。
   4. 如果 COC 显示大量失去超过 50% 的卵母细胞表面的积细胞，以及细胞退化和细胞碎片的迹象，则归类为 4 类。

7. 文化后美的进展评价

1. 卵母细胞变性
   1. 将每个 COC 放在一个四井板的单一井中，每井含有 400 μL 的 199D。
   2. 在解剖显微镜下，使用130-140μL的移液器，通过重复移液，以机械方式轻轻取出积液细胞。
   3. 一旦卵母细胞没有积水投资，将它们转移到另一个包含199D的井。
   4. 重复这个过程，直到所有的卵母细胞被完全变性。
2. 卵母细胞核染色
   注:从现在起，所有程序都在室温下执行。试剂处于室温下。
   1. 将磷酸缓冲液（PBS）中对口甲醛4%中的卵母细胞固定1小时。
      注意:在处理甲状甲醛时，请佩戴个人防护设备，并按照危险废物处置准则处置受污染的材料。
   2. 在含有 1% 聚维醇醇 （PVA） 的 PBS 中，每次清洗卵母细胞 3x 5 分钟。
      注:样品可马上处理或储存在4°C，最多一周。
   3. 将卵母细胞放在含有0.1%三顿X的PBS中，10分钟。
   4. 在含有1%PVA的PBS中，将卵母细胞清洗3x5分钟。
   5. 将卵母细胞奇异地放在5μL的抗fade介质滴中，并辅以4'，6-6-2-苯酚（DAPI）扩张物（1μg/mL）在滑梯上。
   6. 沿幻灯片的长边放置两条双面胶带，以避免在将盖滑放在顶部时使卵母细胞过度扁平化。
   7. 将盖滑放在上面，使其粘附在胶带上，并在处理所有样品时保持黑暗。
   8. 使用配备DAPI过滤器（兴奋/发射:358×461）的传统荧光显微镜分析卵母细胞，以评估卵母细胞的美感进展。
   9. 根据卵母细胞的美感进展对卵母细胞进行分类:GV - GV 内不同程度染色质凝结的卵母细胞;MI = GV 的卵母细胞分解为元相 I;和退化 – 不能被确定为处于任何前一阶段的卵母细胞。

结果

在L-IVCO结束时，COC的形态变化，根据积液细胞的外观确定了4个类，如图2所示。根据选择健康COCs11、26、27的通常形态标准，1、2和3类被判定为健康，而4类则表现出明显的退化迹象，如卵母细胞周围没有完整的积细胞层，被认为严重受损，不适合在未来的 IVP 设置中接受下游程序。^11,26,27总的来说，对5个生...

讨论

在这里，我们描述了一个培养卵母细胞的培养系统，通过支持卵母细胞的生存能力和防止卵母细胞的恢复，促进卵母细胞发育5天。后一个方面是最重要的，让持续生长和分化是必要的，使卵母细胞与小鼠和胚胎发育能力^2,2，20，否则将阻止过早恢复的美的分裂。

在开发这种培养系统时，我们考虑了卵泡中生理生长和分化的几个特征...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well dishes	Nunclon	179830
96-well dish	Becton Dickinson Biosciences	356649	BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)	Sigma	A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Sigma	A3311
Cell culture water	Sigma	W3500
Cilostamide	Sigma	C7971
Cysteamine	Sigma	M9768
Digital camera	Nikon Corp	Camera DS-5M
Disodium phosphate	Sigma	S5136
Estradiol	Sigma	E2758
Glutamax Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
Gonal F	Merck Serono
Heparin	Sigma	H3149
Hepes	Sigma	H3784
Vacuum pump	Cook-IVF
Incubator	Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma	K1377
Medium 199	Sigma	M3769	Powder for hepes-buffered TCM199
Medium 199	Sigma	M2520	Powder for M199-D
Microscope	Nikon Corp	Nikon Diaphot
Microscope	Nikon Corp	Eclipse E 600
Monopotassium phosphate	Sigma	P5655
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicilin	Sigma	P3032
Phenol Red	Sigma	P5530
Polyvinyl alcohol	Sigma	P8137
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	P5288	360k molecular weight
Potassium chloride	Sigma	P5405
Progesterone	Sigma	P8783
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium choride	Sigma	P5886
Sodium pyruvate	Sigma	P4562
Streptomycin	Sigma	S9137
Testosterone	Sigma	86500
Triton X	Sigma	T9284
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Water	Sigma	W3500
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	Z0251