Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Gelişimin erken aşamalarında yumurtalık foliküllerinden büyüyen yumurtaların izolasyonuna yönelik prosedürlerin yanı sıra büyümeyi ve farklılaşmayı tam olarak büyümüş aşamaya kadar desteklendirebilecek bir in vitro kültür sisteminin kurulumunu anlatıyoruz.

Özet

Olgun, döllenebilir yumurtaların sınırlı rezervi, memelilerde yardımcı üremenin başarısı için önemli bir engel teşkil eder. Üreme ömrü boyunca yumurtalıkolgun ve yumurtlayan yumurtaların sadece %1'inin yumurtalıkların sadece %1'inde yumurtalık rezervinin yumurtalık dışı foliküllerin artan popülasyonuna olan sömürüsünü artırmak için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bu tür teknolojiler doğurganlık koruma müdahaleleri, hayvancılık ta seçim programları ve nesli tükenmekte olan türlerin korunması izin vemiştir. Ancak, yumurtalık rezervinin büyük potansiyeli hala büyük ölçüde sömürülmemaktadır. Örneğin, belirli gelişimsel evrelerde yumurtaların in vitro kültürünü desteklemek için bazı girişimlerde bulunulmuş, ancak verimli ve güvenilir protokoller henüz geliştirilmemiştir. Burada, sığır erken antral foliküllerinden tam olarak yetiştirilen evreye kadar toplanan in vitro büyüyen oositlerin geliştirilmesi için tanımlanan, ilgili foliküler evrenin fizyolojik koşullarını yeniden üreten bir kültür sistemini tanımlıyoruz. Hormonlar ve fosfodiesteraz 3 inhibitörü bir arada zamansız meiyotik devamı önlemek ve oosit farklılaşması rehberlik etmek için kullanılmıştır.

Giriş

Üreme ömrü boyunca, bir yumurtalık olgun mevcut yumurtaların sadece minimal bir kısmını, yumurtlama üzerine fallop tüpleri serbest bırakılır, ve döllenmiş olmak ve uygun bir embriyo haline geliştirmek için kullanılabilir1. Öte yandan, bir yumurtalık içinde oositlerin çoğu atrezi geçmesi ve yumurtalık asla. In vitro embriyo üretimi (IVP) teknolojileri yumurtalıkrezervi2,3sömürü artırmak için çalıştılar. Şimdiye kadar, bu tür teknolojiler doğurganlık koruma müdahaleleri, hayvancılık seçim programları ve nesli tükenmekte olan türlerin korunması izin verdi. Yine de, çoğu protokol temelde antral yumurtalık folikül içinde büyüme aşaması tamamlamış yumurta kullanın, ve dolayısıyla tam büyümüş yumurta olarak adlandırılır. IVP teknolojilerinin yaygın olarak kullanıldığı sığırlarda, tam olarak yetiştirilen yumurtalar yaklaşık 120 μm'lik bir çapa ulaşır ve çapı 2 ila 8 mm arasında değişen foliküllerden toplanır (orta antral foliküller)1. Foliküllerden izolasyon üzerine, bu tür yumurtalar in vitro olgunlaşmış ve döllenmiş. Zigotlar daha sonra blastosist evresine kadar kültürlenir ve ya alıcıya aktarılır ya da kriyokorunmuş olur. Sığır, yanı sıra diğer birçok tür, IVP tarafından sunulan potansiyele rağmen, başına üretilen in vitro embriyo sayısı büyük ölçüde son 40 yıldır artmadı. Bu kısmen alınabilir ve standart IVP teknikleri 4 tabi belirli bir zamanda bir yumurtalık doldurmak tam olarak yetiştirilen yumurta sınırlı sayıda nedeniyle4,5,6.

Erken antral foliküller içinde kapalı oositler, yani, çapı 2 mm'den az olan bu foliküller, doğurganlık koruma programlarında kullanılmak üzere potansiyel bir kaynak temsil7 , bir yumurtalık kabaca orta antral daha 10 kat daha erken antral foliküller içerir8. Ancak, bu oositler hala büyüme aşamasında ve henüz tam olarak yetiştirilen aşama9ulaşmadı . Bu nedenle, hala transkripsiyon elverişsal aktif, daha sonraki gelişimsel adımlar için saklanacak mRNA'lar üreten, ve henüz kendiliğinden devam etme ve mayoz tamamlama yeteneği ile oositler vermek için gerekli tüm farklılaşma sürecinden geçmedi bir kez foliküler bölmesi izole10,11. Bu nedenle, doğrudan standart in vitro olgunlaşma (IVM) protokollerine sunulamaz, ancak büyüme aşamasını tamamlamak ve düzgün bir şekilde ayırt etmek için izin verecek ek bir kültür dönemi gerektirir.

Folikül erken antral evresinden orta antral evreye geliştiğinde sığırlarda meydana gelen büyüme den tam olarak yetiştirilen evreye geçiş, yumurta gelişimi sırasında kritik adımlardan biridir. Sığır, çeşitli çalışmalarda bu olayları in vitro2,12,13,,14,15,16,17,18,19olarak özetlemeye çalıştı. Ancak, bugüne kadar hiçbir güvenilir protokoller geliştirilmiştir ve sadece sınırlı başarı bildirilmiştir. Önceki çalışmalara göre20, Bu büyüyen yumurta homojen bir popülasyon oluşturmaktadır. Transkripsiyonel aktif olmasının yanı sıra, onların kromatin germinal vezikül dağılır (GV), GV02,adlı bir yapılandırma,21. Tersine, orta antral foliküllerden elde edilen tam büyümüş oositlerin popülasyonu daha heterojendir, kromatin sıkıştırmanın çeşitli dereceleri (GV1, GV2 ve GV3) ile yansıtılan birdurumdur 20. Bunlar arasında, önceki veriler GV2 ve GV3 oositler genel olarak daha kaliteli ve daha yüksek embriyonik gelişimsel yeterlilik20,21,,22,23,24ile karakterize olduğunu göstermiştir.

Yukarıdaki gözlemlerden yola çıkarak, burada, erken antral foliküllerden kümülüs-oosit kompleksleri (COC) olarak izole edilmiş yumurtaların farklılaşmasını sağlayan 5 günlük bir kültür yumurtası sistemini (L-IVCO) açıklıyoruz. Bu kültür stratejisi laboratuarımızda yürütülen 10 yıllık uzun çalışmalardan gelişti ve daha önce geliştirilen 24-48 saat in vitro oosit kültürü (IVCO)2,prematürasyon sistemleri23,25 ve oosit kültürü sırasında çinko takviyesi üzerine zemin kökleri . Folikül uyarıcı hormon (FSH) ve fosfodiesteraz-3 (PDE3) inhibitörü kombinasyonu, kümülüs-oositiletişiminigeliştirebilen 2 , zamansız meiyotik devamı önlemek2, ve destek oosit büyüme2 kullanıldı.

Protokol

Yumurtalıklar yerel mezbahada (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, İtalya) bulunan 4 ila 8 yaşındaki Holstein süt ineklerinden toplanmıştır.

1. Medya hazırlığı

NOT: Tüm ortamlar kullanımdan en az dört saat önce hazırlanmalıdır. Sodyum bikarbonat tamponlu ortam 38,5 °C ve %5 CO2 hava, maksimum nem de kuluçkaya yatırılır. HEPES-tamponlu ortam termostatik fırında 38.5 °C'de muhafaza edilir.

  1. Yumurtaların uzun in vitro kültürü (L-IVCO) orta
    1. Temel kültür ortamının (M199-B) 15 mL'sini hazırlayın: 2 mM glutamin ile M199 takviyesi, %0.4 yağ asidi içermeyen sığır serum albumini (BSA), 0.2 mM sodyum pirüuvat, 25 mM sodyum bikarbonat, 0.1 mM sibuharin, 21.3 g/mL fenol kırmızısı, 75 g/mL kanamisin ve %4 Polivinilpyrrolidone (PVP; 360 k moleküler ağırlık).
    2. Tutma ortamının 3 mL'sini (M199-H): M199-B'ye 5 m simide ekleyin ve 35 mm Petri kabına dökün.
    3. L-IVCO ortamını (M199-L): 0,15 μg/mL Zn sülfat, 10-4 IU/mL FSH, 10 ng/mL estradiol, 50 ng/mL testosteron, 50 ng/mL progesteron ve 5 μM Simide ile Takviye M199-B' yi hazırlayın.
    4. 96 iyi kaplanmış plakanın her kuyusunun her kuyununa 200 μL M199-L orta yerleştirin. Buharlaşmayı telafi etmek ve kültür sırasında uygun nemi korumak için plakanın dört kenarındaki kuyuları steril kültür suyuyla doldurun.
    5. 96 kuyu plakasını ve M199-H ortamını kuvözde 38,5 °C ve %5 CO2 hava, maksimum nem de kuluçkaya yatırın.
  2. Diseksiyon ortamı
    1. Diseksiyon ortamını (M199-D) hazırlayın: Ek M199 % 0.4 BSA fraksiyonu V, 0.164 mM penisilin, 0.048 mM streptomisin, 1790 adet/L heparin ile. M199-D toplu olarak hazırlanabilir, 20 mL aliquots dağıtılabilir ve 4 °C'de 6 ay saklanabilir. Gerektiğinde, sıcak ve ek 1 aliquot.
    2. 5 μM silostamid (M199-D silostamid) ile takviye m199-D 20 mL hazırlayın.

2. Yumurtalık toplama ve işleme

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler oda sıcaklığında (26 °C) yapılır.

  1. Mezbahadaki yumurtalıkları kurtarın.
  2. Yumurtalıkları 26 – 28 °C penisilin 100 U/mL ve streptomisin 0.1 mg/mL ile eklenen steril saline (NaCl, 9 g/L) yerleştirin.
  3. Organları 4 saat içinde sıcak steril salin le laboratuvara taşıyın.
  4. Yumurtalıkları 26 °C'de tutulan steril salinde 4 kat yıkayın.
  5. -28 mmHg'de vakum basıncı ile bir aspirasyon pompasına bağlı 18 G iğnesi kullanarak çapı 2 mm'den fazla olan tüm folikülleri aspire ederek tüm orta-büyük antral folikülleri çıkarın ve emişli yumurtalıkları 26 °C'de steril saliniçeren bir kabın üzerine yerleştirin.
    NOT: Foliküllerin içeriğinin kaldırılması > 2 mm, deneyi 'kirletecek' tam büyümüş yumurtaların kaynağını mümkün olduğunca kaldırmak için kritik bir adımdır.
  6. Yatay bir laminar akış kaputunun altında, steril bir politetrafloroetilen kesme tahtası üzerine aynı anda bir yumurtalık yerleştirin. Bir neşter sapı üzerine monte edilmiş bir cerrahi bıçak No. 22 kullanarak, yumurtalık korteks dilimleri kesilmiş (yumurtalık dış kısmı, foliküller içeren), 1.5 - 2 mm kalınlığında ve organın ana eksenine paralel.
  7. Yumurtalık korteks dilimlerini 38,5 °C'de sıcak bir tabağa kesme ortamıile kaplı steril cam Petri kabına yerleştirin.
    NOT: Bundan böyle tüm işlemler 38.5 °C'de sıcak bir plaka kullanılarak yapılmaktadır.

3. Foliküllerin seçilmesi ve izole edilmesi ve COC'ların alınması

  1. M199-D 2-3 mL ile 60 mm cam Petri çanak bir yumurtalık korteks dilim yerleştirin.
  2. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, mikrometre donanımlı bir mercek kullanarak 0,5 ila 2 mm arasındaki folikülleri seçin.
  3. Stereomikroskop altında sağlıklı, atreetik olmayan folikülleri tanımlayın. Folikül atrezisini, içinde koyu bir COC olan çok net yarı saydam görünüm gibi morfolojik parametreleri gözlemleyerek değerlendirin. Atreetik folikülleri atın ve tüm diğerleri işlemek.
  4. Bir neşter sapı üzerine monte edilmiş bir cerrahi bıçak No 22 kullanarak folikül bir kenarında maruz kalana kadar bir tarafta folikül çevreleyen yumurtalık dokusu kaldırın.
  5. Bir şırınga üzerine monte edilmiş 26G iğne kullanarak, dikkatlice maruz folikül duvarında bir yarık yapmak. Bu eylem foliküler içerik yayınlayacak, COC oluşan, foliküler sıvı ve hücrelerin kümeleri.
  6. Mikroskop altında COC'yi belirleyin ve kümülüs bütünlüğü, zona pellucida bütünlüğü ve sitoplazmanın homojenliğini inceleyin. Bu kriterler yerine getirilirse, P20 pipetkullanarak COC aspire edin.
  7. M199-D simide izole COC yerleştirin.
  8. 30 dk boyunca izolasyon işlemine devam edin.

4. İn vitro kültüre tabi tutulacak CO'ların seçimi

  1. Diseksiyon mikroskobu altında, adım 3.6'daki kriterlere göre sağlıklı COC'lar seçin.
  2. 60 mm petri kabında, 20 μL M199-D silostamid'in 16 damlası hazırlayın ve damla başına bir sağlıklı COC yerleştirin(Şekil 1A).
  3. Kameraya bağlı ters bir mikroskop kullanarak, kamerayla sağlanan yazılımı kullanarak zona pellucida hariç, yumurta çapı ölçülür.
  4. Yumurtanın net bir görselleştirmesi ile zona pellucida hariç iki dik ölçüm yapın (Şekil 1B).
  5. Zona pellucida hariç iki oositin ölçüm ortalamasının 100 - 110 μm aralığında olup olmadığına emin olun. Yuvarlak olmayan şekilli yumurta veya ölçülebilir olmayan oositlerle COC'leri atın.
  6. Seçilen COC'leri M199-H orta içeren 35 mm'lik bir kapta aktarın ve 5.1 adıma kadar maksimum nem oranı olan 38.5 °C ve %5 CO2'de kuvözde tutun.
  7. 3 ve 4 adımlarını 4x'e kadar tekrarlayın. Toplam çalışma süresi 2 saati geçmemelidir.

5. Yumurtaların uzun in vitro kültürü (L-IVCO)

  1. Adım 1.1.5'te hazırlanacak 96 kuyu plakasının merkezinde kuyu başına bir COC aktarın.
  2. Plakayı 38,5 °C'de 5 gün, havada %5 CO2'de maksimum nemde kuluçkaya yatırın.
  3. Her gün (gün 2 ve gün 4) adım 1'de açıklandığı gibi taze M199-L hazırlayın.
  4. 100 μL orta yıkArak ve 100 μL taze hazırlanmış M199-L ile değiştirerek ortamın yarısını yenileyin. Stereomikroskop altında orta yenilemeyi gerçekleştirin ve COC'leri kuyuya taşımaktan kaçının.

6. Kültürden sonra COC sınıflandırması

  1. L-IVCO'nun sonunda, COC'lerin morfolojisini diseksiyon mikroskobu altında analiz edin.
  2. Şekil 2'debetimlenen gibi sınıflandırın.
    1. COC'ler kümülüs genişlemesi ve hücre dejenerasyonu belirtisi olmadan kompakt bir kümülüs hücre yatırımı gösteriyorsa Sınıf 1 olarak sınıflandırın.
    2. COC'ler kümülüs genişlemesi ve hücre dejenerasyonu belirtisi olmayan ve kümülüs kütlesinde antrum benzeri formasyon içeren kompakt bir kümülüs hücre yatırımı gösteriyorsa Sınıf 2 olarak sınıflandırın.
    3. COC'lar kümülüs genişlemesi belirtisi olmayan birkaç kümülüs hücresi katmanı ve kümülüs hücrelerinin dış tabakasında bazı ayrışmış hücreler ve antrum benzeri bir oluşum yoksa Sınıf 3 olarak sınıflandırın.
    4. COC'ler yumurta yüzeyinin %50'sinden fazlasını genişleten kümülüs hücrelerinin bol miktarda kaybını ve hücre dejenerasyonu ve hücre enkazını gösteriyorsa Sınıf 4 olarak sınıflandırın.

7. Kültür sonrası meyotik ilerlemenin değerlendirilmesi

  1. Oosit denudasyonu
    1. Her COC'yi, kuyu başına 400 μL 199D içeren dört kuyuluk tek bir kuyuya yerleştirin.
    2. Bir diseksiyon mikroskobu altında, 130-140 μL'lik bir pipet seti kullanarak tekrarlanan pipetleme ile kümülüs hücrelerini mekanik olarak çıkarın.
    3. Yumurtalar kümülüs yatırımından kurtulduktan sonra, bunları 199D içeren başka bir kuyuya aktarın.
    4. Tüm yumurtalar tamamen inkar edilene kadar işlemi tekrarlayın.
  2. Oosit nükleer boyama
    NOT: Bundan böyle tüm işlemler oda sıcaklığında yapılmaktadır. Reaktifler oda sıcaklığındadır.
    1. Paraformaldehitteki oositleri 1 saat boyunca fosfat tampon salininde (PBS) %4 oranında düzeltin.
      DİkKAT: Paraformaldehit ilerlerken kişisel koruyucu ekipman giyin ve kontamine olmuş maddeleri tehlikeli atık bertaraf kurallarına uygun olarak imha edin.
    2. % 1 polivinilalkol (PVA) içeren PBS 5 dakika her için yumurta 3x yıkayın.
      NOT: Numuneler hemen işlenebilir veya en fazla bir hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir.
    3. 10 dakika boyunca % 0.1 Triton X içeren PBS'ye yumurtaları yerleştirin.
    4. % 1 PVA içeren PBS 5 dakika her için oositler 3x yıkayın.
    5. 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) dilaktilat (1 μg/mL) ile takviye antifade orta 5 μL damla ları tekil yumurta yerleştirin.
    6. Kapağı üstüne koyarken yumurtaların aşırı düzlememasını önlemek için, slaytın uzun kenarları boyunca iki şerit çift taraflı bant yerleştirin.
    7. Kapak fişini üste yerleştirin, teybinyapışmasını ve tüm örnekleri işlerken karanlıkta kalmasını sağlayabilir.
    8. Oositlerin meyotik ilerlemesini değerlendirmek için DAPI filtreleri (Uyarma/Emisyon: 358,461) ile donatılmış geleneksel epifloresan mikroskobu kullanarak yumurtaları analiz edin.
    9. Oositleri meyiyotik progresyonlara göre sınıflandırın: GV - GV içinde farklı derecede kromatin yoğuşması olan oositler; MI – GV'den yumurtalar metafaz I'e kadar parçalanıyor; ve dejenere - önceki aşamaların herhangi birinde olduğu tespit edilemez oositler.

Sonuçlar

L-IVCO sonunda, COCs brüt morfolojisi değişti ve 4 sınıf kümülüs hücrelerinin görünümüne göre tespit edildi, Şekil 2'degösterildiği gibi . SağlıklıCOC'ların 11,,26,,27, sınıf 1, 2 ve 3'ü seçmek için yaygın olarak kabul edilen morfolojik kriterlere göre sağlıklı değerlendirilirken, oositleri çevreleyen kümülüs hücrelerinin tam tabakalarının yokluğu gibi açık ...

Tartışmalar

Burada, yumurtaların canlılığını destekleyerek ve meyozis inmesini engelleyerek 5 gün boyunca yumurta gelişimini destekleyen yumurtaların büyümesini sağlayan bir kültür sistemini tanımlıyoruz. Bu ikinci yönü sürekli büyüme ve farklılaşma meiyotik ve embriyonikgelişimselyetkinlik2,20ile oosit vermek için gerekli izin vermek için en önemli öneme sahiptir , aksi takdirde meiyotik bölünme erken bir devamı tarafından bloke olacaktır.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 ve UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4-well dishesNunclon179830
96-well dishBecton Dickinson Biosciences356649BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)SigmaA8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V)SigmaA3311
Cell culture waterSigmaW3500
CilostamideSigmaC7971
CysteamineSigmaM9768
Digital cameraNikon CorpCamera DS-5M
Disodium phosphateSigmaS5136
EstradiolSigmaE2758
Glutamax SupplementThermo Fisher Scientific35050061
Gonal FMerck Serono
HeparinSigmaH3149
HepesSigmaH3784
Vacuum pumpCook-IVF
IncubatorSanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticusSigmaK1377
Medium 199SigmaM3769Powder for hepes-buffered TCM199
Medium 199SigmaM2520Powder for M199-D
MicroscopeNikon CorpNikon Diaphot
MicroscopeNikon CorpEclipse E 600
Monopotassium phosphateSigmaP5655
ParaformaldehydeSigma158127
PenicilinSigmaP3032
Phenol RedSigmaP5530
Polyvinyl alcoholSigmaP8137
PolyvinylpyrrolidoneSigmaP5288360k molecular weight
Potassium chlorideSigmaP5405
ProgesteroneSigmaP8783
Sodium bicarbonateSigmaS5761
Sodium chorideSigmaP5886
Sodium pyruvateSigmaP4562
StreptomycinSigmaS9137
TestosteroneSigma86500
Triton XSigmaT9284
Vectashield with DAPIVector LaboratoriesH1200
WaterSigmaW3500
Zinc sulfate heptahydrateSigmaZ0251

Referanslar

  1. Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
  2. Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
  3. McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  4. Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
  5. Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
  6. Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
  7. Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
  8. Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
  9. Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
  10. Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
  11. Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
  12. Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
  13. Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
  14. Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
  15. Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
  16. Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
  17. Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
  18. Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
  19. Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
  20. Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
  21. Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
  22. Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
  23. Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
  24. Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
  25. Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
  26. Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
  27. Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
  28. Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
  29. Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  30. Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
  31. Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
  32. Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
  33. Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
  34. Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
  35. Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
  36. Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
  37. Gordon, I. . Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).
  38. Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
  39. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
  40. Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imbiyolojisiSay 161B y yen oositlererken antral folik lleroosit farkl la masoosit izolasyonus rfolik logenez in vitroyumurtal k rezervido urganl k korumaatreziin vitro embriyo retimi IVPfolik l uyar c hormon FSH

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır