Stratégie de culture in vitro pour les ovocytes du follicule antral précoce chez les bovins

Résumé

Nous décrivons les procédures d’isolement des ovocytes croissants des follicules ovariens aux premiers stades de développement, ainsi que la configuration d’un système de culture in vitro qui peut soutenir la croissance et la différenciation jusqu’au stade adulte.

Résumé

La réserve limitée d’ovocytes matures et fertilisables représente un obstacle majeur au succès de la procréation assistée chez les mammifères. Considérant que pendant la durée de vie reproductive seulement environ 1% des ovocytes dans un ovaire mature et ovule, plusieurs techniques ont été développées pour augmenter l’exploitation de la réserve ovarienne à la population croissante de follicules non ovulatoires. Ces technologies ont permis des interventions de préservation de la fertilité, de programmes de sélection dans le bétail et de conservation des espèces en voie de disparition. Cependant, le vaste potentiel de la réserve ovarienne est encore largement inexploité. Chez les vaches, par exemple, certaines tentatives ont été faites pour soutenir la culture in vitro des ovocytes à des stades de développement spécifiques, mais des protocoles efficaces et fiables n’ont pas encore été élaborés. Nous décrivons ici un système de culture qui reproduit les conditions physiologiques du stade folliculaire correspondant, défini pour développer des ovocytes de croissance in vitro prélevés à partir de follicules antrals précoces bovins jusqu’au stade adulte, correspondant au follicule antral moyen in vivo. Une combinaison d’hormones et d’un inhibiteur de la phosphodiestérase 3 a été utilisée pour prévenir la reprise méiotique prématurée et pour guider la différenciation des ovocytes.

Introduction

Au cours de la durée de vie reproductive, seule une fraction minimale des ovocytes qui sont présents dans un ovaire mature, sont libérés dans les trompes de Fallope lors de l’ovulation, et sont disponibles pour être fécondés et se développer en un embryon viable¹. D’autre part, la plupart des ovocytes dans un ovaire subissent une atrésie et ne sont jamais ovulés. Les technologies de production d’embryons in vitro (IVP) ont tenté d’accroître l’exploitation de la réserve ovarienne^2,3. Jusqu’à présent, ces technologies ont permis des interventions de préservation de la fertilité, de programmes de sélection dans le bétail et de conservation des espèces en voie de disparition. Néanmoins, la plupart des protocoles utilisent des ovocytes qui ont essentiellement terminé la phase de croissance dans le follicule ovarien antral, et sont donc appelés ovocytes adultes. Chez les bovins, où les technologies IVP sont largement utilisées, les ovocytes adultes atteignent un diamètre final d’environ 120 μm et sont prélevés dans des follicules qui s’étendent de 2 à 8 mm de diamètre (follicules antrales moyens)¹. Après l’isolement des follicules, ces ovocytes sont in vitro mûris et fécondés. Les zygotes sont ensuite cultivés jusqu’au stade blastocyste et soit transférés dans un destinataire ou cryoconservés. Chez les bovins, ainsi que chez de nombreuses autres espèces, malgré le potentiel offert par ivp, le nombre d’embryons produits in vitro par vache ne s’est pas largement amélioré au cours des 40 dernières années. Cela est dû en partie au nombre limité d’ovocytes adultes qui peuplent un ovaire à un moment donné qui peut être récupéré et soumis aux techniques STANDARD IVP^4,5,6.

Les ovocytes enfermés dans les follicules antral précoces, c’est-à-dire les follicules de moins de 2 mm de diamètre, représentent une source potentielle à utiliser dans les programmes de préservation de la fertilité⁷ , car un ovaire contient environ 10 fois plus de follicules antral précoces que les antrales moyens⁸. Cependant, ces ovocytes sont encore en phase de croissance et n’ont pas encore atteint le stade⁹. En tant que tels, ils sont encore transcriptionnellement actifs, produisant des ARNms qui seront stockés pour des étapes ultérieures de développement, et n’ont pas encore subi tout le processus de différenciation nécessaire pour conférer les ovocytes avec la capacité de reprendre spontanément et de compléter la méiose I une fois isolé du compartiment folliculaire^10,11. Par conséquent, ils ne peuvent pas être soumis directement aux protocoles standard de maturation in vitro (IVM), mais ils nécessitent une période de culture supplémentaire qui leur permettrait de terminer la phase de croissance et de différencier correctement.

La transition de l’étape de la culture à l’étape adulte, qui chez le bétail se produit lorsque le follicule se développe du stade antral précoce au stade antral moyen, est l’une des étapes critiques du développement des ovocytes. Chez le bétail, plusieurs études ont tenté de récapituler ces événements in vitro^{2,12,13,14,15,16,17,18,19}. Cependant, à ce jour, aucun protocole fiable n’a été élaboré et seul un succès limité a été signalé. Selon des études précédentes²⁰, ces ovocytes croissants constituent une population homogène. En plus d’être transcriptionnellement actives, leur chromatine est dispersée dans la vésicule germinale (GV), dans une configuration qui s’appelle GV0^2,21. Inversement, la population d’ovocytes adultes obtenus à partir de follicules antral moyens est plus hétérogène, une condition qui se reflète par les différents degrés de compactage de la chromatine (GV1, GV2 et GV3) qui peut être observé²⁰. Parmi ceux-ci, des données antérieures ont montré que les ovocytes GV2 et GV3 sont globalement caractérisés par une meilleure qualité et une meilleure compétence de développement embryonnaire^{20,21,22,23,24}.

À partir des observations ci-dessus, nous décrivons ici un système de culture de 5 jours d’ovocytes (L-IVCO) qui permet la différenciation des ovocytes isolés comme complexes cumulus-oocytes (COC) des follicules antral précoces. Cette stratégie de culture a évolué à partir de 10 ans d’études menées dans notre laboratoire et les racines de son terrain sur les 24-48 heures précédemment développé culture ovocytes (IVCO)², systèmes de prématuration^23,25 et la supplémentation en zinc au cours de la culture des ovocytes . Une combinaison de l’hormone stimulante de follicule (FSH) et d’un inhibiteur de phosphodiestérase-3 (PDE3), capable d’améliorer la communication cumulus-oocyte², empêchent la reprise méiotique intempestive², et soutiennent la croissance d’oocyte² a été employée.

Protocole

Les ovaires ont été prélevés sur des vaches laitières Holstein âgées de 4 à 8 ans récupérées à l’abattoir local (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italie).

1. Préparation des médias

REMARQUE : Tous les supports doivent être préparés au moins quatre heures avant l’utilisation. Les milieux tamponnés de bicarbonate de sodium sont incubés à 38,5 °C et à 5 % de CO₂ dans l’air, humidité maximale. Les supports tamponnés HEPES sont maintenus à 38,5 °C dans le four thermostatique.

1. Longue culture in vitro des ovocytes (L-IVCO) moyen
   1. Préparer 15 mL du milieu de culture de base (M199-B): Supplément M199 avec 2 mM glutamine, 0,4 % d’albumine de sérum bovin sans acide gras (BSA), 0,2 m MM de pyruvate de sodium, 25 mM de bicarbonate de sodium, 0,1 mM de cystéamine, 21,3 μg/mL de phénol rouge, 75 μg/mL de kanamycine et 4 % de polyvinylpyrrolidone (PVP; 360 k poids moléculaire).
   2. Préparer 3 mL du milieu de fixation (M199-H) : Ajouter 5 μM de cilostamide à M199-B et le verser dans une boîte de Pétri de 35 mm.
   3. Préparer le milieu L-IVCO (M199-L) : Supplément M199-B avec 0,15 μg/mL de sulfate Zn, 10^-4 IU/mL FSH, 10 ng/mL estradiol, 50 ng/mL de testostérone, 50 ng/mL progesteronesterone et 5 μM Cilostamide.
   4. Placer 200 μL de milieu M199-L dans chaque puits de la plaque bien enduite de 96. Remplissez les puits dans les quatre bords de la plaque avec de l’eau de culture stérile pour compenser l’évaporation et pour maintenir l’humidité appropriée pendant la culture.
   5. Incuber la plaque de puits 96 et le milieu M199-H dans l’incubateur à 38,5 °C et 5% de CO₂ dans l’air, humidité maximale.
2. Milieu de dissection
   1. Préparer le milieu de dissection (M199-D) : Supplément M199 avec 0,4 % de fractionnement BSA V, 0,164 mM de pénicilline, 0,048 mM streptomycine, 1790 unités/L héparine. Le M199-D peut être préparé en vrac, distribué en aliquots de 20 mL et stocké à 4 °C pendant 6 mois. Au besoin, réchauffer et compléter 1 aliquot.
   2. Préparer 20 mL de M199-D complété par 5 μM de cilostamide (Cilostamide M199-D).

2. Collecte et traitement des ovaires

REMARQUE : Toutes les procédures sont effectuées à température ambiante (26 °C) sauf indication contraire.

1. Récupérer les ovaires à l’abattoir des vaches.
2. Placer les ovaires dans la solution saline stérile (NaCl, 9 g/L) à 26 – 28 °C ajoutés avec de la pénicilline 100 U/mL et de la streptomycine 0,1 mg/mL.
3. Transporter les organes au laboratoire en solution saline stérile chaude dans un délai de 4 h.
4. Laver les ovaires 4x en solution saline stérile maintenue à 26 °C.
5. Retirez tous les follicules antral mi à grands en aspirant tous les follicules de plus de 2 mm de diamètre à l’aide d’une aiguille de 18 G reliée à une pompe d’aspiration avec pression sous vide fixée à -28 mmHg et placez les ovaires aspirés dans un bécher avec une solution saline stérile à 26 °C.
   REMARQUE : L’élimination du contenu des follicules > 2 mm est une étape essentielle pour enlever autant que possible la source d’ovocytes adultes qui « contamineraient » l’expérience.
6. Sous un capot horizontal de flux laminaire, placer un ovaire à l’époque sur une planche à découper stérile en polytétrafluoroéthylène. À l’aide d’une lame chirurgicale no 22 montée sur une poignée de scalpel, couper des tranches du cortex ovarien (la partie externe de l’ovaire, qui contient les follicules), 1,5 à 2 mm d’épaisseur et parallèle à l’axe principal de l’organe.
7. Placer les tranches du cortex ovarien dans une boîte de Pétri en verre stérile recouverte d’un milieu de dissection sur une plaque chaude à 38,5 °C.
   REMARQUE : Désormais, toutes les procédures sont effectuées à 38,5 °C à l’aide d’une plaque chaude.

3. Sélection et isolement des follicules et récupération des COC

1. Placez une tranche de cortex ovarien dans une boîte de Pétri en verre de 60 mm avec 2-3 mL de M199-D.
2. À l’aide d’un microscope à dissection, sélectionnez les follicules entre 0,5 et 2 mm à l’aide d’un oculaire équipé d’un micromètre.
3. Identifiez les follicules sains et non atrétiques sous le stéréomicroscope. Évaluez l’atrésie du follicule en observant des paramètres morphologiques, tels que l’aspect translucide très clair, avec un COC foncé à l’intérieur. Jetez les follicules atretiques et traitez tous les autres.
4. À l’aide d’une lame chirurgicale no 22 montée sur une poignée de scalpel enlever le tissu ovarien entourant le follicule d’un côté jusqu’à ce que le follicule est exposé sur un bord.
5. À l’aide d’une aiguille 26G montée sur une seringue, faites soigneusement une fente dans le mur de follicule exposé. Cette action libérera le contenu folliculaire, comprenant le COC, le liquide folliculaire et des amas de cellules.
6. Identifiez le COC au microscope et examinez l’intégrité du cumulus, l’intégrité de zona pellucida et l’homogénéité du cytoplasme. Si ces critères sont remplis, aspirate le COC à l’aide d’une pipette P20.
7. Placez le COC isolé dans le cilostamide M199-D.
8. Poursuivre la procédure d’isolement pendant 30 min.

4. Sélection des COC à soumettre à la culture in vitro

1. Sous le microscope de dissection, sélectionnez les COC sains en fonction des critères de l’étape 3.6.
2. Dans une boîte de Pétri de 60 mm, préparer 16 gouttes de 20 μL de cidostamide M199-D et placer un COC sain par goutte (Figure 1A).
3. À l’aide d’un microscope inversé fixé à une caméra mesurer le diamètre des ovocytes, à l’exclusion de la zona pellucida, en utilisant le logiciel fourni avec la caméra.
4. Avec une visualisation claire de l’ovocyte, faire deux mesures perpendiculaires à l’exclusion de la zona pellucida (Figure 1B).
5. Assurez-vous si la moyenne de la mesure des deux ovocytes, à l’exclusion de la zona pellucida, se situe dans une fourchette de 100 à 110 μm. Jetez les COC avec des ovocytes de forme non arrondi ou avec des ovocytes qui ne sont pas mesurables.
6. Transférer les COC sélectionnés dans un plat de 35 mm contenant un milieu M199-H et les conserver dans l’incubateur à 38,5 °C et 5 % de CO₂ dans l’air, humidité maximale jusqu’à l’étape 5.1.
7. Répétez les étapes 3 et 4 jusqu’à 4x. Le temps de travail global ne doit pas dépasser 2 h.

5. Longue culture in vitro des ovocytes (L-IVCO)

1. Transférer un COC par puits au centre d’un puits de la plaque de puits 96 pour être préparé à l’étape 1.1.5.
2. Incuber la plaque pendant 5 jours à 38,5 °C et 5 % de CO₂ dans l’air, humidité maximale.
3. Tous les deux jours (jour 2 et jour 4) préparer frais M199-L comme décrit à l’étape 1.
4. Renouveler la moitié du milieu en enlevant 100 μL de milieu et en remplaçant par 100 μL de M199-L fraîchement préparé. Effectuer le renouvellement moyen sous le stéréomicroscope et éviter de déplacer les COC dans le puits.

6. Classification du COC après la culture

1. À la fin du L-IVCO, analysez la morphologie des COC sous le microscope de dissection.
2. Classer comme indiqué à la figure 2.
   1. Classez comme classe 1 si les COC présentent un investissement compact dans les cellules cumulus sans aucun signe d’expansion du cumulus et de dégénérescence cellulaire.
   2. Classez comme classe 2 si les COC présentent un investissement compact dans les cellules cumulus sans aucun signe d’expansion du cumulus et de dégénérescence cellulaire et avec une formation semblable à une antrum dans la masse cumulus.
   3. Classez comme classe 3 si les COC présentent plusieurs couches de cellule cumulus sans aucun signe d’expansion du cumulus et quelques cellules ventilées dans la couche externe des cellules cumulus et sans formation antrum- like.
   4. Classer comme classe 4 si les COC montrent une perte abondante de cellules cumulus s’étendant sur plus de 50% de la surface des ovocytes, et des signes de dégénérescence cellulaire et de débris cellulaires.

7. Évaluation de la progression méiotique après culture

1. Dénudation d’ovocytes
   1. Placer chaque COC dans un seul puits d’une plaque de quatre puits contenant 400 μL de 199D par puits.
   2. Sous un microscope de dissection retirer doucement les cellules cumulus mécaniquement en tirant à répétition à l’aide d’une pipette réglée à 130-140 μL.
   3. Une fois que les ovocytes sont exempts de l’investissement cumulus, les transférer à un autre puits contenant 199D.
   4. Répétez le processus jusqu’à ce que tous les ovocytes soient complètement dénudés.
2. Coloration nucléaire d’ovocyte
   REMARQUE : Désormais, toutes les procédures sont effectuées à température ambiante. Les réactifs sont à température ambiante.
   1. Fixer les ovocytes dans le paraformaldéhyde 4% dans la solution saline tampon de phosphate (PBS) pendant 1 h.
      AVERTISSEMENT : Portez de l’équipement de protection individuelle lors de la manipulation du paraformaldéhyde et éliminez les matières contaminées conformément aux lignes directrices sur l’élimination des déchets dangereux.
   2. Laver les ovocytes 3x pendant 5 min chacun en PBS contenant 1% de polyvinylalcohol (PVA).
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être traités immédiatement ou conservés à 4 °C pendant une semaine maximale.
   3. Placez les ovocytes dans pbs contenant 0,1% de Triton X pendant 10 min.
   4. Laver les ovocytes 3x pendant 5 min chacun dans PBS contenant 1% de PVA.
   5. Placer les ovocytes singulièrement dans des gouttes de 5 μL de milieu antifade complétées par 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dilactate (1 μg/mL) sur une diapositive.
   6. Placez deux bandes de ruban adhésif à double face le long des longs côtés de la glissière, afin d’éviter l’aplatissement excessif des ovocytes lorsque vous mettez le couvercle sur le dessus.
   7. Placez le couvercle sur le dessus, faites-le adhérer à la bande et garder dans l’obscurité tout en traitant tous les échantillons.
   8. Analyser les ovocytes à l’aide d’un microscope à épifluorescence classique équipé de filtres DAPI (Excitation/Émission : 358/461) pour évaluer la progression méiotique des ovocytes.
   9. Classer les ovocytes en fonction de leur progression méiotique : GV - ovocytes avec différents degrés de condensation de chromatine dans le GV ; MI – ovocytes de GV se décomposent en métaphase I; et dégénéré – ovocytes qui ne pouvaient être identifiés comme étant à aucun des stades précédents.

Résultats

À la fin du L-IVCO, la morphologie brute des COC a changé et 4 classes ont été identifiées en fonction de l’apparence des cellules cumulus, comme le montre la figure 2. Sur la base des critères morphologiques couramment adoptés pour sélectionner les COC sains^11,26,27, les classes 1, 2 et 3 ont été jugées saines, tandis que la classe 4, qui a montré des signes clairs de dégénérescenc...

Discussion

Ici, nous décrivons un système de culture pour la croissance des ovocytes qui favorise le développement des ovocytes pendant 5 jours en soutenant leur viabilité et en empêchant la reprise méiotique. Ce dernier aspect est de la plus haute importance pour permettre la croissance continue et la différenciation nécessaires pour conférer l’ovocyte avec la compétence méiotique et embryonnaire de développement^2,20, qui serait autrement bloqué par une repr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-well dishes	Nunclon	179830
96-well dish	Becton Dickinson Biosciences	356649	BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)	Sigma	A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Sigma	A3311
Cell culture water	Sigma	W3500
Cilostamide	Sigma	C7971
Cysteamine	Sigma	M9768
Digital camera	Nikon Corp	Camera DS-5M
Disodium phosphate	Sigma	S5136
Estradiol	Sigma	E2758
Glutamax Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
Gonal F	Merck Serono
Heparin	Sigma	H3149
HEPES	Sigma	H3784
Vacuum pump	Cook-IVF	KMAR-5100
Incubator	Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma	K1377
Medium 199	Sigma	M3769	Powder for bicarbonate-buffered media
Medium 199	Sigma	M2520	Powder for HEPES-buffered media
Microscope	Nikon Corp	Nikon Diaphot
Microscope	Nikon Corp	Eclipse E 600
Monopotassium phosphate	Sigma	P5655
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicilin	Sigma	P3032
Phenol Red	Sigma	P5530
Polyvinyl alcohol	Sigma	P8137
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	P5288	360k molecular weight
Potassium chloride	Sigma	P5405
Progesterone	Sigma	P8783
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium choride	Sigma	P5886
Sodium pyruvate	Sigma	P4562
Streptomycin	Sigma	S9137
Testosterone	Sigma	86500
Triton X	Sigma	T9284
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Water	Sigma	W3500
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	Z0251