تقييم الخصائص الوعائية الوراثية للخلايا الشبيهة بسرطان المبيض باستخدام نظام الثقافة المشتركة ثلاثي الأبعاد ، NICO-1

Summary

الخلايا الجذعية لسرطان المبيض (OCSC) هي المسؤولة عن بدء السرطان ، والتكرار ، والمقاومة العلاجية ، وورم خبيث. يعتبر مكانة الأوعية الدموية OCSC لتعزيز التجديد الذاتي ل OCSCs ، مما يؤدي إلى المقاومة الكيميائية. يوفر هذا البروتوكول الأساس لإنشاء نموذج متخصص للأوعية الدموية OCSC قابل للتكرار في المختبر.

Abstract

تتواجد الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) في مكان داعم ، وتشكل بيئة دقيقة تتكون من خلايا انسجة مجاورة وأوعية ومصفوفة خارج الخلية. تشكل قدرة CSCs على المشاركة في تطوير البطانة خاصية مهمة تساهم بشكل مباشر في الفهم العام لآليات تكوين الورم وورم خبيث للورم. الغرض من هذا العمل هو إنشاء منهجية قابلة للتكرار للتحقيق في قدرة الخلايا الجذعية لسرطان المبيض (OCSCs) على بدء الورم. هنا ، قمنا بفحص آلية الأوعية الدموية الجديدة بين الخلايا البطانية و OCSCs جنبا إلى جنب مع التغيرات المورفولوجية للخلايا البطانية باستخدام نموذج الثقافة المشتركة في المختبر NICO-1. يسمح هذا البروتوكول بتصور خطوة الأوعية الدموية الجديدة المحيطة ب OCSCs بطريقة الدورة الزمنية. يمكن أن توفر هذه التقنية نظرة ثاقبة فيما يتعلق بالخصائص الوعائية ل OCSCs في ورم خبيث للورم.

Introduction

سرطان المبيض هو ثامن أكثر الأورام الخبيثة شيوعا بين النساء في جميع أنحاء العالم ، مع ما يقرب من 300,000 تشخيص جديد وما يقدر بنحو 180,000 حالة وفاة سنويا¹. عند التشخيص الأولي ، غالبا ما يظهر سرطان المبيض بأعراض حادة ، حيث يكون حوالي 75٪ من المرضى بالفعل في المرحلة الثالثة والرابعة. وفقا لذلك ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات هو <30٪ ومعدل الوفيات هو الأعلى بين سرطانات أمراض النساء² ، مع كفاءة علاج سرطان المبيض تعتمد بشكل كبير على العوامل السريرية مثل الإنجاز الناجح لجراحة debulking ، ومقاومة العلاج الكيميائي ، والتكرار بعد العلاج الأولي.

يتم تنظيم أنسجة سرطان المبيض بشكل هرمي ، حيث لا تكون جميع مكونات الورم قادرة على توليد أحفاد متساوية. تعتبر الخلايا الوحيدة القادرة على التجديد الذاتي وإنتاج مجموعة من الخلايا السرطانية غير المتجانسة تمثل الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs)³. يرافق التجديد الذاتي ل CSC وبدء الورم تعزيز تكوين الأوعية لإعادة تشكيل البيئة المكروية للورم لغرض الحفاظ على مكانة داعمة. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام النماذج السابقة للتحليلات المختبرية بسبب التكاثر المحدود لزراعة الخلايا الجذعية السرطانية المشتقة من العينات السريرية بسبب تعطيل الأجسام الكروية بعد المرور المتعدد. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق تجريبية لزراعة الخلايا الجذعية السرطانية من المرضى لعدة تطبيقات⁴،⁵،^6،7. على وجه الخصوص ، من خلال استغلال خاصية CSCs للنمو عن طريق تكوين كرويات في ألواح ربط منخفضة للغاية مع وسط خال من المصل ، يتم حث الخلايا الجذعية السرطانية المزروعة على التعبير عن علامة سطح الخلية الجذعية التي لا يتم التعبير عنها في الخلايا السرطانية الطبيعية مع إمكانية التمايز متعدد السلالات ^8,9.

أظهرت البيانات الحديثة أن استمرار المبيض الخامل (O) CSCs الذي يتم تصوره على أنه انتشار في الصفاق يرتبط بتجديدها كأورام متكررة¹⁰. وبالتالي فإن فهم السمات الجزيئية والبيولوجية ل OCSCs قد يسمح بالاستهداف الفعال لهذه الخلايا واستئصالها ، مما يؤدي إلى مغفرة الورم المحتملة. على وجه الخصوص ، لا يعرف سوى القليل فيما يتعلق بالسمات الميكانيكية الخلوية والجزيئية لأدوار CSCs في تكوين الأوعية^{الدموية 11}. لذلك ، في البروتوكول الحالي ، استخدمنا OCSCs المشتقة من المريض في بيئة مخبرية للتحقيق في خاصية تولد الأوعية الدموية للخلايا البطانية باستخدام نموذج الثقافة المشتركة ، والذي قد يحاكي البيئة المكروية للورم في الخلايا الجذعية السرطانية والخلايا البطانية في الموقع النقيلي في الإعداد السريري. في نهاية المطاف ، نظرا لأن الأوعية الدموية الجديدة تشكل عملية حاسمة ضرورية لدعم نمو الورم وورم خبيث ، فإن الفهم الأفضل لآليته سيسمح بتطوير علاج استهداف جديد ل OCSCs في الموقع النقيلي.

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصور خطوة الأوعية الدموية الجديدة المحيطة ب CSCs بطريقة الدورة الزمنية. تتضمن ميزة البروتوكول السماح بإجراء تحقيقات قابلة للتكرار بالكامل باستخدام نظام الاستزراع المشترك ثلاثي الأبعاد ، NICO-1 ، مما يسمح بمراقبة التأثيرات على المرضى من قدرة بدء الورم المشتقة من OCSC أثناء تكوين الأوعية الدموية للخلايا البطانية.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات بموجب البروتوكول الذي وافقت عليه لجنة الأخلاقيات لرفاهية الإنسان. قدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة على الاستخدام البحثي لعيناتهم ، وتمت الموافقة على جمع واستخدام الأنسجة لهذه الدراسة من قبل الجينوم البشري ، لجنة أخلاقيات أبحاث تحليل الجينات في جامعة تيكيو.

1. عزل وزراعة الخلايا الجذعية لسرطان المبيض (OCSCs) من المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض والاستسقاء في خزانة السلامة البيولوجية من المستوى 2

1. عزل الخلايا الجذعية السرطانية من استسقاء سرطان المبيض البشري الذي يتم الحصول عليه عن طريق البزل. جمع ما لا يقل عن 100-250 مل من الاستسقاء من المرضى لاتخاذ عدد كاف من الخلايا الجذعية السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتقييم ملامح التعبير لعلامات الخلايا الجذعية السرطانية (على سبيل المثال ، EpCAM و Calretinin و CD133 و CD44 و CD45 و ALDH1 و Oct4) وعلامات سرطان المبيض (pAX-8 و WT-1) عن طريق قياس التدفق الخلوي.
   1. جهاز الطرد المركزي استسقاء سرطان المبيض البشري عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة خلال 24 ساعة بعد شفط الاستسقاء.
   2. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 2 مل من وسط OCSC و 8 مل من محلول ملحي مخزن بنسبة 30٪ Histodenz / phosphate (PBS ، درجة الحموضة 7.4).
   3. تحضير وسيط OCSC: مكمل StemPro hESC ، DMEM ⁄F-12 مع L-glutamine (وسط GlutaMAX) ، 25٪ BSA ، 100 ميكرومتر 2-mercaptoethanol ، 8 ng / mL FGF الأساسي ، 10 ميكرومتر الأنسولين ، و 20 ميكرومتر Y-27632.
   4. قم بتراكب 2 مل من وسط OCSC بعناية على محلول الخلية في الخطوة 1.1.2 في أنبوب سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في دوار دلو متأرجح بدون كبح.
   5. انقل بعناية طبقة OCSC (دون إزعاج في الطور البيني) إلى أنبوب جديد سعة 15 مل بواسطة ماصة النقل.
   6. املأ مع PBS حتى 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية.
   7. إعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط OCSC والبذور على طبق ثقافة منخفض للغاية ؛ يجب الحفاظ على الثقافات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
   8. تغيير الوسيط كل ثلاثة أيام. قف بعناية طبق الثقافة لمدة 1 دقيقة ، وتخلص من جزء من المادة الطافية وأضف الوسيلة الجديدة.
2. مرور CSCs
   1. اجمع OCSCs في أنبوب سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي بمعدل 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. قم بإزالة المادة الطافية ، واملأها ب PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 1 مل من محلول انفصال الخلية المكون من إنزيمات المحللة للبروتين والكولاجين (على سبيل المثال ، AccuMax) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   4. تخلط جيدا عن طريق السحب واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تأكد من وجود الخلايا في تعليق واحد.
   5. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات ، وملء مع PBS ، وأجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط OCSC للبذر اللاحق على أطباق الاستزراع ذات التعلق المنخفض للغاية وصيانتها عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.

2. زراعة الخلايا البطانية HUEhT-1

1. مرور خلايا HUEhT-1
   1. قم بإزالة الوسط من طبق الثقافة HUEhT-1 واغسل الخلايا باستخدام PBS.
   2. أضف 1 مل من 0.025٪ تربسين واحتضانه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. أضف 5 مل من وسط نمو الخلايا البطانية 2 ، واجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل ، وأجهزة طرد مركزي بمعدل 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   4. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط HUEhT-1 ، وزرع الخلايا على أطباق الاستزراع المغلفة بالكولاجين متبوعة بالصيانة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
   5. تغيير الوسيط كل ثلاثة أيام.

3. تحضير صفيحة الاستزراع المشترك NICO-1 لفحص تكوين الأنبوب باستخدام خلايا HUEhT-1

1. قم بتجميع NICO-1 والطلاء باستخدام هيدروجيل قائم على المصفوفة خارج الخلية (Matrigel Matrix).
   1. قم بتجميع جانب واحد من NICO-1 باتباع تعليمات الشركة المصنعة واحتفظ به على الثلج.
   2. قم بتغطية سطح NICO-1 ب 300 ميكرولتر من PBS البارد ثم قم بإزالة المخزن المؤقت.
   3. أضف 300 ميكرولتر من هيدروجيل مبرد قائم على المصفوفة خارج الخلية واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
   4. لتحقيق التوازن ، اغمر المرشح بالإيثانول بنسبة 100٪ ، ثم اغسل مرشح ICCP مقاس 13 مم (0.6 ميكرومتر) باستخدام PBS لمدة دقيقة واحدة.
   5. قم بتجميع NICO-1 بما في ذلك أجزاء الجسم الرئيسية A (الغرفة اليمنى) و B (الغرفة اليسرى) جنبا إلى جنب مع الحلقة O والفلتر المتوازن.

4. زرع خلايا HUEhT-1 و CSCs على نظام NICO-1

1. تحضير معلقات الخلايا HUEhT-1 عن طريق trypsinizing أحادي الخلية وإعادة تعليق الخلايا في وسط نمو الخلايا البطانية مع مصل عجل الجنين 2٪.
2. أضف 1.2 مل من معلق الخلية (1.5 × 10⁵ خلايا) إلى كل بئر مطلي بالهيدروجيل قائم على المصفوفة خارج الخلية.
3. أضف 1.5 مل من OCSCs المستزرعة لمدة خمسة أيام إلى البئر الآخر.
4. احتضان NICO-1 عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ ؛ يمكن ملاحظة تكوين الأنبوب تحت المجهر وتشكيل الشبكة على هيدروجيل قائم على المصفوفة خارج الخلية يتم قياسه عن طريق عدد الفروع.

النتائج

قمنا بجمع سوائل الاستسقاء التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض المتقدم أثناء الجراحة أو البزل لغرض إجراء ثقافة مستقرة طويلة الأجل للكرويات. هنا ، نقدم حالات لثقافة كروية طويلة الأجل من CSCs المبيض تسمى CSC1 و CSC2. يحمل كلا خطي الخلية نفس التشخيص والملام?...

Discussion

يصف البروتوكول المقدم كيفية محاكاة البيئة المكروية للورم في OCSCs في بيئة معملية. يشكل المكون الأساسي للطريقة نموذج الاستزراع المشترك القابل للتكرار بدرجة كبيرة والذي تم الحصول عليه باستخدام نظام NICO-1 ، وهو نظام استزراع مشترك غير مباشر في Transwell. تدرس العديد من نماذج الاستزراع المشترك المتاح...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025% Trypsin	Thermo	R001100
10 mL Pipet	Thermo	170356N
1250 µL Pipet tip	QSP	T112XLRS-Q
15 mL tube	Nunc	339650
200 µL Pipet tip	QSP	T110RS-NEW
2-Mercaptoethanol	Thermo (Gibco)	21985023
5 mL Pipet	Thermo	170366N
50 mL tube	Corning	430290
AccuMAX	Innovative Cell Technologies	AM105
BioCoatTM Collagen I 60mm Dish	Corning	356401
Centrifuge	KUBOTA	2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3471
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011
Ethanol	WAKO	057-00456
FGF-Basic	Thermo (Gibco)	PHG0021
Histodenz	SIGMA	D2158
HUEhT-1 cell	JCRB Cell Bank	JCRB1458
ICCP Filter 0.6 µm	Ginrei Lab.	2525-06
Insulin, human	SIGMA (Roche)	11376497001
Luminometer	PerkinElmer	ARVO MX-flad
Matrigel Matrix	Corning	356234
Microscope	Yokogawa	CQ-1
NICO-1	Ginrei Lab.	2501-02
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005290
P1000 Pipet	Gilson	F123602
P200 Pipet	Gilson	F123601
PBS	Thermo (Gibco)	14190-144
StemPro hESC SFM	Thermo (Gibco)	A1000701
Transfer Pipet	FALCON	357575
Y-27632	WAKO	253-00513