使用三维共培养系统NICO-1评估卵巢癌干细胞样细胞的血管遗传特性

摘要

卵巢癌干细胞 （OCSC） 负责癌症的发生、复发、治疗耐药性和转移。OCSC血管生态位被认为可促进OCSC的自我更新，导致化学耐药性。该协议为体外建立可重复的OCSC血管生态位模型提供了基础。

摘要

癌症干细胞（CSC）位于支持性生态位中，构成由相邻基质细胞，血管和细胞外基质组成的微环境。CSC参与内皮发育的能力构成了一个重要特征，直接有助于对肿瘤发生和肿瘤转移机制的一般理解。这项工作的目的是建立一种可重复的方法，以研究卵巢癌干细胞（OCSC）的肿瘤起始能力。本文使用体外共培养模型NICO-1研究了内皮细胞和OCSC之间的新生血管形成机制以及内皮细胞的形态变化。该协议允许以时程方式可视化OCSC周围的新生血管形成步骤。该技术可以提供有关OCSC在肿瘤转移中的血管生成特性的见解。

引言

卵巢癌是全球女性第八大常见恶性肿瘤，每年约有 300，000 例新诊断，估计有 180，000 例死亡¹。在初步诊断时，卵巢癌通常出现严重症状，约75%的患者已经处于III-IV期。因此，卵巢癌的5年生存率为<30%，死亡率在妇科癌症中^最高2，卵巢癌的治疗效率高度依赖于减瘤手术的成功完成、化疗耐药和初始治疗后复发等临床因素。

卵巢癌组织是分层组织的，并非所有肿瘤成分都能够同样产生后代。唯一能够自我更新并产生异质性肿瘤细胞群的细胞被认为代表癌症干细胞（CSC）³。CSC自我更新和肿瘤起始伴随着促进血管生成以重塑其肿瘤微环境，以维持支持性生态位。然而，以前的模型不能用于体外分析，因为培养来自临床样品的CSC的可重复性有限，因为多次传代后球状体的破坏。最近，已经开发了从患者身上培养CSC的实验方法，用于多种应用⁴，⁵，^6，7。特别是，通过利用CSCs在无血清培养基的超低附着板中形成球状体来生长的特性，诱导培养的CSC表达在具有多谱系分^化潜力的正常肿瘤细胞中未表达的干细胞表面标志物8^，9。

最近的数据表明，在腹膜上可视化为播散的休眠卵巢（O）CSC的持续存在与其作为复发性肿瘤的再生有关¹⁰。因此，了解OCSC的分子和生物学特征可以有效地靶向和根除这些细胞，从而产生潜在的肿瘤缓解。特别是，关于CSC在血管生成中的作用的细胞和分子机制特征知之甚少¹¹。因此，在本协议中，我们在体外环境中使用患者来源的OCSCs，使用共培养模型研究内皮细胞的血管生成特性，该模型可能模拟CSC和内皮细胞的肿瘤微环境在临床环境中转移部位。最终，由于新生血管形成是支持肿瘤生长和转移所必需的关键过程，因此更好地了解其机制将允许在转移部位为OCSC开发一种新的靶向疗法。

在这里，我们提出了一个协议，以时间过程的方式可视化围绕CSC的新生血管形成步骤。该方案的优点包括允许使用3D共培养系统NICO-1进行完全可重复的研究，从而允许观察OCSC衍生的肿瘤起始能力在内皮细胞血管生成过程中对患者的影响。

研究方案

所有程序均根据人类福利伦理委员会批准的协议执行。所有患者都为其样本的研究用途提供了书面知情同意书，本研究的组织收集和使用得到了帝京大学人类基因组基因分析研究伦理委员会的批准。

1. 在 2 级生物安全柜中分离和培养卵巢癌和腹水患者的卵巢癌干细胞 （OCSC）

1. 从通过穿刺获得的人卵巢癌腹水中分离癌症干细胞。从患者身上收集至少 100-250 mL 的腹水，以摄取足够数量的癌症干细胞。此外，通过流式细胞术评估癌症干细胞标志物（即 EpCAM、钙视黄素、CD133、CD44、CD45、ALDH1 和 Oct4）和卵巢癌标志物（pAX-8、WT-1）的表达谱。
   1. 在腹水抽吸后24小时内在室温下以300× g 离心人卵巢癌腹水10分钟。
   2. 除去上清液，加入 2 mL OCSC 培养基和 8 mL 30% 组氨酸盐/磷酸盐缓冲盐水 （PBS，pH 7.4） 溶液。
   3. 制备 OCSC 培养基:StemPro hESC 补充剂、含有 L-谷氨酰胺的 DMEM/F-12（GlutaMAX 培养基）、25% BSA、100 μM 2-巯基乙醇、8 ng/mL FGF BASIC、10 μM 胰岛素和 20 μM Y-27632。
   4. 小心地将 2 mL OCSC 培养基覆盖到 15 mL 管中的步骤 1.1.2 中的细胞溶液中，并在室温下在水平吊篮转子中以 450 x g 离心 20 分钟，无需制动。
   5. 通过移液管小心地将OCSC层（在相间不受干扰）转移到新的15 mL管中。
   6. 用高达 15 mL 的 PBS 填充。在室温下以300× g 离心5分钟，除去上清液。
   7. 将细胞沉淀重悬于OCSC培养基中，并接种在超低附着培养皿上;培养物应保持在37°C的5%CO₂中。
   8. 每三天更换一次培养基。小心地将培养皿静置约1分钟，弃去部分上清液并加入新培养基。
2. CSC的通过
   1. 将 OCSC 收集在 15 mL 管中，并在室温下以 200 x g 离心 5 分钟。
   2. 除去上清液，填充PBS，并在室温下以200× g 离心5分钟。
   3. 除去上清液，加入1mL由蛋白水解和胶原溶解酶（例如AccuMax）组成的细胞分离溶液，并在37°C下孵育10分钟。
   4. 通过移液充分混合并在37°C孵育5分钟。确保细胞处于单个悬浮液中。
   5. 通过移液充分混合，填充PBS，并在室温下以300 x g 离心5分钟。
   6. 除去上清液并将细胞沉淀重悬于OCSC培养基中，随后接种在超低附着培养皿上，并在37°C的5%CO₂中维持。

2. HUEhT-1内皮细胞培养

1. HUEhT-1细胞的传代
   1. 从HUEhT-1培养皿中取出培养基并用PBS洗涤细胞。
   2. 加入 1 mL 的 0.025% 胰蛋白酶，并在室温下孵育 3 分钟。
   3. 加入 5 mL 内皮细胞生长培养基 2，将细胞收集在 15 mL 管中，并在室温下以 200 x g 离心 5 分钟。
   4. 除去上清液，将细胞沉淀重悬于HUEhT-1培养基中，并将细胞接种在胶原蛋白包被的培养皿上，然后在37°C的5%CO₂中维持。
   5. 每三天更换一次培养基。

3. 使用 HUEhT-1 细胞制备用于管形成测定的 NICO-1 共培养板

1. 组装NICO-1并涂有基于细胞外基质的水凝胶（基质胶基质）。
   1. 按照制造商的说明组装 NICO-1 的一侧并保持在冰上。
   2. 用 300 μL 冷 PBS 覆盖 NICO-1 表面，然后取出缓冲液。
   3. 加入 300 μL 冷却的基于细胞外基质的水凝胶，并在 37 °C 下孵育 60 分钟。
   4. 为了平衡，用100%乙醇浸入过滤器，然后用PBS洗涤13mm ICCP过滤器（0.6μm）1分钟。
   5. 组装 NICO-1，包括主体部件 A（右腔）和 B（左腔）以及 O 形圈和平衡过滤器。

4. 将 HUEhT-1 细胞和 CSC 接种到 NICO-1 系统上

1. 通过胰蛋白酶消化细胞单层并将细胞重悬于含有2%胎牛血清的内皮细胞生长培养基中来制备HUEhT-1细胞悬液。
2. 向每个基于细胞外基质的水凝胶包被孔中加入 1.2 mL 细胞悬液（1.5 x 10^{5 个} 细胞）。
3. 将 1.5 mL 培养五天的 OCSC 加入另一个孔中。
4. 在37°C的5%CO₂中孵育NICO-1;可以在显微镜下观察管的形成，并通过通过分支数测量基于细胞外基质的水凝胶上的网络形成。

结果

我们收集了晚期卵巢癌患者在手术或穿刺过程中获得的腹水，以便对球状体进行长期稳定的培养。在这里，我们介绍了卵巢CSC的长期球状体培养案例，称为CSC1和CSC2。两种细胞系具有相同的诊断和组织学特征。OCSC与内皮细胞相互作用的机制作用仍然是诱导OCSC周围内皮细胞新生血管所必需的。因此，我们旨在阐明转移部位CSC血管生态位发育的过程。我们使用体外共培养模型...

讨论

所提出的协议描述了如何在体外环境中模拟OCSC的肿瘤微环境。该方法的主要组成部分构成了使用NICO-1系统（一种间接Transwell共培养系统）获得的高度可重复的共培养模型。许多目前可用的共培养模型检查了直接细胞-细胞接触对共培养细胞群的影响¹²，13，¹⁴，^15，16，^17，<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025% Trypsin	Thermo	R001100
10 mL Pipet	Thermo	170356N
1250 µL Pipet tip	QSP	T112XLRS-Q
15 mL tube	Nunc	339650
200 µL Pipet tip	QSP	T110RS-NEW
2-Mercaptoethanol	Thermo (Gibco)	21985023
5 mL Pipet	Thermo	170366N
50 mL tube	Corning	430290
AccuMAX	Innovative Cell Technologies	AM105
BioCoatTM Collagen I 60mm Dish	Corning	356401
Centrifuge	KUBOTA	2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3471
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011
Ethanol	WAKO	057-00456
FGF-Basic	Thermo (Gibco)	PHG0021
Histodenz	SIGMA	D2158
HUEhT-1 cell	JCRB Cell Bank	JCRB1458
ICCP Filter 0.6 µm	Ginrei Lab.	2525-06
Insulin, human	SIGMA (Roche)	11376497001
Luminometer	PerkinElmer	ARVO MX-flad
Matrigel Matrix	Corning	356234
Microscope	Yokogawa	CQ-1
NICO-1	Ginrei Lab.	2501-02
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005290
P1000 Pipet	Gilson	F123602
P200 Pipet	Gilson	F123601
PBS	Thermo (Gibco)	14190-144
StemPro hESC SFM	Thermo (Gibco)	A1000701
Transfer Pipet	FALCON	357575
Y-27632	WAKO	253-00513