Valutazione delle proprietà angiogenetiche delle cellule staminali del cancro ovarico utilizzando il sistema di co-coltura tridimensionale, NICO-1

Riepilogo

Le cellule staminali del cancro ovarico (OCSC) sono responsabili dell'inizio del cancro, della recidiva, della resistenza terapeutica e delle metastasi. Si ritiene che la nicchia vascolare OCSC promuova l'autorinnovamento degli OCSC, portando alla chemioresistenza. Questo protocollo fornisce la base per stabilire un modello di nicchia vascolare OCSC riproducibile in vitro.

Abstract

Le cellule staminali tumorali (CSC) risiedono in una nicchia di supporto, costituendo un microambiente composto da cellule stromali adiacenti, vasi e matrice extracellulare. La capacità delle CSCs di partecipare allo sviluppo dell'endotelio costituisce una caratteristica importante che contribuisce direttamente alla comprensione generale dei meccanismi della tumorigenesi e delle metastasi tumorali. Lo scopo di questo lavoro è quello di stabilire una metodologia riproducibile per studiare la capacità di inizio del tumore delle cellule staminali tumorali ovariche (OCSC). Qui, abbiamo esaminato il meccanismo di neovascolarizzazione tra cellule endoteliali e OCSC insieme ai cambiamenti morfologici delle cellule endoteliali utilizzando il modello di co-coltura in vitro NICO-1. Questo protocollo consente di visualizzare la fase di neovascolarizzazione che circonda gli OCSC in modo temporizzato. La tecnica può fornire informazioni sulle proprietà angiogenetiche degli OCSC nelle metastasi tumorali.

Introduzione

Il cancro ovarico è l'ottavo tumore maligno più comune nelle donne in tutto il mondo, con circa 300.000 nuove diagnosi e circa 180.000 decessi all'anno¹. Alla diagnosi iniziale, il carcinoma ovarico si presenta spesso con sintomi gravi, con circa il 75% delle pazienti già allo stadio III-IV. Di conseguenza, il tasso di sopravvivenza a 5 anni è del <30% e il tasso di mortalità è il più alto tra i tumori ginecologici², con l'efficacia del trattamento per il cancro ovarico che dipende fortemente da fattori clinici come il successo della chirurgia di debulking, la resistenza alla chemioterapia e la recidiva dopo la terapia iniziale.

I tessuti del cancro ovarico sono organizzati gerarchicamente, con non tutti i componenti tumorali ugualmente in grado di generare discendenti. Le uniche cellule in grado di auto-rinnovarsi e produrre una popolazione eterogenea di cellule tumorali sono considerate cellule staminali tumorali (CSCs)³. L'auto-rinnovamento delle CSC e l'iniziazione del tumore sono accompagnati dalla promozione dell'angiogenesi per rimodellare il loro microambiente tumorale allo scopo di mantenere una nicchia di supporto. Tuttavia, i modelli precedenti non potevano essere utilizzati per le analisi in vitro a causa della limitata riproducibilità della coltivazione di CSCs derivate da campioni clinici a causa della rottura degli sferoidi dopo passaggi multipli. Più recentemente, sono stati sviluppati metodi sperimentali per coltivare CSC da pazienti per diverse applicazioni 4,5,6,7. In particolare, sfruttando la caratteristica delle CSCs di crescere formando sferoidi in piastre di attacco ultra-basse con mezzo privo di siero, le CSCs coltivate sono indotte ad esprimere un marcatore di superficie staminale che non è espresso in cellule tumorali normali con potenziale di differenziazione multilineage ^8,9.

Dati recenti hanno dimostrato che la persistenza di (O)CSCs ovariche dormienti visualizzate come disseminazione al peritoneo è associata alla loro rigenerazione come tumori ricorrenti¹⁰. La comprensione delle caratteristiche molecolari e biologiche degli OCSC può quindi consentire un efficace targeting ed eradicazione di queste cellule, con conseguente potenziale remissione del tumore. In particolare, poco si sa riguardo alle caratteristiche meccanicistiche cellulari e molecolari dei ruoli delle CSCs nell'angiogenesi¹¹. Pertanto, nel presente protocollo abbiamo utilizzato OCSC derivati dal paziente in un setting in vitro per studiare la proprietà angiogenica delle cellule endoteliali utilizzando il modello di co-coltura, che può imitare il microambiente tumorale delle CSCs e delle cellule endoteliali nel sito metastatico in ambito clinico. In definitiva, poiché la neovascolarizzazione costituisce un processo critico necessario per supportare la crescita tumorale e le metastasi, una migliore comprensione del suo meccanismo consentirà lo sviluppo di una nuova terapia mirata per gli OCSC nel sito metastatico.

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare la fase di neovascolarizzazione che circonda le CSC in un modo di tempo. Il vantaggio del protocollo include la possibilità di indagini completamente riproducibili utilizzando il sistema di co-coltura 3D, NICO-1, consentendo così l'osservazione degli effetti sui pazienti della capacità di iniziazione del tumore derivata da OCSC durante l'angiogenesi delle cellule endoteliali.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite secondo il protocollo approvato dal Comitato etico per il benessere umano. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto per l'uso della ricerca dei loro campioni e la raccolta e l'uso dei tessuti per questo studio sono stati approvati dal Comitato etico per la ricerca sul genoma umano, analisi genica dell'Università di Teikyo.

1. Isolamento e coltura di cellule staminali tumorali ovariche (OCSC) da pazienti con carcinoma ovarico e ascite in un armadio di biosicurezza di livello 2

1. Isolare le cellule staminali tumorali dall'ascite del cancro ovarico umano ottenuta tramite paracentesi. Raccogliere almeno 100-250 ml di ascite dai pazienti per assumere un numero sufficiente di cellule staminali tumorali. Inoltre, valutare i profili di espressione dei marcatori delle cellule staminali tumorali (cioè EpCAM, Calretinina, CD133, CD44, CD45, ALDH1 e Oct4) e dei marcatori del cancro ovarico (pAX-8, WT-1) mediante citometria a flusso.
   1. Centrifugare l'ascite del cancro ovarico umano a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente entro 24 ore dopo l'aspirazione dell'ascite.
   2. Rimuovere il surnatante e aggiungere 2 mL di terreno OCSC e 8 mL di soluzione salina tamponata Histodenz/fosfato al 30% (PBS, pH 7,4).
   3. Preparare il terreno OCSC: integratore StemPro hESC, DMEM⁄F-12 con L-glutammina (mezzo GlutaMAX), 25% BSA, 100 μM 2-mercaptoetanolo, 8 ng/mL FGF BASICO, 10 μM insulina e 20 μM Y-27632.
   4. Sovrapporre accuratamente 2 mL di terreno OCSC alla soluzione cellulare al punto 1.1.2 in una provetta da 15 mL e centrifugare a 450 x g per 20 minuti a temperatura ambiente in un rotore a benna oscillante senza frenare.
   5. Trasferire con cautela lo strato OCSC (indisturbato all'interfase) in un nuovo tubo da 15 mL mediante pipetta di trasferimento.
   6. Riempire con PBS fino a 15 ml. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante.
   7. Risospendere il pellet cellulare in terreno OCSC e seme su un piatto di coltura a bassissimo attacco; le colture devono essere mantenute a 37 °C in 5% di CO₂.
   8. Cambia il mezzo ogni tre giorni. Tenere attentamente il piatto di coltura per circa 1 minuto, scartare parte del surnatante e aggiungere il nuovo mezzo.
2. Passaggio dei CSC
   1. Raccogliere gli OCSC in una provetta da 15 ml e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Rimuovere il surnatante, riempire con PBS e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   3. Rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL della soluzione di distacco cellulare costituita da enzimi proteolitici e collagenolitici (ad es. AccuMax) e incubare a 37 °C per 10 minuti.
   4. Mescolare bene mediante pipettaggio e incubare a 37 °C per 5 minuti. Assicurarsi che le celle siano in un'unica sospensione.
   5. Mescolare bene mediante pipettaggio, riempire con PBS e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   6. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo OCSC per la successiva semina su piastre di coltura a bassissimo attacco e il mantenimento a 37 °C in CO 2 al 5%.

2. Coltura cellulare endoteliale HUEhT-1

1. Passaggio delle cellule HUEhT-1
   1. Rimuovere il terreno dal piatto di coltura HUEhT-1 e lavare le cellule con PBS.
   2. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,025% e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
   3. Aggiungere 5 ml di Endothelial Cell Growth Medium 2, raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   4. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in mezzo HUEhT-1 e seminare le cellule su piatti di coltura rivestiti di collagene seguiti dal mantenimento a 37 °C in CO 2 al 5%.
   5. Cambia il mezzo ogni tre giorni.

3. Preparazione della piastra di cocoltura NICO-1 per il saggio di formazione del tubo utilizzando cellule HUEhT-1

1. Assemblare NICO-1 e rivestirlo con l'idrogel a base di matrice extracellulare (Matrigel Matrix).
   1. Assemblare un lato di NICO-1 seguendo le istruzioni del produttore e conservare in ghiaccio.
   2. Coprire la superficie di NICO-1 con 300 μL di PBS freddo e quindi rimuovere il tampone.
   3. Aggiungere 300 μL di idrogel refrigerato a base di matrice extracellulare e incubare a 37 °C per 60 minuti.
   4. Per equilibrare, immergere il filtro con etanolo al 100%, quindi lavare un filtro ICCP da 13 mm (0,6 μm) con PBS per 1 minuto.
   5. Assemblare il NICO-1 includendo entrambe le parti principali del corpo A (camera destra) e B (camera sinistra) insieme all'O ring e al filtro equilibrato.

4. Semina di cellule HUEhT-1 e CSC sul sistema NICO-1

1. Preparare sospensioni cellulari HUEhT-1 tripsinizzando i monostrati cellulari e risospendendo le cellule nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali con siero fetale di vitello al 2%.
2. Aggiungere 1,2 ml di sospensione cellulare (1,5 x 10⁵ celle) a ciascun pozzetto rivestito di idrogel a base di matrice extracellulare.
3. Aggiungere 1,5 ml di OCSC coltivati per cinque giorni all'altro pozzetto.
4. Incubare NICO-1 a 37 °C in 5% di CO₂; La formazione del tubo può essere osservata al microscopio e la formazione della rete su idrogel a base di matrice extracellulare misurata per mezzo del numero di rami.

Risultati

Abbiamo raccolto fluidi asciti ottenuti da pazienti con carcinoma ovarico avanzato durante l'intervento chirurgico o la paracentesi allo scopo di eseguire una coltura stabile a lungo termine per gli sferoidi. Qui, presentiamo casi di una coltura sferoide a lungo termine di CSCs ovariche denominate CSC1 e CSC2. Entrambe le linee cellulari portano la stessa diagnosi e gli stessi profili istologici. I ruoli meccanicistici degli OCSC alla base dell'interazione con le cellule endoteliali neces...

Discussione

Il protocollo presentato descrive come imitare il microambiente tumorale degli OCSC in un ambiente in vitro. La componente principale del metodo è costituita dal modello di cocoltura altamente riproducibile ottenuto utilizzando il sistema NICO-1, un sistema di co-coltura Transwell indiretto. Molti dei modelli di cocoltura attualmente disponibili esaminano gli effetti del contatto diretto cellula-cellula sulle popolazioni cellulari di cocoltura 12,13,14,15,16,17,18.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025% Trypsin	Thermo	R001100
10 mL Pipet	Thermo	170356N
1250 µL Pipet tip	QSP	T112XLRS-Q
15 mL tube	Nunc	339650
200 µL Pipet tip	QSP	T110RS-NEW
2-Mercaptoethanol	Thermo (Gibco)	21985023
5 mL Pipet	Thermo	170366N
50 mL tube	Corning	430290
AccuMAX	Innovative Cell Technologies	AM105
BioCoatTM Collagen I 60mm Dish	Corning	356401
Centrifuge	KUBOTA	2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3471
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011
Ethanol	WAKO	057-00456
FGF-Basic	Thermo (Gibco)	PHG0021
Histodenz	SIGMA	D2158
HUEhT-1 cell	JCRB Cell Bank	JCRB1458
ICCP Filter 0.6 µm	Ginrei Lab.	2525-06
Insulin, human	SIGMA (Roche)	11376497001
Luminometer	PerkinElmer	ARVO MX-flad
Matrigel Matrix	Corning	356234
Microscope	Yokogawa	CQ-1
NICO-1	Ginrei Lab.	2501-02
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005290
P1000 Pipet	Gilson	F123602
P200 Pipet	Gilson	F123601
PBS	Thermo (Gibco)	14190-144
StemPro hESC SFM	Thermo (Gibco)	A1000701
Transfer Pipet	FALCON	357575
Y-27632	WAKO	253-00513