Оценка ангиогенетических свойств стволовых клеток рака яичников с использованием трехмерной системы кокультур, NICO-1

Резюме

Стволовые клетки рака яичников (OCSC) ответственны за начало рака, рецидив, терапевтическую резистентность и метастазирование. Считается, что сосудистая ниша OCSC способствует самообновлению OCSC, что приводит к хеморезистентности. Этот протокол обеспечивает основу для создания воспроизводимой модели сосудистой ниши OCSC in vitro.

Аннотация

Раковые стволовые клетки (CSC) находятся в поддерживающей нише, представляя собой микросреду, состоящую из соседних стромальных клеток, сосудов и внеклеточного матрикса. Способность ЦОК участвовать в развитии эндотелия представляет собой важную характеристику, которая непосредственно способствует общему пониманию механизмов опухолевого генеза и метастазирования опухоли. Целью данной работы является создание воспроизводимой методологии исследования опухолевой способности стволовых клеток рака яичников (OCSC). Здесь мы изучили механизм неоваскуляризации между эндотелиальными клетками и OCSC наряду с морфологическими изменениями эндотелиальных клеток с использованием модели совместной культуры in vitro NICO-1. Этот протокол позволяет визуализировать стадию неоваскуляризации, окружающую OCSC, с течением времени. Метод может дать представление об ангиогенетических свойствах OCSC в метастазировании опухоли.

Введение

Рак яичников является восьмым наиболее распространенным злокачественным новообразованием у женщин во всем мире, с примерно 300 000 новых диагнозов и, по оценкам, 180 000 смертей в год¹. При первоначальной диагностике рак яичников часто проявляется тяжелыми симптомами, причем около 75% пациенток уже находятся на стадии III-IV. Соответственно, 5-летняя выживаемость составляет <30%, а смертность является самой высокой среди гинекологических раковых заболеваний², причем эффективность лечения рака яичников сильно зависит от клинических факторов, таких как успешное выполнение операции по удалению, устойчивость к химиотерапии и рецидив после начальной терапии.

Ткани рака яичников иерархически организованы, причем не все опухолевые компоненты одинаково способны генерировать потомков. Считается, что единственные клетки, способные самообновляться и продуцировать гетерогенную популяцию опухолевых клеток, представляют собой раковые стволовые клетки (CSC)³. Самообновление CSC и инициация опухоли сопровождаются продвижением ангиогенеза для ремоделирования их опухолевого микроокружения с целью поддержания поддерживающей ниши. Однако предыдущие модели не могли быть использованы для анализа in vitro из-за ограниченной воспроизводимости культивирования CSC, полученных из клинических образцов, из-за нарушения сфероидов после многократного прохождения. Совсем недавно экспериментальные методы культивирования CSC у пациентов были разработаны для нескольких применений 4,5,6,7. В частности, используя характеристику CSC для роста путем формирования сфероидов в сверхнизких пластинах прикрепления со свободной от сыворотки средой, культивируемые CSC индуцируются к экспрессии маркера поверхности стволовых клеток, который не экспрессируется в нормальных опухолевых клетках с многолинейным потенциалом дифференцировки ^8,9.

Последние данные показали, что персистенция спящих яичников (O)CSC, визуализируемых как диссеминация в брюшине, связана с их регенерацией в виде рецидивирующих опухолей¹⁰. Таким образом, понимание молекулярных и биологических особенностей OCSC может позволить эффективно нацеливаться и эрадикации этих клеток, что приводит к потенциальной ремиссии опухоли. В частности, мало что известно о клеточных и молекулярно-механистических особенностях ролей ЦОНа в ангиогенезе¹¹. Поэтому в настоящем протоколе мы использовали OCSC, полученные от пациента, в условиях in vitro для исследования ангиогенного свойства эндотелиальных клеток с использованием модели ко-культуры, которая может имитировать микроокружение опухоли CSC и эндотелиальных клеток в метастатическом месте в клинических условиях. В конечном счете, поскольку неоваскуляризация представляет собой критический процесс, необходимый для поддержки роста опухоли и метастазирования, лучшее понимание ее механизма позволит разработать новую таргетную терапию для OCSC в метастатическом месте.

Здесь мы представляем протокол для визуализации шага неоваскуляризации, окружающего CSC, с течением времени. Преимущество протокола включает в себя возможность полностью воспроизводимых исследований с использованием 3D-системы кокультуры NICO-1, что позволяет наблюдать за воздействием на пациентов способности инициации опухоли, полученной из OCSC, во время эндотелиального клеточного ангиогенеза.

протокол

Все процедуры выполнялись в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по этике благосостояния человека. Все пациенты предоставили письменное информированное согласие на исследовательское использование их образцов, а сбор и использование тканей для этого исследования были одобрены Комитетом по этике исследований генома человека, генного анализа в Университете Тейкё.

1. Выделение и культивирование стволовых клеток рака яичников (OCSC) у пациентов с раком яичников и асцитом в кабинете биобезопасности уровня 2

1. Изолируйте раковые стволовые клетки из асцита рака яичников человека, полученного с помощью парацентеза. Соберите не менее 100-250 мл асцита у пациентов, чтобы взять достаточное количество раковых стволовых клеток. Кроме того, оцените профили экспрессии маркеров раковых стволовых клеток (т.е. EpCAM, Calretinin, CD133, CD44, CD45, ALDH1 и Oct4) и маркеров рака яичников (pAX-8, WT-1) с помощью проточной цитометрии.
   1. Центрифугируют асцит рака яичников человека при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре в течение 24 ч после аспирации асцита.
   2. Удалите надосадочный материал и добавьте 2 мл среды OCSC и 8 мл 30% раствора гистоденза/фосфатного буферного физиологического раствора (PBS, pH 7,4).
   3. Подготовка среды OCSC: добавка StemPro hESC, DMEM⁄F-12 с L-глютамином (среда GlutaMAX), 25% BSA, 100 мкМ 2-меркаптоэтанола, 8 нг/мл FGF BASIC, 10 мкМ инсулина и 20 мкМ Y-27632.
   4. Осторожно накладывайте 2 мл среды OCSC на раствор ячейки на стадии 1.1.2 в трубку 15 мл и центрифугу при 450 х г в течение 20 мин при комнатной температуре в роторе с качающимся ковшом без торможения.
   5. Аккуратно перенесите слой OCSC (не нарушенный на межфазе) на новую трубу объемом 15 мл путем перекачки пипетки.
   6. Наполните PBS до 15 мл. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и удаляют супернатант.
   7. Повторное суспендирование клеточной гранулы в среде OCSC и семена на чашке для культивирования со сверхнизким прикреплением; культуры следует поддерживать при температуре 37 °C в 5% CO₂.
   8. Меняйте среду каждые три дня. Осторожно выдержите блюдо для культуры около 1 минуты, выбросьте часть супернатанта и добавьте новую среду.
2. Прохождение ЦОНов
   1. Собирают OCSC в пробирке 15 мл и центрифуге при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   2. Удалите супернатант, заполните PBS и центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   3. Удалить надосадочный агент, добавить 1 мл раствора для отсоединения клеток, состоящего из протеолитических и коллагенолитических ферментов (например, AccuMax), и инкубировать при 37 °C в течение 10 мин.
   4. Хорошо перемешать путем пипетки и инкубировать при 37 °C в течение 5 мин. Убедитесь, что клетки находятся в одной суспензии.
   5. Хорошо перемешать путем пипетки, залить ПБС и центрифугировать при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   6. Удалите супернатант и повторно суспендируйте ячейку гранулы в среде OCSC для последующего посева на чашках для культивирования со сверхнизким прикреплением и поддержания при 37 °C в 5% CO₂.

2. Культура эндотелиальных клеток HUEhT-1

1. Прохождение ячеек HUEhT-1
   1. Удалите среду из чашки для культивирования HUEhT-1 и вымойте клетки PBS.
   2. Добавить 1 мл 0,025% трипсина и инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре.
   3. Добавьте 5 мл среды роста эндотелиальных клеток 2, соберите клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   4. Удалите супернатант, повторно суспендируйте клеточную гранулу в среде HUEhT-1 и посейте клетки на покрытые коллагеном культуральные чашки с последующим поддержанием при 37 °C в 5% CO₂.
   5. Меняйте среду каждые три дня.

3. Подготовка кокультурной пластины NICO-1 для трубообразующего анализа с использованием клеток HUEhT-1

1. Собирают NICO-1 и покрывают внеклеточным матриксом на основе гидрогеля (Matrigel Matrix).
   1. Соберите одну сторону NICO-1 в соответствии с инструкциями производителя и держите на льду.
   2. Накройте поверхность NICO-1 300 мкл холодного PBS, а затем удалите буфер.
   3. Добавьте 300 мкл охлажденного гидрогеля на основе внеклеточного матрикса и инкубируйте при 37 °C в течение 60 мин.
   4. Чтобы уравновесить, погрузите фильтр со 100% этанолом, затем промывайте 13-мм ICCP-фильтр (0,6 мкм) PBS в течение 1 мин.
   5. Соберите NICO-1, включающий обе основные части корпуса A (правая камера) и B (левая камера), а также кольцо O и уравновешенный фильтр.

4. Посев клеток HUEhT-1 и CSC в систему NICO-1

1. Приготовьте клеточные суспензии HUEhT-1 путем трипсинизации клеточных монослоев и повторного использования клеток в среде роста эндотелиальных клеток с 2% сывороткой для телят плода.
2. Добавьте 1,2 мл клеточной суспензии (1,5 х 10⁵ клеток) к каждому хорошо покрытому гидрогелевым покрытием на основе внеклеточного матрикса.
3. Добавьте 1,5 мл OCSC, культивируемых в течение пяти дней, в другую скважину.
4. Инкубировать НИКО-1 при 37 °С в 5%_СО2; Образование трубки можно наблюдать под микроскопом, а формирование сети на гидрогеле на основе внеклеточного матрикса измеряется с помощью количества ветвей.

Результаты

Мы собрали асцитовые жидкости, полученные от пациенток с прогрессирующим раком яичников во время операции или парацентеза с целью выполнения долгосрочной стабильной культуры для сфероидов. Здесь мы представляем случаи долгосрочной сфероидной культуры Яичников, наз...

Обсуждение

Представленный протокол описывает, как имитировать микроокружение опухоли OCSC в условиях in vitro. Первичный компонент метода представляет собой высоковоспроизводимую модель кокультуры, полученную с использованием системы NICO-1, косвенной системы кокультур Transwell. Многие из доступных в нас...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025% Trypsin	Thermo	R001100
10 mL Pipet	Thermo	170356N
1250 µL Pipet tip	QSP	T112XLRS-Q
15 mL tube	Nunc	339650
200 µL Pipet tip	QSP	T110RS-NEW
2-Mercaptoethanol	Thermo (Gibco)	21985023
5 mL Pipet	Thermo	170366N
50 mL tube	Corning	430290
AccuMAX	Innovative Cell Technologies	AM105
BioCoatTM Collagen I 60mm Dish	Corning	356401
Centrifuge	KUBOTA	2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3471
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011
Ethanol	WAKO	057-00456
FGF-Basic	Thermo (Gibco)	PHG0021
Histodenz	SIGMA	D2158
HUEhT-1 cell	JCRB Cell Bank	JCRB1458
ICCP Filter 0.6 µm	Ginrei Lab.	2525-06
Insulin, human	SIGMA (Roche)	11376497001
Luminometer	PerkinElmer	ARVO MX-flad
Matrigel Matrix	Corning	356234
Microscope	Yokogawa	CQ-1
NICO-1	Ginrei Lab.	2501-02
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005290
P1000 Pipet	Gilson	F123602
P200 Pipet	Gilson	F123601
PBS	Thermo (Gibco)	14190-144
StemPro hESC SFM	Thermo (Gibco)	A1000701
Transfer Pipet	FALCON	357575
Y-27632	WAKO	253-00513