Evaluación de las propiedades angiogenéticas de las células madre similares al cáncer de ovario utilizando el sistema de cocultivo tridimensional, NICO-1

Resumen

Las células madre del cáncer de ovario (OCSC) son responsables de la iniciación, recurrencia, resistencia terapéutica y metástasis del cáncer. Se considera que el nicho vascular OCSC promueve la autorrenovación de las OCSC, lo que lleva a la quimiorresistencia. Este protocolo proporciona la base para establecer un modelo de nicho vascular OCSC reproducible in vitro.

Resumen

Las células madre cancerosas (CSC) residen en un nicho de apoyo, constituyendo un microambiente compuesto por células estromales adyacentes, vasos y matriz extracelular. La capacidad de las CSC para participar en el desarrollo del endotelio constituye una característica importante que contribuye directamente a la comprensión general de los mecanismos de tumorigénesis y metástasis tumorales. El propósito de este trabajo es establecer una metodología reproducible para investigar la capacidad de iniciación tumoral de las células madre del cáncer de ovario (OCSC). En este documento, examinamos el mecanismo de neovascularización entre las células endoteliales y las OCSC junto con los cambios morfológicos de las células endoteliales utilizando el modelo de cocultivo in vitro NICO-1. Este protocolo permite visualizar el paso de neovascularización que rodea a los OCSC en un curso de tiempo. La técnica puede proporcionar información sobre las propiedades angiogenéticas de las OCSC en la metástasis tumoral.

Introducción

El cáncer de ovario es la octava neoplasia maligna más común en mujeres en todo el mundo, con aproximadamente 300.000 nuevos diagnósticos y un estimado de 180.000 muertes anuales¹. En el momento del diagnóstico inicial, el cáncer de ovario a menudo se presenta con síntomas graves, con aproximadamente el 75% de las pacientes ya en estadio III-IV. En consecuencia, la tasa de supervivencia a 5 años es del <30% y la tasa de mortalidad es la más alta entre los cánceres ginecológicos², siendo la eficiencia del tratamiento para el cáncer de ovario altamente dependiente de factores clínicos como la realización exitosa de la cirugía citorreductora, la resistencia a la quimioterapia y la recurrencia después de la terapia inicial.

Los tejidos del cáncer de ovario están organizados jerárquicamente, y no todos los componentes tumorales son igualmente capaces de generar descendientes. Se considera que las únicas células capaces de autorrenovarse y producir una población heterogénea de células tumorales representan células madre cancerosas (CSCs)³. La autorrenovación de CSC y el inicio del tumor se acompañan de la promoción de la angiogénesis para remodelar su microambiente tumoral con el fin de mantener un nicho de apoyo. Sin embargo, los modelos anteriores no pudieron utilizarse para análisis in vitro debido a la limitada reproducibilidad del cultivo de CSC derivadas de muestras clínicas debido a la interrupción de los esferoides después de múltiples pasantías. Más recientemente, se han desarrollado métodos experimentales para cultivar CSCs de pacientes para varias aplicaciones 4,5,6,7. En particular, al explotar la característica de las CSC para crecer formando esferoides en placas de unión ultra bajas con medio libre de suero, las CSC cultivadas son inducidas a expresar un marcador de superficie de células madre que no se expresa en células tumorales normales con potencial de diferenciación multilinaje ^8,9.

Datos recientes han demostrado que la persistencia de (O)CSCs ováricas latentes visualizadas como diseminación en el peritoneo está asociada a su regeneración como tumores recurrentes¹⁰. Por lo tanto, comprender las características moleculares y biológicas de las OCSC puede permitir una orientación y erradicación efectivas de estas células, lo que resulta en una posible remisión tumoral. En particular, se sabe poco sobre las características mecanicistas celulares y moleculares de los roles de las CSC en la angiogénesis¹¹. Por lo tanto, en el presente protocolo utilizamos OCSC derivadas de pacientes en un entorno in vitro para investigar la propiedad angiogénica de las células endoteliales utilizando el modelo de cocultivo, que puede imitar el microambiente tumoral de las CSC y las células endoteliales en el sitio metastásico en el entorno clínico. En última instancia, como la neovascularización constituye un proceso crítico necesario para apoyar el crecimiento tumoral y la metástasis, una mejor comprensión de su mecanismo permitirá el desarrollo de una nueva terapia dirigida para OCSC en el sitio metastásico.

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar el paso de neovascularización que rodea a las CSC de una manera de curso temporal. La ventaja del protocolo incluye permitir investigaciones totalmente reproducibles utilizando el sistema de cocultivo 3D, NICO-1, lo que permite la observación de los efectos en pacientes de la capacidad de iniciación tumoral derivada de OCSC durante la angiogénesis de células endoteliales.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron bajo el protocolo aprobado por el Comité de Ética para el bienestar humano. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso de investigación de sus muestras, y la recolección y el uso de tejidos para este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación del Genoma Humano, Análisis de Genes de la Universidad de Teikyo.

1. Aislamiento y cultivo de células madre de cáncer de ovario (OCSC) de pacientes con cáncer de ovario y ascitis en un gabinete de bioseguridad de nivel 2

1. Aislar las células madre del cáncer de ascitis del cáncer de ovario humano obtenidas a través de la paracentesis. Recolectar al menos 100-250 ml de ascitis de los pacientes para tomar suficiente cantidad de células madre cancerosas. Además, evaluar los perfiles de expresión de los marcadores de células madre cancerosas (es decir, EpCAM, Calretinina, CD133, CD44, CD45, ALDH1 y Oct4) y marcadores de cáncer de ovario (pAX-8, WT-1) mediante citometría de flujo.
   1. Centrifugar la ascitis del cáncer de ovario humano a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente dentro de las 24 h después de la aspiración de ascitis.
   2. Retire el sobrenadante y agregue 2 ml de medio OCSC y 8 ml de solución salina tamponada con Histodenz/fosfato al 30% (PBS, pH 7.4).
   3. Prepare el medio OCSC: suplemento StemPro hESC, DMEM⁄F-12 con L-glutamina (medio GlutaMAX), 25% BSA, 100 μM 2-mercaptoetanol, 8 ng/mL FGF BASIC, 10 μM insulina y 20 μM Y-27632.
   4. Superar cuidadosamente 2 ml de medio OCSC a la solución celular en el paso 1.1.2 en un tubo de 15 ml y centrifugar a 450 x g durante 20 min a temperatura ambiente en un rotor de cangilón oscilante sin frenar.
   5. Transfiera cuidadosamente la capa OCSC (sin perturbaciones en la interfase) a un nuevo tubo de 15 ml mediante pipeta de transferencia.
   6. Llene con PBS hasta 15 ml. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante.
   7. Resuspender el pellet celular en medio OCSC y sembrar en una placa de cultivo de fijación ultrabaja; los cultivos deben mantenerse a 37 °C en un 5% de_CO2.
   8. Cambie el medio cada tres días. Mantenga cuidadosamente el plato de cultivo durante aproximadamente 1 minuto, deseche parte del sobrenadante y agregue el nuevo medio.
2. Aprobación de CSC
   1. Recoger OCSC en un tubo de 15 ml y centrifugar a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   2. Retire el sobrenadante, llénelo con PBS y centrifugar a 200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   3. Retirar el sobrenadante, añadir 1 ml de la solución de desprendimiento celular consistente en enzimas proteolíticas y colagenolíticas (p. ej., AccuMax) e incubar a 37 °C durante 10 min.
   4. Mezclar bien pipeteando e incubar a 37 °C durante 5 min. Asegúrese de que las celdas estén en una sola suspensión.
   5. Mezclar bien pipeteando, llenar con PBS y centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   6. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en medio OCSC para su posterior siembra en placas de cultivo de fijación ultra baja y mantenimiento a 37 °C en_CO2 al 5%.

2. Cultivo de células endoteliales HUEhT-1

1. Paso de células HUEhT-1
   1. Retire el medio de la placa de cultivo de HUEhT-1 y lave las células con PBS.
   2. Añadir 1 mL de tripsina al 0,025% e incubar durante 3 min a temperatura ambiente.
   3. Agregue 5 ml de medio de crecimiento celular endotelial 2, recoja las células en un tubo de 15 ml y centrifugar a 200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   4. Retire el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en medio HUEhT-1 y siembre las células en placas de cultivo recubiertas de colágeno seguido de mantenimiento a 37 °C en 5% de_CO2.
   5. Cambie el medio cada tres días.

3. Preparación de la placa de cocultivo de NICO-1 para el ensayo de formación de tubos utilizando células HUEhT-1

1. Ensamblar NICO-1 y recubrimiento con el hidrogel basado en matriz extracelular (Matrigel Matrix).
   1. Montar una cara del NICO-1 siguiendo las instrucciones del fabricante y mantener en hielo.
   2. Cubra la superficie de NICO-1 con 300 μL de PBS frío y luego retire el tampón.
   3. Añadir 300 μL de hidrogel refrigerado a base de matriz extracelular e incubar a 37 °C durante 60 min.
   4. Para equilibrar, sumerja el filtro con etanol al 100%, luego lave un filtro ICCP de 13 mm (0.6 μm) con PBS durante 1 min.
   5. Ensamble el NICO-1 incluyendo las partes principales del cuerpo A (cámara derecha) y B (cámara izquierda) junto con el anillo O y el filtro equilibrado.

4. Siembra de células HUEhT-1 y CSC en el sistema NICO-1

1. Preparar suspensiones de células HUEhT-1 tripsinizando las monocapas celulares y resuspendiendo las células en medio de crecimiento celular endotelial con suero fetal de ternera al 2%.
2. Agregue 1.2 ml de la suspensión celular (1.5 x 10⁵ células) a cada pocillo recubierto de hidrogel basado en matriz extracelular.
3. Agregue 1.5 ml de OCSC cultivadas durante cinco días al otro pocillo.
4. Incubar NICO-1 a 37 °C en_CO2 al 5%; La formación de tubos se puede observar bajo el microscopio y la formación de redes en hidrogel basado en matriz extracelular medido por medio del número de ramas.

Resultados

Se recogieron fluidos de ascitis obtenidos de pacientes con cáncer de ovario avanzado durante cirugía o paracentesis con el fin de realizar un cultivo estable a largo plazo para esferoides. Aquí, presentamos casos de un cultivo de esferoides a largo plazo de CSCs ováricas denominadas CSC1 y CSC2. Ambas líneas celulares llevan el mismo diagnóstico y perfiles histológicos. Las funciones mecanicistas de los OCSC que subyacen a la interacción con las células endoteliales necesarias p...

Discusión

El protocolo presentado describe cómo imitar el microambiente tumoral de las OCSC en un entorno in vitro. El componente principal del método constituye el modelo de cocultivo altamente reproducible obtenido utilizando el sistema NICO-1, un sistema de cocultivo Transwell indirecto. Muchos de los modelos de cocultivo actualmente disponibles examinan los efectos del contacto directo célula-célula en poblaciones celulares cocultivadas 12,13,14,15,16,17,18.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025% Trypsin	Thermo	R001100
10 mL Pipet	Thermo	170356N
1250 µL Pipet tip	QSP	T112XLRS-Q
15 mL tube	Nunc	339650
200 µL Pipet tip	QSP	T110RS-NEW
2-Mercaptoethanol	Thermo (Gibco)	21985023
5 mL Pipet	Thermo	170366N
50 mL tube	Corning	430290
AccuMAX	Innovative Cell Technologies	AM105
BioCoatTM Collagen I 60mm Dish	Corning	356401
Centrifuge	KUBOTA	2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3471
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011
Ethanol	WAKO	057-00456
FGF-Basic	Thermo (Gibco)	PHG0021
Histodenz	SIGMA	D2158
HUEhT-1 cell	JCRB Cell Bank	JCRB1458
ICCP Filter 0.6 µm	Ginrei Lab.	2525-06
Insulin, human	SIGMA (Roche)	11376497001
Luminometer	PerkinElmer	ARVO MX-flad
Matrigel Matrix	Corning	356234
Microscope	Yokogawa	CQ-1
NICO-1	Ginrei Lab.	2501-02
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005290
P1000 Pipet	Gilson	F123602
P200 Pipet	Gilson	F123601
PBS	Thermo (Gibco)	14190-144
StemPro hESC SFM	Thermo (Gibco)	A1000701
Transfer Pipet	FALCON	357575
Y-27632	WAKO	253-00513