Évaluation des propriétés angiogénétiques des cellules souches du cancer de l’ovaire à l’aide du système de co-culture tridimensionnel, NICO-1

Résumé

Les cellules souches du cancer de l’ovaire (OCSC) sont responsables de l’initiation du cancer, de la récidive, de la résistance thérapeutique et des métastases. La niche vasculaire OCSC est considérée comme favorisant l’auto-renouvellement des OCSC, conduisant à la chimiorésistance. Ce protocole fournit la base pour établir un modèle reproductible de niche vasculaire OCSC in vitro.

Résumé

Les cellules souches cancéreuses (CSC) résident dans une niche de soutien, constituant un microenvironnement composé de cellules stromales adjacentes, de vaisseaux et de matrice extracellulaire. La capacité des CSC à participer au développement de l’endothélium constitue une caractéristique importante qui contribue directement à la compréhension générale des mécanismes de tumorigenèse et de métastases tumorales. Le but de ce travail est d’établir une méthodologie reproductible pour étudier la capacité d’initiation tumorale des cellules souches du cancer de l’ovaire (OCSC). Ici, nous avons examiné le mécanisme de néovascularisation entre les cellules endothéliales et les OCSC ainsi que les changements morphologiques des cellules endothéliales en utilisant le modèle de co-culture in vitro NICO-1. Ce protocole permet de visualiser l’étape de néovascularisation entourant les OCSC de manière chronologique. La technique peut fournir un aperçu des propriétés angiogénétiques des OCSC dans les métastases tumorales.

Introduction

Le cancer de l’ovaire est la huitième tumeur maligne la plus fréquente chez les femmes dans le monde, avec environ 300 000 nouveaux diagnostics et environ 180 000 décès par an¹. Au diagnostic initial, le cancer de l’ovaire présente souvent des symptômes graves, environ 75% des patientes étant déjà au stade III-IV. En conséquence, le taux de survie à 5 ans est de <30% et le taux de mortalité est le plus élevé parmi les cancers gynécologiques², l’efficacité du traitement du cancer de l’ovaire étant fortement dépendante de facteurs cliniques tels que la réussite de la chirurgie de réduction tumorale, la résistance à la chimiothérapie et la récidive après le traitement initial.

Les tissus cancéreux de l’ovaire sont organisés hiérarchiquement, tous les composants tumoraux n’étant pas également capables de générer des descendants. Les seules cellules capables de s’auto-renouveler et de produire une population hétérogène de cellules tumorales sont considérées comme représentant des cellules souches cancéreuses (CSC)³. L’auto-renouvellement du SCC et l’initiation de la tumeur s’accompagnent de la promotion de l’angiogenèse pour remodeler leur microenvironnement tumoral dans le but de maintenir un créneau de soutien. Cependant, les modèles précédents ne pouvaient pas être utilisés pour les analyses in vitro en raison de la reproductibilité limitée de la culture de CSC dérivés d’échantillons cliniques en raison de la perturbation des sphéroïdes après plusieurs passages. Plus récemment, des méthodes expérimentales de culture de CSC à partir de patients ont été développées pour plusieurs applications 4,5,6,7. En particulier, en exploitant la caractéristique des CSC de croître en formant des sphéroïdes dans des plaques de fixation ultra-basses avec un milieu sans sérum, les CSC cultivés sont amenés à exprimer un marqueur de surface des cellules souches qui n’est pas exprimé dans les cellules tumorales normales avec un potentiel de différenciation multilignée ^8,9.

Des données récentes ont montré que la persistance des (O)CSC ovariens dormants visualisés comme une dissémination au péritoine est associée à leur régénération sous forme de tumeurs récurrentes¹⁰. La compréhension des caractéristiques moléculaires et biologiques des OCSC peut donc permettre un ciblage et une éradication efficaces de ces cellules, entraînant une rémission potentielle de la tumeur. En particulier, on sait peu de choses sur les caractéristiques mécanistes cellulaires et moléculaires des rôles des CSC dans l’angiogenèse¹¹. Par conséquent, dans le présent protocole, nous avons utilisé des OCSC dérivés de patients dans un cadre in vitro pour étudier la propriété angiogénique des cellules endothéliales en utilisant le modèle de co-culture, qui peut imiter le microenvironnement tumoral des CSC et des cellules endothéliales au site métastatique en milieu clinique. En fin de compte, comme la néovascularisation constitue un processus critique nécessaire pour soutenir la croissance tumorale et les métastases, une meilleure compréhension de son mécanisme permettra le développement d’une nouvelle thérapie de ciblage pour les OCSC au site métastatique.

Ici, nous présentons un protocole pour visualiser l’étape de néovascularisation entourant les CSC de manière chronologique. L’avantage du protocole est de permettre des investigations entièrement reproductibles à l’aide du système de co-culture 3D, NICO-1, permettant ainsi d’observer les effets sur les patients de la capacité d’initiation tumorale dérivée de l’OCSC au cours de l’angiogenèse des cellules endothéliales.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au protocole approuvé par le Comité d’éthique pour le bien-être humain. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé écrit pour l’utilisation de leurs échantillons à des fins de recherche, et la collecte et l’utilisation de tissus pour cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche sur le génome humain de l’Université Teikyo.

1. Isolement et culture de cellules souches du cancer de l’ovaire (OCSC) provenant de patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire et d’ascite dans une enceinte de biosécurité de niveau 2

1. Isoler les cellules souches cancéreuses de l’ascite du cancer de l’ovaire humain obtenu par paracentèse. Prélever au moins 100 à 250 mL d’ascite chez les patients pour prélever suffisamment de cellules souches cancéreuses. De plus, évaluer les profils d’expression des marqueurs de cellules souches cancéreuses (c.-à-d. EpCAM, Calrétinin, CD133, CD44, CD45, ALDH1 et Oct4) et des marqueurs du cancer de l’ovaire (pAX-8, WT-1) par cytométrie de flux.
   1. Centrifuger l’ascite du cancer de l’ovaire humain à 300 x g pendant 10 min à température ambiante dans les 24 heures suivant l’aspiration de l’ascite.
   2. Retirer le surnageant et ajouter 2 mL de milieu OCSC et 8 mL de solution saline tamponnée Histodenz/phosphate à 30 % (PBS, pH 7,4).
   3. Préparer le milieu OCSC : supplément de CSEh StemPro, DMEM⁄F-12 avec de la L-glutamine (milieu GlutaMAX), 25 % de BSA, 100 μM de 2-mercaptoéthanol, 8 ng/mL DE FGF BASIC, 10 μM d’insuline et 20 μM Y-27632.
   4. Superposer délicatement 2 mL de milieu OCSC à la solution cellulaire à l’étape 1.1.2 dans un tube de 15 mL et centrifuger à 450 x g pendant 20 min à température ambiante dans un rotor à godet oscillant sans freinage.
   5. Transférer délicatement la couche OCSC (non perturbée à l’interphase) dans un nouveau tube de 15 mL à l’aide d’une pipette de transfert.
   6. Remplir avec du PBS jusqu’à 15 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant.
   7. Resuspendre la pastille cellulaire dans un milieu OCSC et semer sur une capsule de culture à très faible attache; les cultures doivent être maintenues à 37 °C dans 5 % de CO₂.
   8. Changez le support tous les trois jours. Laissez soigneusement reposer le plat de culture pendant environ 1 minute, jetez une partie du surnageant et ajoutez le nouveau milieu.
2. Adoption des CSC
   1. Recueillir les OCSC dans un tube de 15 mL et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante.
   2. Retirer le surnageant, remplir de PBS et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante.
   3. Retirer le surnageant, ajouter 1 mL de la solution de décollement cellulaire constituée d’enzymes protéolytiques et collagénolytiques (p. ex. AccuMax) et incuber à 37 °C pendant 10 min.
   4. Bien mélanger par pipetage et incuber à 37 °C pendant 5 min. Assurez-vous que les cellules sont dans une seule suspension.
   5. Bien mélanger par pipetage, remplir de PBS et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
   6. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu OCSC pour l’ensemencement ultérieur sur des boîtes de culture à très faible fixation et le maintien à 37 °C dans 5 % de CO₂.

2. Culture de cellules endothéliales HUEhT-1

1. Passage des cellules HUEhT-1
   1. Retirer le milieu de la boîte de culture HUEhT-1 et laver les cellules avec du PBS.
   2. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,025% et incuber pendant 3 min à température ambiante.
   3. Ajouter 5 mL de milieu de croissance cellulaire endothéliale 2, recueillir les cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger à 200 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
   4. Retirer le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu HUEhT-1 et ensemencer les cellules sur des boîtes de culture enrobées de collagène, puis les maintenir à 37 °C dans 5 % de CO₂.
   5. Changez le support tous les trois jours.

3. Préparation de la plaque de coculture NICO-1 pour le test de formation de tubes à l’aide de cellules HUEhT-1

1. Assembler NICO-1 et l’enrober avec l’hydrogel à base de matrice extracellulaire (Matrigel Matrix).
   1. Assemblez un côté du NICO-1 en suivant les instructions du fabricant et conservez-le sur la glace.
   2. Couvrir la surface de NICO-1 avec 300 μL de PBS froid, puis retirer le tampon.
   3. Ajouter 300 μL d’hydrogel refroidi à base de matrice extracellulaire et incuber à 37 °C pendant 60 min.
   4. Pour équilibrer, immerger le filtre avec de l’éthanol à 100%, puis laver un filtre ICCP de 13 mm (0,6 μm) avec du PBS pendant 1 min.
   5. Assemblez le NICO-1, y compris les deux parties principales du corps A (chambre droite) et B (chambre gauche) ainsi que le joint torique et le filtre équilibré.

4. Ensemencement des cellules HUEhT-1 et des CSC sur le système NICO-1

1. Préparer les suspensions cellulaires HUEhT-1 en trypsinisant les monocouches cellulaires et en remettant les cellules en suspension dans un milieu de croissance cellulaire endothéliale avec du sérum de veau fœtal à 2%.
2. Ajouter 1,2 mL de suspension cellulaire (1,5 x 10⁵ cellules) à chaque puits recouvert d’hydrogel à base de matrice extracellulaire.
3. Ajouter 1,5 mL de CSCO cultivés pendant cinq jours à l’autre puits.
4. Incuber NICO-1 à 37 °C dans 5% CO₂; La formation de tubes peut être observée au microscope et la formation de réseaux sur un hydrogel à base de matrice extracellulaire mesurée au moyen du nombre de branches.

Résultats

Nous avons recueilli des liquides d’ascite obtenus auprès de patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire avancé lors d’une intervention chirurgicale ou d’une paracentèse dans le but d’effectuer une culture stable à long terme pour les sphéroïdes. Ici, nous présentons des cas d’une culture sphéroïde à long terme de CSC ovariens appelés CSC1 et CSC2. Les deux lignées cellulaires portent le même diagnostic et les mêmes profils histologiques. Les rôles mécanistes...

Discussion

Le protocole présenté décrit comment imiter le microenvironnement tumoral des OCSC dans un contexte in vitro. La composante principale de la méthode constitue le modèle de coculture hautement reproductible obtenu à l’aide du système NICO-1, un système de co-culture indirect Transwell. Bon nombre des modèles de coculture actuellement disponibles examinent les effets du contact direct cellule-cellule sur les populations cellulaires en coculture 12,13,14,15,16,17,18.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025% Trypsin	Thermo	R001100
10 mL Pipet	Thermo	170356N
1250 µL Pipet tip	QSP	T112XLRS-Q
15 mL tube	Nunc	339650
200 µL Pipet tip	QSP	T110RS-NEW
2-Mercaptoethanol	Thermo (Gibco)	21985023
5 mL Pipet	Thermo	170366N
50 mL tube	Corning	430290
AccuMAX	Innovative Cell Technologies	AM105
BioCoatTM Collagen I 60mm Dish	Corning	356401
Centrifuge	KUBOTA	2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3471
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011
Ethanol	WAKO	057-00456
FGF-Basic	Thermo (Gibco)	PHG0021
Histodenz	SIGMA	D2158
HUEhT-1 cell	JCRB Cell Bank	JCRB1458
ICCP Filter 0.6 µm	Ginrei Lab.	2525-06
Insulin, human	SIGMA (Roche)	11376497001
Luminometer	PerkinElmer	ARVO MX-flad
Matrigel Matrix	Corning	356234
Microscope	Yokogawa	CQ-1
NICO-1	Ginrei Lab.	2501-02
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005290
P1000 Pipet	Gilson	F123602
P200 Pipet	Gilson	F123601
PBS	Thermo (Gibco)	14190-144
StemPro hESC SFM	Thermo (Gibco)	A1000701
Transfer Pipet	FALCON	357575
Y-27632	WAKO	253-00513