הערכת התכונות האנגיוגנטיות של תאים דמויי גזע של סרטן השחלות באמצעות מערכת תרבית קו-תרבית תלת-ממדית, NICO-1

Summary

תאי גזע של סרטן השחלות (OCSC) אחראים על התחלת סרטן, הישנות, עמידות טיפולית וגרורות. נישת כלי הדם OCSC נחשבת לקידום התחדשות עצמית של OCSCs, מה שמוביל לכימורסטיות. פרוטוקול זה מספק את הבסיס להקמת מודל נישה כלי דם OCSC הניתן לשחזור במבחנה.

Abstract

תאי גזע סרטניים (CSCs) שוכנים בנישה תומכת, המהווה מיקרו-סביבה המורכבת מתאים סטרומליים סמוכים, כלי דם ומטריצה חוץ-תאית. היכולת של CSCs להשתתף בפיתוח אנדותל מהווה מאפיין חשוב התורם ישירות להבנה הכללית של מנגנוני הגידול וגרורות הגידול. מטרת עבודה זו היא לבסס מתודולוגיה הניתנת לשחזור כדי לחקור את יכולת ייזום הגידול של תאי גזע סרטניים בשחלות (OCSCs). כאן בחנו את מנגנון הניאו-וסקולריזציה בין תאי אנדותל ל-OCSCs יחד עם השינויים המורפולוגיים של תאי אנדותל באמצעות מודל התרבית במבחנה NICO-1. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של שלב הניאו-וסקולריזציה המקיף את ה-OCSCs באופן של קורס זמן. הטכניקה יכולה לספק תובנה לגבי התכונות האנגיוגנטיות של OCSCs בגרורות סרטניות.

Introduction

סרטן השחלות הוא הממאירות השמינית בשכיחותה בקרב נשים ברחבי העולם, עם כ-300,000 אבחנות חדשות וכ-180,000 מקרי מוות בשנה¹. באבחון הראשוני, סרטן השחלות מופיע לעתים קרובות עם תסמינים חמורים, כאשר כ -75% מהחולים כבר בשלב III-IV. בהתאם לכך, שיעור ההישרדות ל-5 שנים הוא <30% ושיעור התמותה הוא הגבוה ביותר בקרב סוגי סרטן גינקולוגיים², כאשר יעילות הטיפול בסרטן השחלות תלויה מאוד בגורמים קליניים כגון ההישג המוצלח של ניתוח הפחתה, עמידות לכימותרפיה והישנות לאחר הטיפול הראשוני.

רקמות סרטן השחלות מאורגנות באופן היררכי, כאשר לא כל מרכיבי הגידול מסוגלים באותה מידה לייצר צאצאים. התאים היחידים המסוגלים לחדש את עצמם ולייצר אוכלוסיית תאי גידול הטרוגנית נחשבים כמייצגים תאי גזע סרטניים (CSCs)³. התחדשות עצמית של CSC וייזום גידולים מלווים בקידום אנגיוגנזה לשיפוץ המיקרו-סביבה של הגידול שלהם לצורך שמירה על נישה תומכת. עם זאת, לא ניתן היה להשתמש במודלים קודמים לניתוחים חוץ-גופיים בגלל יכולת השחזור המוגבלת של גידול CSCs שמקורם בדגימות קליניות עקב שיבוש של ספרואידים לאחר מעבר מרובה. לאחרונה, פותחו שיטות ניסיוניות לטיפוח CSCs מחולים עבור מספר יישומים 4,5,6,7. בפרט, על ידי ניצול המאפיין של CSCs לגדול על ידי יצירת ספרואידים בלוחות חיבור נמוכים במיוחד עם מדיום ללא סרום, ה- CSCs המעובדים מושרים לבטא סמן פני שטח של תאי גזע שאינו מתבטא בתאי גידול רגילים עם פוטנציאל התמיינות רב-ליניארי ^8,9.

נתונים עדכניים הראו כי ההתמדה של שחלות רדומות (O)CSCs המוצגות כהפצה בצפק קשורה להתחדשותן כגידולים חוזרים¹⁰. הבנת התכונות המולקולריות והביולוגיות של OCSCs עשויה אפוא לאפשר מיקוד יעיל והשמדה של תאים אלה, וכתוצאה מכך הפוגה פוטנציאלית של הגידול. בפרט, מעט מאוד ידוע לגבי התכונות המכניסטיות התאיות והמולקולריות של תפקידי CSCs באנגיוגנזה¹¹. לכן, בפרוטוקול הנוכחי השתמשנו ב-OCSCs שמקורם בחולה במסגרת מבחנה כדי לחקור את התכונה האנגיוגנית של תאי אנדותל באמצעות מודל התרבית המשותפת, שעשוי לחקות את המיקרו-סביבה של תאי CSCs ואנדותל באתר הגרורתי בסביבה הקלינית. בסופו של דבר, מכיוון שניאו-וסקולריזציה מהווה תהליך קריטי הנחוץ לתמיכה בצמיחת הגידול ובגרורות, הבנה טובה יותר של המנגנון שלו תאפשר פיתוח של טיפול מיקוד חדשני עבור OCSCs באתר הגרורתי.

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להמחיש את שלב הניאו-וסקולריזציה סביב ה-CSCs באופן של קורס זמן. היתרון של הפרוטוקול כולל מתן אפשרות למחקרים הניתנים לשחזור מלא באמצעות מערכת התרבית התלת-ממדית, NICO-1, ובכך לאפשר תצפית על ההשפעות על המטופלים של יכולת ייזום הגידול שמקורה ב-OCSC במהלך אנגיוגנזה של תאי אנדותל.

Protocol

כל ההליכים בוצעו על פי הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה לרווחת האדם. כל המטופלים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לשימוש המחקרי בדגימות שלהם, ואיסוף הרקמות והשימוש בהן למחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של מחקר הגנום האנושי, ניתוח גנים באוניברסיטת Teikyo.

1. בידוד ותרבית של תאי גזע מסרטן השחלות (OCSCs) מחולות עם סרטן השחלות ומיימת בארון בטיחות ביולוגית ברמה 2

1. לבודד תאי גזע סרטניים מיימת סרטן השחלות האנושית המתקבלת באמצעות פרסנטזיס. לאסוף לפחות 100-250 מ"ל של מיימת מחולים לקחת מספר מספיק של תאי גזע סרטניים. בנוסף, הערך את פרופילי הביטוי של סמני תאי גזע סרטניים (כלומר, EpCAM, קלרטין, CD133, CD44, CD45, ALDH1 ו- Oct4) וסמני סרטן השחלות (pAX-8, WT-1) על ידי ציטומטריה של זרימה.
   1. צנטריפוגה סרטן השחלות האנושיות מיימת ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתוך 24 שעות לאחר שאיפת מיימת.
   2. הסר את הסופרנטנט והוסף 2 מ"ל של OCSC בינוני ו-8 מ"ל של 30% תמיסת מלח חצובה של היסטודנץ/פוספט (PBS, pH 7.4).
   3. הכנת מדיום OCSC: תוסף תזונה StemPro hESC, DMEM⁄F-12 עם L-גלוטמין (מדיום GlutaMAX), 25% BSA, 100 μM 2-מרקפטואתנול, 8 ננוגרם/מ"ל FGF בסיסי, אינסולין 10 מיקרומטר ו-20 מיקרומטר Y-27632.
   4. שכב בזהירות 2 מ"ל של מדיום OCSC לתמיסת התא בשלב 1.1.2 בצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ברוטור דלי מתנדנד ללא בלימה.
   5. העבר בזהירות את שכבת OCSC (ללא הפרעה באינטרפאזה) לצינור חדש של 15 מ"ל על ידי העברת פיפט.
   6. מלא עם PBS עד 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.
   7. להשעות את גלולת התא במדיום OCSC וזרע על צלחת תרבית חיבור נמוך במיוחד; תרבויות צריך להישמר ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO₂.
   8. שנה את המדיום כל שלושה ימים. בזהירות להעמיד את צלחת התרבית במשך כ 1 דקות, להשליך חלק supernatant ולהוסיף את המדיום החדש.
2. מעבר של CSCs
   1. אסוף OCSCs בצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. מסירים את הסופרנטנט, ממלאים ב-PBS ומניחים צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. הסר את הסופרנטנט, הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק התאים המורכבת מאנזימים פרוטאוליטיים וקולגנוליטיים (למשל, AccuMax), ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   4. מערבבים היטב על ידי פיפטינג ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ודא שהתאים נמצאים בתרחיף יחיד.
   5. מערבבים היטב על ידי פיפטציה, ממלאים ב-PBS וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש את גלולת התא במדיום OCSC לזריעה לאחר מכן על צלחות תרבית בעלות חיבור נמוך במיוחד ותחזוקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂.

2. תרבית תאי אנדותל HUEhT-1

1. מעבר תאי HUEhT-1
   1. הסר מדיום מתבשיל התרבית HUEhT-1 ושטוף את התאים עם PBS.
   2. יש להוסיף 1 מ"ל של 0.025% טריפסין ולדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. הוסף 5 מ"ל של צמיחת תאי אנדותל בינוני 2, אסוף תאים בצינור של 15 מ"ל, וצנטריפוגה בגודל 200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. הסר את הסופרנטנט, השהה את גלולת התא במדיום HUEhT-1, וזרע את התאים על מנות תרבית מצופות קולגן ולאחר מכן תחזוקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂.
   5. שנה את המדיום כל שלושה ימים.

3. הכנת צלחת הקוקולטורה NICO-1 לבדיקת היווצרות צינורות באמצעות תאי HUEhT-1

1. הרכיבו NICO-1 וציפוי עם הידרוג'ל מבוסס מטריצה חוץ-תאית (מטריצת מטריגל).
   1. הרכיבו צד אחד של NICO-1 בהתאם להוראות היצרן ושמרו על קרח.
   2. לכסות את פני השטח של NICO-1 עם 300 μL של PBS קר ולאחר מכן להסיר את המאגר.
   3. יש להוסיף 300 μL של הידרוג'ל מקורר על בסיס מטריצה חוץ-תאית ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 60 דקות.
   4. כדי לאזן את המשקל, טבלו את המסנן עם 100% אתנול, ולאחר מכן שטפו מסנן ICCP בקוטר 13 מ"מ (0.6 מיקרומטר) עם PBS למשך דקה אחת.
   5. הרכיבו את ה-NICO-1 הכולל את שני חלקי הגוף העיקריים A (תא ימני) ו-B (תא שמאלי) יחד עם טבעת O ומסנן שיווי משקל.

4. זריעת תאי HUEhT-1 ותאי CSCs למערכת NICO-1

1. הכן את תרחיף תאי HUEhT-1 על ידי טריפסינזציה של מונו-שכבות התא והחייאת התאים במדיום צמיחת תאי אנדותל עם סרום עגל עוברי 2%.
2. הוסף 1.2 מ"ל של תרחיף התא (1.5 x 10^{5 תאים} ) לכל באר מצופה הידרוג'ל מבוססת מטריצה חוץ-תאית.
3. הוסף 1.5 מ"ל של OCSCs מתורבת במשך חמישה ימים לבאר השנייה.
4. דגירה NICO-1 ב 37 °C ב 5% CO₂; ניתן לצפות בהיווצרות צינורות תחת המיקרוסקופ והיווצרות הרשת על הידרוג'ל מבוסס מטריצה חוץ-תאית הנמדד באמצעות מספר הענפים.

תוצאות

אספנו מיימת נוזלים שהתקבלו מחולות עם סרטן שחלות מתקדם במהלך ניתוח או פרסנטזיס לצורך ביצוע תרבית יציבה לטווח ארוך לספרואידים. כאן, אנו מציגים מקרים של תרבות ספרואידית ארוכת טווח של CSCs בשחלות המכונה CSC1 ו- CSC2. שני קווי התאים נושאים את אותם אבחנה ופרופילים היסטולוגיים. התפקי?...

Discussion

הפרוטוקול המוצג מתאר כיצד לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול של OCSCs בסביבה חוץ-גופית. המרכיב העיקרי של השיטה מהווה את מודל החקלאות הניתן לשחזור ביותר המתקבל באמצעות מערכת NICO-1, מערכת קו-תרבית עקיפה של טרנסוול. רבים ממודלים של קוקולטורה הזמינים כיום בוחנים את ההשפעות של מגע ישיר בין תאים על אוכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025% Trypsin	Thermo	R001100
10 mL Pipet	Thermo	170356N
1250 µL Pipet tip	QSP	T112XLRS-Q
15 mL tube	Nunc	339650
200 µL Pipet tip	QSP	T110RS-NEW
2-Mercaptoethanol	Thermo (Gibco)	21985023
5 mL Pipet	Thermo	170366N
50 mL tube	Corning	430290
AccuMAX	Innovative Cell Technologies	AM105
BioCoatTM Collagen I 60mm Dish	Corning	356401
Centrifuge	KUBOTA	2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3471
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011
Ethanol	WAKO	057-00456
FGF-Basic	Thermo (Gibco)	PHG0021
Histodenz	SIGMA	D2158
HUEhT-1 cell	JCRB Cell Bank	JCRB1458
ICCP Filter 0.6 µm	Ginrei Lab.	2525-06
Insulin, human	SIGMA (Roche)	11376497001
Luminometer	PerkinElmer	ARVO MX-flad
Matrigel Matrix	Corning	356234
Microscope	Yokogawa	CQ-1
NICO-1	Ginrei Lab.	2501-02
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005290
P1000 Pipet	Gilson	F123602
P200 Pipet	Gilson	F123601
PBS	Thermo (Gibco)	14190-144
StemPro hESC SFM	Thermo (Gibco)	A1000701
Transfer Pipet	FALCON	357575
Y-27632	WAKO	253-00513