Bewertung der angiogenetischen Eigenschaften von Stammzellen von Eierstockkrebs mit dem dreidimensionalen Kokultursystem NICO-1

Zusammenfassung

Eierstockkrebs-Stammzellen (OCSC) sind verantwortlich für Krebsentstehung, Rezidiv, therapeutische Resistenz und Metastasen. Es wird angenommen, dass die OCSC-Gefäßnische die Selbsterneuerung von OCSCs fördert, was zu Chemoresistenz führt. Dieses Protokoll bildet die Grundlage für die Etablierung eines reproduzierbaren OCSC-Gefäßnischenmodells in vitro.

Zusammenfassung

Krebsstammzellen (CSCs) befinden sich in einer unterstützenden Nische und bilden eine Mikroumgebung, die aus benachbarten Stromazellen, Gefäßen und extrazellulärer Matrix besteht. Die Fähigkeit von CSCs, an der Entwicklung von Endothel teilzunehmen, stellt ein wichtiges Merkmal dar, das direkt zum allgemeinen Verständnis der Mechanismen der Tumorgenese und Tumormetastasierung beiträgt. Ziel dieser Arbeit ist es, eine reproduzierbare Methodik zu etablieren, um die Tumorinitiationsfähigkeit von Eierstockkrebsstammzellen (OCSCs) zu untersuchen. Hier untersuchten wir den Neovaskularisationsmechanismus zwischen Endothelzellen und OCSCs sowie die morphologischen Veränderungen von Endothelzellen mit dem in vitro Kokulturmodell NICO-1. Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung des Neovaskularisationsschritts, der die OCSCs umgibt. Die Technik kann Aufschluss über die angiogenetischen Eigenschaften von OCSCs bei Tumormetastasen geben.

Einleitung

Eierstockkrebs ist die achthäufigste bösartige Erkrankung bei Frauen weltweit, mit etwa 300.000 neuen Diagnosen und geschätzten 180.000 Todesfällen pro^Jahr1. Bei der Erstdiagnose zeigt sich Eierstockkrebs oft mit schweren Symptomen, wobei sich etwa 75% der Patientinnen bereits im Stadium III-IV befinden. Dementsprechend beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate <30% und die Sterblichkeitsrate ist die höchste bei gynäkologischen Krebserkrankungen², wobei die Effizienz der Behandlung von Eierstockkrebs stark von klinischen Faktoren wie der erfolgreichen Durchführung einer Debulking-Operation, der Resistenz gegen Chemotherapie und dem Wiederauftreten nach der Ersttherapie abhängt.

Eierstockkrebsgewebe sind hierarchisch organisiert, wobei nicht alle Tumorkomponenten gleichermaßen in der Lage sind, Nachkommen zu erzeugen. Die einzigen Zellen, die in der Lage sind, sich selbst zu erneuern und eine heterogene Tumorzellpopulation zu produzieren, gelten als Krebsstammzellen (CSCs)³. Die Selbsterneuerung des CSC und die Tumorinitiierung werden von der Förderung der Angiogenese begleitet, um ihre Tumormikroumgebung umzugestalten, um eine unterstützende Nische zu erhalten. Bisherige Modelle konnten jedoch nicht für In-vitro-Analysen verwendet werden, da die Kultivierung von CSCs aus klinischen Proben aufgrund der Störung von Sphäroiden nach mehrfachem Durchgang nur begrenzt reproduzierbar ist. In jüngerer Zeit wurden experimentelle Methoden zur Kultivierung von CSCs von Patienten für mehrere Anwendungen entwickelt 4,5,6,7. Insbesondere durch die Ausnutzung der Eigenschaft von CSCs, durch Bildung von Sphäroiden in ultraniedrigen Bindungsplatten mit serumfreiem Medium zu wachsen, werden die kultivierten CSCs dazu gebracht, einen Stammzelloberflächenmarker zu exprimieren, der in normalen Tumorzellen mit Multilineage-Differenzierungspotential nicht exprimiert wird ^8,9.

Neuere Daten haben gezeigt, dass die Persistenz ruhender ovarieller (O)CSCs, visualisiert als Verbreitung am Peritoneum, mit ihrer Regeneration als rezidivierende Tumoren assoziiert ist¹⁰. Das Verständnis der molekularen und biologischen Merkmale von OCSCs kann daher eine effektive Ausrichtung und Eradikation dieser Zellen ermöglichen, was zu einer möglichen Tumorremission führt. Insbesondere ist wenig über die zellulären und molekular-mechanistischen Merkmale der CSC-Rollen in der Angiogenese^{bekannt 11}. Daher haben wir im vorliegenden Protokoll patientenabgeleitete OCSCs in einer In-vitro-Umgebung verwendet, um die angiogene Eigenschaft von Endothelzellen unter Verwendung des Kokulturmodells zu untersuchen, das die Tumormikroumgebung von CSCs und Endothelzellen an der metastatischen Stelle im klinischen Umfeld nachahmen kann. Da die Neovaskularisation einen kritischen Prozess darstellt, der zur Unterstützung des Tumorwachstums und der Metastasierung notwendig ist, wird ein besseres Verständnis ihres Mechanismus die Entwicklung einer neuartigen zielgerichteten Therapie für OCSCs an der metastatischen Stelle ermöglichen.

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um den Neovaskularisationsschritt um die CSCs zeitlich zu visualisieren. Der Vorteil des Protokolls besteht darin, vollständig reproduzierbare Untersuchungen mit dem 3D-Kokultursystem NICO-1 zu ermöglichen, wodurch die Auswirkungen der OCSC-abgeleiteten Tumorinitiierungsfähigkeit während der Endothelzellangiogenese auf Patienten beobachtet werden können.

Protokoll

Alle Verfahren wurden gemäß dem Protokoll durchgeführt, das von der Ethikkommission für das Wohlergehen der Menschen genehmigt wurde. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung für die Verwendung ihrer Proben in der Forschung, und die Entnahme und Verwendung von Geweben für diese Studie wurde vom Human Genome, Gene Analysis Research Ethics Committee der Teikyo University genehmigt.

1. Isolierung und Kultur von Eierstockkrebs-Stammzellen (OCSCs) von Patientinnen mit Eierstockkrebs und Aszites in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe 2

1. Isolieren Sie Krebsstammzellen aus humanem Eierstockkrebsaszitese, der durch Parazentese gewonnen wird. Sammeln Sie mindestens 100-250 ml Aszites von Patienten, um eine ausreichende Anzahl von Krebsstammzellen zu entnehmen. Zusätzlich können die Expressionsprofile von Krebsstammzellmarkern (d. H. EpCAM, Calretinin, CD133, CD44, CD45, ALDH1 und Oct4) und Eierstockkrebsmarkern (pAX-8, WT-1) durch Durchflusszytometrie ausgewertet werden.
   1. Zentrifugieren Sie den menschlichen Eierstockkrebs Aszites bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur innerhalb von 24 h nach Aszitesaspiration.
   2. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml OCSC-Medium und 8 ml 30% Histodenz/phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) hinzu.
   3. OCSC-Medium vorbereiten: StemPro hESC-Ergänzung, DMEM⁄F-12 mit L-Glutamin (GlutaMAX-Medium), 25% BSA, 100 μM 2-Mercaptoethanol, 8 ng/mL FGF BASIC, 10 μM Insulin und 20 μM Y-27632.
   4. 2 mL OCSC-Medium werden der Zelllösung in Schritt 1.1.2 vorsichtig in einem 15-ml-Röhrchen überlagert und bei 450 x g 20 min bei Raumtemperatur in einem Schaufelrotor ohne Bremsen zentrifugiert.
   5. Übertragen Sie die OCSC-Schicht (ungestört an der Interphase) vorsichtig in ein neues 15-ml-Röhrchen mittels Transferpipette.
   6. Mit PBS bis zu 15 ml füllen. Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entfernen.
   7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in OCSC-Medium und säen Sie auf einer Kulturschale mit extrem niedriger Bindung; Kulturen sollten bei 37 °C in 5% CO₂ gehalten werden.
   8. Wechseln Sie das Medium alle drei Tage. Stellen Sie die Kulturschale vorsichtig für ca. 1 Minute auf, verwerfen Sie einen Teil des Überstands und fügen Sie das neue Medium hinzu.
2. Verabschiedung von CSCs
   1. OCSCs in einem 15-ml-Röhrchen sammeln und bei 200 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   2. Den Überstand entfernen, mit PBS füllen und bei 200 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   3. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml der Zellablösungslösung aus proteolytischen und kollagenolytischen Enzymen (z. B. AccuMax) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 10 min.
   4. Durch Pipettieren gut mischen und bei 37 °C 5 min inkubieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen in einer einzigen Suspension befinden.
   5. Gut durch Pipettieren mischen, mit PBS füllen und bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in OCSC-Medium für die anschließende Aussaat auf Kulturschalen mit extrem niedriger Bindung und die Wartung bei 37 °C in 5%_CO2.

2. HUEhT-1 Endothelzellkultur

1. Passage von HUEhT-1-Zellen
   1. Entfernen Sie das Medium aus der HUEhT-1-Kulturschale und waschen Sie die Zellen mit PBS.
   2. Fügen Sie 1 ml 0,025% Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 3 min bei Raumtemperatur.
   3. Fügen Sie 5 ml Endothelzellwachstumsmedium 2 hinzu, sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
   4. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in HUEhT-1-Medium und säen Sie die Zellen auf kollagenbeschichteten Kulturschalen, gefolgt von einer Wartung bei 37 °C in 5%_CO2.
   5. Wechseln Sie das Medium alle drei Tage.

3. Vorbereitung der NICO-1 Kokulturplatte für den Röhrchenbildungstest mit HUEhT-1-Zellen

1. NICO-1 zusammensetzen und mit dem extrazellulären Hydrogel auf Matrixbasis (Matrigel-Matrix) beschichten.
   1. Nico-1 auf einer Seite nach den Anweisungen des Herstellers montieren und auf Eis halten.
   2. Decken Sie die Oberfläche von NICO-1 mit 300 μL kaltem PBS ab und entfernen Sie dann den Puffer.
   3. Fügen Sie 300 μL gekühltes Hydrogel auf Basis der extrazellulären Matrix hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 60 min.
   4. Um das Gleichgewicht zu erreichen, tauchen Sie den Filter mit 100% Ethanol ein und waschen Sie dann einen 13 mm ICCP-Filter (0,6 μm) mit PBS für 1 min.
   5. Montieren Sie den NICO-1 einschließlich der beiden Hauptkörperteile A (rechte Kammer) und B (linke Kammer) zusammen mit dem O-Ring und dem ausgeglichenen Filter.

4. Aussaat von HUEhT-1-Zellen und CSCs auf das NICO-1-System

1. Herstellung von HUEhT-1-Zellsuspensionen durch Trypsinisierung der Zellmonoschichten und Resuspendierung der Zellen im Endothelzellwachstumsmedium mit 2% fetalem Kälberserum.
2. Fügen Sie 1,2 ml der Zellsuspension (1,5 x 10⁵ Zellen) zu jeder extrazellulären Matrix-basierten Hydrogel-beschichteten Vertiefung hinzu.
3. Fügen Sie 1,5 ml OCSCs, die fünf Tage lang kultiviert wurden, in die andere Vertiefung hinzu.
4. NICO-1 bei 37 °C in 5%_CO2 inkubieren; Die Tubusbildung kann unter dem Mikroskop beobachtet werden und die Netzwerkbildung auf extrazellulärem Matrix-basiertem Hydrogel, gemessen anhand der Anzahl der Zweige.

Ergebnisse

Wir sammelten Aszitesflüssigkeiten, die von Patienten mit fortgeschrittenem Eierstockkrebs während einer Operation oder Parazentese gewonnen wurden, um eine langzeitstabile Kultur für Sphäroide durchzuführen. Hier stellen wir Fälle einer langfristigen Sphäroidkultur von ovariellen CSCs vor, die als CSC1 und CSC2 bezeichnet werden. Beide Zelllinien tragen die gleichen diagnostischen und histologischen Profile. Die mechanistische Rolle von OCSCs, die der Interaktion mit Endothelzelle...

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt, wie die Tumormikroumgebung von OCSCs in einer In-vitro-Umgebung nachgeahmt werden kann. Die Hauptkomponente der Methode bildet das hochreproduzierbare Kokulturmodell, das mit dem NICO-1-System, einem indirekten Transwell-Kokultursystem, erhalten wurde. Viele der derzeit verfügbaren Kokulturmodelle untersuchen die Auswirkungen eines direkten Zell-Zell-Kontakts auf kokultivierte Zellpopulationen 12,13,14,15,16,17,18.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025% Trypsin	Thermo	R001100
10 mL Pipet	Thermo	170356N
1250 µL Pipet tip	QSP	T112XLRS-Q
15 mL tube	Nunc	339650
200 µL Pipet tip	QSP	T110RS-NEW
2-Mercaptoethanol	Thermo (Gibco)	21985023
5 mL Pipet	Thermo	170366N
50 mL tube	Corning	430290
AccuMAX	Innovative Cell Technologies	AM105
BioCoatTM Collagen I 60mm Dish	Corning	356401
Centrifuge	KUBOTA	2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3471
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011
Ethanol	WAKO	057-00456
FGF-Basic	Thermo (Gibco)	PHG0021
Histodenz	SIGMA	D2158
HUEhT-1 cell	JCRB Cell Bank	JCRB1458
ICCP Filter 0.6 µm	Ginrei Lab.	2525-06
Insulin, human	SIGMA (Roche)	11376497001
Luminometer	PerkinElmer	ARVO MX-flad
Matrigel Matrix	Corning	356234
Microscope	Yokogawa	CQ-1
NICO-1	Ginrei Lab.	2501-02
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005290
P1000 Pipet	Gilson	F123602
P200 Pipet	Gilson	F123601
PBS	Thermo (Gibco)	14190-144
StemPro hESC SFM	Thermo (Gibco)	A1000701
Transfer Pipet	FALCON	357575
Y-27632	WAKO	253-00513